2022, Vol. 43
2. 宁夏大学生态环境学院, 西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地, 银川 750021;
3. 宁夏师范学院化学化工学院, 固原 756000;
4. 宁夏大学地理科学与规划学院, 银川 750021
2. Breeding Base for State Key Laboratory of Land Degradation and Ecological Restoration in Northwestern China, School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;
3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Ningxia Normal University, Guyuan 756000, China;
4. College of Geographical Sciences and Planning, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
抗生素作为一种抗菌药物, 因能防治动物疾病、保障畜禽健康或显著促进动物生长和缩短饲养周期等作用而被广泛应用于畜禽养殖[1].据报道, 中国畜禽养殖业每年使用约8.4×104t抗生素, 占抗生素总使用量的52%[2], 这些抗生素使用后大多以原型或代谢物的形式随粪尿排出体外[3], 致使残留在禽畜粪便中的抗生素浓度普遍较高.当其进入土壤后造成细菌耐药性增强和ARGs加速传播, 对人类和生态造成不同程度的危害[4].世界卫生组织已将抗生素滥用产生的ARGs问题列为本世纪人类健康面临的重大挑战之一[5]. 2016年, 我国卫生计生委等部门联合印发《遏制细菌耐药性国家行动计划》, 以期有效管控抗生素耐药菌和ARGs的产生与传播, 遏制耐药菌的蔓延[6].
粪便是抗生素和ARGs重要的储存库.在畜禽饲养过程中, 涉及的抗生素主要包括四环素类、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类和氨基糖苷类等[7].土耳其学者Karc1等[8]调查了多家不同规模养殖场畜禽粪便中的四环素类、磺胺类及喹诺酮类抗生素残留情况, 发现磺胺类磺胺氯哒嗪和磺胺甲唑含量最高, 分别是35.53 mg ·kg-1和3.76 mg ·kg-1; Martínez-Carballo等[9]的研究测定了澳大利亚猪粪、鸡粪和施用粪肥的农田土壤中典型抗生素的残留情况, 检测到猪粪中四环素类和磺胺类抗生素残留量最高, 鸡粪中喹诺酮类残留量最高.国内张俊华等[10]对宁夏西吉多家养牛场抗生素进行调查, 发现牛粪中四环素类和喹诺酮类抗生素含量最高, 而氨基糖苷类和大环内酯类含量最低; Zhang等[11]的研究对来自全国9个地区的33份动物粪便和17份堆肥样品中的四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类等抗生素进行了分析, 指出所有样品中四环素类抗生素检出率为100%, 其中猪粪的四环素类含量最高, 磺胺类和喹诺酮类含量均较低; 由于畜禽如鸡、牛、猪和鸭等各畜种间生理特性、饲喂状况以及养殖环境的不同, 导致畜禽粪便中不同或相同类型的抗生素种类和浓度存在较大的差异[8~11].同时, 有研究表明, 养殖场的存在可能影响着周边受纳土壤中抗生素及ARGs的多样化程度[12], 施用未经任何处理的畜禽粪便会向农田土壤中引入各类抗生素和ARGs, 且ARGs可能会通过细菌间水平转移机制在粪污外排中进一步移动[13].
近年来, 我国对于畜禽粪便中ARGs所带来的环境问题越来越重视.Wang等[14]的研究在中国东南部某大型集约化畜禽养殖场中主要检测到5大类如四环素类、磺酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类ARGs.Zhu等[15]的研究对中国三省某养猪场猪粪样品中的8大类149个ARGs检测发现, 这些粪便样品ARGs的检出频率比对照样高出192~28 000倍.随着畜禽粪便的直接排放, 耐药细菌的ARGs通过横向转移机制在养殖场周边土壤及各个环境介质中的微生物间迁移转化[16].涂棋[13]的研究发现天津市某养鸡场鸡粪样本中ARGs的平均检出率显著高于养鸡场周边土壤.Jay-Russell等[17]的研究发现施用马和野火鸡粪便后会造成土壤中ARGs和耐药菌群显著增加.与不施用粪肥的农田土相比, 天津市某22家典型家庭农场畜禽粪肥在施用后均使土壤环境中部分ARGs显著增加了8~18倍[18].有研究指出, 土壤介质中ARGs丰度可能与抗生素的残留量和种类直接相关[19, 20].我国南部地区长期施用畜禽粪便的稻田土壤中部分抗生素与相关ARGs丰度间存在显著相关性[21].但也有研究表明, ARGs的相对丰度对部分抗生素浓度无明显响应[22].所以, 不同环境介质中的相同类型或不同类型的抗生素种类和使用量差异可能较大.养殖场周边或施用粪肥土壤中ARGs较对照的多样性及丰度变化如何、ARGs与抗生素浓度是否相关没有一致结论.
宁夏蛋鸡养殖场鸡粪、周边及施用鸡粪的土壤中抗生素及ARGs如何分布？不同养殖期鸡粪中抗生素及ARGs水平是否存在显著差异？干旱地区养鸡场对周边土壤抗生素和ARGs组成有无影响？基于以上问题, 本研究在宁夏蛋鸡养殖最集中的中卫市沙坡头区宣和镇选取了12家不同规模的养鸡场, 采集了养鸡场新鲜鸡粪、周边及施用了鸡粪的土壤3类样品, 从抗生素残留和ARGs谱的角度, 综合分析了各类样品中抗生素和ARGs分布特征, 探明了不同养殖期鸡粪中抗生素含量、组成和ARGs相对丰度, 确定了养鸡场的存在对周边土壤抗生素和ARGs影响程度, 以期为同类地区养鸡场选址、蛋鸡规模化养殖中兽药抗生素种类的选择及用量和鸡粪有机肥的科学施用提供依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理本研究选取位于宁夏宣和镇的典型规模化蛋鸡养殖场12家, 以鸡粪、周边及施用鸡粪的土壤作为研究对象.其中, 所有养殖场规模不同, 大部分养殖数量在30 000~100 000只, 养殖年限有6家在7 a以上, 其中年限最长的是22 a, 6家在3 a左右.养鸡场常用药物包括四环素类(四环素和强力霉素)、氟喹诺酮类(恩诺沙星和诺氟沙星)、β-内酰胺类(阿莫西林)、头孢菌素类和一些中药产品.本研究根据鸡的生长期对所有养殖场育雏期(1~2月, P1)、育成期(2~4月, P2)、初产期(4~6月, P3)、高产期(6~12月, P4)和终产期(12个月以上, P5)未经任何处理的鸡舍中的粪便(鸡粪)进行采集.以同一家养殖场养殖相同时间的鸡粪作为同一处理, 且每个处理取多个点迅速搅拌混匀作为一个样, 同一处理做3个平行, 每个养殖场采集的时期不等, 共采集鸡粪样品29个.
为明确养鸡场对周边土壤抗生素和ARGs的影响程度, 在连续养殖22 a和13 a、卫生条件最差的2户传统小规模养鸡场(养殖规模分别为15 000只和5 000只)西侧排水沟边采集土壤样品.以养殖场为原点, 分别以距其20、50、100、200和300 m(对应编号: D1、D2、D3、D4和D5)处采集表层土壤(0~20 cm)作为周边土壤; 以距离各养殖场5 000 m远近且多年未耕种的废弃土地采集表层土壤作为对照土壤(CK).同期采集养殖场院内长期施用新鲜鸡粪的蔬菜地表层土壤作为施用鸡粪土壤(AP).以五点取样法采集所有土壤样品.所有样品采集后迅速放入保温箱, 带回实验室置于低温冰箱保存, 待测定抗生素含量和ARGs相对丰度.
1.2 抗生素检测采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对鸡粪和土壤中氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类和β-内酰胺酶类这6大类共16种抗生素进行检测.
检测方法如下: 用天平准确称取1.00 g样品于离心管中, 加入EDTA-Mcllvaine缓冲溶液进行抗生素的多次提取, 经超声处理、离心、收集、洗脱、过滤和离心后, 用HLB固相萃取柱初步净化提取液, 最后利用高效液相色谱仪进行测定, 提取和净化步骤详细信息见文献[10].
1.3 DNA的提取按照Fast DNA ® Spin Kit for soil(MP Biomedical, USA)试剂盒说明书操作步骤对样品中微生物总DNA进行提取.提取结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证, 用微量紫外分光光度计(Nanodrop ND1000, USA)检验所提取DNA浓度及相应的纯度.
1.4 抗生素抗性基因的高通量荧光检测采用高通量荧光定量PCR系统(Wafergen SmartChip Real-time PCR Systems, WaferGen公司, US)检测样品中ARGs.在检测过程根据所用的Real-time PCR Systems设置选择了296对引物, 包括各样品中6类ARGs、MGEs和1对16S rRNA内参引物.高通量定量反应具体程序见文献[23].待程序结束后, 根据反应平台仪器性能, 确定并记录循环数(Ct值)的阈值, 根据标准曲线计算各样品中ARGs和MGEs的相对拷贝数, 以16S rRNA基因作为标记基因, 统计各样本中ARGs和MGEs相对丰度[24].
1.5 数据分析采用Excel 2016对抗生素含量、数目及ARGs相对丰度进行处理, 采用Graphpad prism7软件做柱形图和热图, 使用SPSS软件中Pearson相关分析法来研究鸡粪及土壤中抗生素、MGEs和ARGs之间的相关性.
2 结果与讨论 2.1 鸡粪和土壤中抗生素种类和含量 2.1.1 不同养殖期鸡粪中抗生素种类和含量整个养殖期鸡粪抗生素结果检测显示(表 1), 四环素类、氨基糖苷类和磺胺类是鸡粪中的优势抗生素, 其中, 土霉素、金霉素和恩诺沙星检出的最高含量超过10 mg ·kg-1.此外, 还有庆大霉素、新霉素、四环素、强力霉素、环丙沙星和磺胺甲嘧啶含量也均高于100 μg ·kg-1, 而大环内酯类和β-内酰胺类抗生素在鸡粪中均未检出.强力霉素检出率最高, 为80.00%; 林可霉素、氧氟沙星和培氟沙星均未检出.四环素作为畜禽养殖业使用最广泛、畜禽粪便残留量普遍较高的一类抗生素[25], 常在一种粪便样品中能够检测到土霉素或金霉素等多种四环素类抗生素, 且部分粪便样品中残留的抗生素含量已高达mg ·kg-1级[26], 这与本研究鸡粪中检测到的四环素整体情况一致.根据本研究实地调查, 四环素类是本地区养鸡场常用的抗生素, 主要用于防治微生物引起的牲畜肠胃不适、感染和败血症等疾病[27].
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表 1 鸡粪中抗生素含量 Table 1 Contents of antibiotics in poultry manure |
5个养殖期鸡粪中残留的抗生素检测结果如表 2所示.育雏期抗生素种类较多, 且平均含量最高, 其中, 四环素类抗生素平均含量在该养殖期高达18 916.86 μg ·kg-1, 其次是氨基糖苷类(平均值为220.71 μg ·kg-1)和喹诺酮类(平均值为187.54 μg ·kg-1), 其中四环素类抗生素土霉素和金霉素的含量分别高达43 356.13 μg ·kg-1和29 612.65 μg ·kg-1.育成期四环素类(平均值为522.41 μg ·kg-1)和氨基糖苷类抗生素(5.01 μg ·kg-1)含量均显著低于育雏期, 喹诺酮类抗生素并未检测出. 初产期抗生素种类最少, 仅检测到土霉素、金霉素和强力霉素等常见抗生素.高产期和终产期抗生素种类基本一致, 但终产期中的恩诺沙星含量为10 700.00 μg ·kg-1.育雏期鸡粪中抗生素含量较高且种类较多, 可能是处于幼龄期的畜禽免疫力较低, 多种抗生素的联合使用能够加强预防相关疾病的发生, 提高畜禽免疫力[28].有研究指出, 四环素类和氨基糖苷类等药物常被用于畜禽杀菌消炎等方面[29, 30].同时, 广大养殖户为了提高雏鸡成活率, 在动物幼龄期使用了大量的抗生素.随着动物的生长抵抗力逐渐增强, 所需的抗生素减少, 这与本研究不同养殖期鸡粪中各种抗生素含量情况基本一致.不同的是, 蛋鸡养殖终产期鸡粪中恩诺沙星含量较高, 该抗生素在土壤中稳定性强, 具有耐酸碱、耐水解和生物难降解等特性[31].因此, 建议养殖户能够寻找恩诺沙星代替品如中草药饲料和益生菌等减少其用量[32].
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表 2 不同养殖期鸡粪中抗生素含量/μg ·kg-1 Table 2 Contents of antibiotics in poultry manure at different breeding periods /μg ·kg-1 |
2.1.2 养殖场周边及施用鸡粪的土壤中抗生素种类和含量
通过检测所有供试土壤中的抗生素, 发现仅在距离养殖场20 m处及施用鸡粪的土壤中检测到抗生素(表 3).其中距离养殖场20 m处的土壤中仅检测到氨基糖苷类的新霉素及喹诺酮类的培氟沙星, 含量分别为17.60 μg ·kg-1和6.50 μg ·kg-1, 其它距离土壤和对照均未检出任何种类抗生素.有研究指出, 畜禽粪便作为养殖场周边土壤抗生素污染的主要来源之一, 长期积累会导致周边土壤中残留的抗生素水平升高[33], 且会随距离的远近呈现规律性分布[34], 但本结果这种规律性并不明显, 这大概是因为宁夏属于干旱半干旱地区, 常年干旱少雨, 加上养鸡场清理普遍采用干清粪技术, 没有水流的冲涮, 抗生素扩散至养鸡场附近土壤的速率大大降低.此外, 养殖场一般位于远离居民区、比较偏远的地方, 故短时间内养殖场对周边受纳环境中的抗生素组成整体影响较小, 养殖20 a以上且预防措施较差的小型养鸡场对距离20 m处的土壤抗生素含量有影响, 50 m及更远处则基本无影响.
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表 3 养殖场周边和施用鸡粪的土壤中抗生素含量/μg ·kg-1 Table 3 Contents of antibiotics in soils around farms and with poultry manure application /μg ·kg-1 |
在施用鸡粪的土壤中仅喹诺酮类和四环素类抗生素被检出, 其中喹诺酮类抗生素是主要的检出类型, 含量较高, 平均值为78.88 μg ·kg-1, 恩诺沙星(172.20 μg ·kg-1)、环丙沙星(33.20 μg ·kg-1)、氧氟沙星(83.50 μg ·kg-1)和培氟沙星(26.60 μg ·kg-1)在施用鸡粪的土壤中均检出.四环素类抗生素仅土霉素被检出, 含量为57.20 μg ·kg-1.说明直接施用未处理鸡粪会明显增加蔬菜地土壤中的喹诺酮类等抗生素残留量, 加重了土壤抗生素污染.且相关报道指出, 生长在长期施用未经任何处理的有机肥土壤中的蔬菜样品中均不同程度检测到喹诺酮类抗生素, 说明土壤中累积的喹诺酮类抗生素有通过食物链危害人类健康的风险[35].因此, 应加强控制粪肥施入蔬菜田带来的抗生素污染, 降低对人类的危害风险.
2.2 鸡粪和土壤中抗生素抗性基因多样性 2.2.1 不同养殖期鸡粪中抗生素抗性基因多样性整个养殖期鸡粪中共检测到ARGs亚型132~168种, 有74~107种亚型相对丰度大于0.000 5, 主要隶属于氨基糖苷类(23.45%)[图 1(a)]、四环素类(21.60%)、MLSB(16.51%)、多药类(10.93%)和MGEs(7.99%)等.本研究鸡粪中氨基糖苷类、四环素类、MLSB、多药类ARGs和MGEs整体情况与大部分养殖场检测结果相似[10, 14].其中MGEs的种类明显高于β-内酰胺酶类、磺胺类、氯霉素类和万古霉素类ARGs.相关研究指出, MGEs加速了AGRs在细菌间横向转移的频率, 是造成目前ARGs日益污染严重的关键因素[36], 因此, 严禁直接将畜禽粪污施还于农田土壤, 避免造成较大的ARGs生态污染风险.
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图 1 鸡粪及养殖场周边土壤中ARGs种类 Fig. 1 Variety of ARGs in poultry manure and soil |
从检测出的ARGs个数来看, 鸡粪中主导的ARGs是氨基糖苷类, 其次是MLSB和四环素类, 万古霉素类数目最少[图 2(a)].在5个养殖期中鸡粪中均有9类AGRs, 但不同时期中的AGRs数目各不相同.其中, 育成期AGRs数目最多(107个), 然后依次是高产期(96个)、育雏期(95个)、终产期(76个)和初产期(74个).从各类ARGs平均相对丰度看, 鸡粪中MLSB类最高、其次是多药类、氨基糖苷类、四环素类、MGEs、其它和磺胺类等[图 2(b)].育雏期鸡粪中各类ARGs总丰度最高, 终产期最低.不同规模养殖场不同养殖期鸡群的健康状况和体质不同, 用药不同, 因而不同养殖期鸡粪中AGRs的种类和丰度差异较大[37, 38].
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图 2 不同养殖期鸡粪中ARGs与MGEs的数目及相对丰度 Fig. 2 Number and relative abundance of ARGs and MGEs in poultry manure at different breeding periods |
养鸡场周边及施用鸡粪的土壤中共检测到ARGs亚型23~105种, 共有1~23种亚型相对丰度大于0.000 5, 主要由氨基糖苷类(32.73%)、多药类(21.82%)、MGEs(10.91%)、MLSB(9.09%)和四环素类(9.09%)ARGs组成[图 1(b)].其中, 距离养殖场20 m的土样中ARGs数目最多(23个), 其次是50 m处(18个)和施用鸡粪的土壤(6个), 距离养鸡场100 m处(1个)和200 m处(1个)数目最少[图 3(a)].根据土壤ARGs的丰度情况, 发现在距离养殖场20 m处土壤中ARGs总丰度最高[图 3(b)], 其次是距离养殖场50 m处和施用鸡粪的土壤, 对照及距离养殖场300、100和200 m处土壤中ARGs总丰度普遍较低.距离养殖场20 m和50 m土壤中的氨基糖苷类和多药类ARGs起主导作用, 这与本研究鸡粪中的ARGs情况基本一致, 这表明养殖场对周边距离(20 m和50 m)较近土壤的ARGs种类和相对丰度影响较大.有研究也表明, 距离集约化养鸡场越近的土样其ARGs相对丰度显著高于对照及距离较远土壤[13], 与本实验结果一致.但张俊华等[10]发现养牛场的存在对周边土壤中ARGs没有影响, 与本研究结论不同.可能是因为畜禽养殖所用抗生素在鸡粪中的残留情况普遍比牛粪严重[39], 巨大的选择性压力导致鸡粪中细菌耐药性、ARGs污染程度较牛粪中更复杂[40].同时, 本研究周边土壤采集于养鸡场西侧排水沟旁, 养殖产生的粪污长期露天堆放在路边, 约2个月清理一次, ARGs随雨水逐渐进入周边土壤中, 且排水沟附近地下水位较高, 经过近20年, 养殖场粪污ARGs也会随土壤水分运移由近及远逐渐在土壤中富集, 由此造成该结果.但是, 本研究仅距离养殖场20 m和50 m处土壤中ARGs的种类和丰度随距离的增加而减少, 而距离养殖场100、200和300 m处土壤中ARGs并没有随距离远近呈现规律性分布, 这与研究区降雨量少、养殖场粪污属于干清粪有关.施用鸡粪的土壤与距离养殖场50 m处土壤ARGs总相对丰度差异很小, 但同种ARGs间的丰度存在显著差异, 其中, 施用鸡粪的土壤中多药类ARGs占比最大, 其相对丰度比50 m处土壤增高了1.51倍, 而本研究发现施用鸡粪的土壤中喹诺酮类抗生素含量最高, 而氨基糖苷类显著低于距离养殖场近的土壤, 增强了微生物的选择性压力, 使得多重抗性细菌比例增高.
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图 3 养殖场周边及施用鸡粪的土壤中ARGs与MGEs的数目及相对丰度 Fig. 3 Number and relative abundance of ARGs and MGEs in soil around poultry farms and with poultry manure application |
通过绘制热图分析不同养殖期鸡粪中ARGs的丰度水平(图 4), 结果表明, 育雏期鸡粪中相对丰度较高的ARGs有氨基糖苷类aadA- 1-01和aadA-1-02、多药类floR、MLSB类ermF和ermB, MGEs tnpA-05. 育成期丰度较高的有四环素类tetM-01和tetM-02及MLSB类的ermB.初产期MLSB类ermB及四环素类tetM-01和tetM-02相对丰度较高.高产期主要有MLSB类ermF和ermB及四环素类tetM-01和tetM-02 .而终产期各类ARGs和MGEs丰度均明显较低.
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图 4 不同养殖期鸡粪中ARGs与MGEs的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of ARGs and MGEs in poultry manure at different breeding periods |
通过Venn图进一步分析整个养殖期鸡粪中共存的ARGs在不同养殖期间的相互关系[图 5(a)], 共有110种ARGs在所有鸡粪样品中被检出, 主要是氨基糖苷类和四环素类ARGs, 表明动物粪便已成为主要的ARGs来源.仅少数ARGs属于不同养殖期所独有, 在不同养殖期粪污中各类特有ARGs的种类不同, 如育雏期以氨基糖苷类和万古霉素类ARGs较多, 高产期以万古霉素类和MLSB类较多, 而终产期以β-内酰胺类ARGs种类最多.上述结果进一步说明不同养殖场粪污中ARGs分布情况存在差别.
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图 5 鸡粪及养殖场周边土壤中ARGs韦恩图 Fig. 5 Venn diagram of ARGs in poultry manure and soil around poultry farm |
动物粪便作为ARGs储存库可直接输入受纳环境并向周边扩散[13].通过热图发现在距离养鸡场100、200和300 m处及对照土壤中各类ARGs亚型相对丰度均小于0.006(图 6), 在距离养鸡场20 m和50 m及施用鸡粪的土壤中丰度较高且常见的有: mexF、intI-1(clinic)、tnpA-04、qacEdelta1-01、qacEdelta1-02 和sul2 .有研究表明距离养鸡场较近土样中的ARGs丰度明显高于距离较远土样[13], 与本研究的结果基本一致.距离养鸡场20 m处土壤中mexF、intI-1(clinic)和tnpA-04 亚型相对丰度较高, 这3个亚型在鸡粪中也有较高丰度, 进一步说明该距离处ARGs很有可能是养鸡场影响的.施用鸡粪的土壤中mexF和sul2 亚型的丰度较其它基因显著增高.目前结果统计表明, 周边土壤在直接与畜禽粪便接触或施用粪便后均能明显提高其抗生素残留水平[41], 增强土壤中耐药菌对抗生素的抵抗能力, 加速诱导ARGs的产生, 而本实验距离养鸡场20 m处及施用鸡粪的土壤中抗生素来源相同而ARGs不同, 可能是施用过鸡粪的土壤中抗生素残留水平、人为管理、种植蔬菜和土壤性质的不同造成的.其中, Ⅰ类整合子(intI 1 )作为捕获和整合ARGs的可移动遗传因子, 广泛分布于畜禽粪便、土壤和水体等自然环境中[42]; tnpA- 04 转座酶类可移动元件相对丰度也较高, 表明距离养鸡场20 m处土壤中整合子和转座子显著富集, 加剧了土壤ARGs横向迁移的潜在风险.所以, 这也是距离养鸡场20 m的土壤中相对丰度远高于其它土壤的主要原因.而施用鸡粪的土壤中mexF和sul2 丰度较高, Byrne-Bailey等[43]的研究指出, 施用猪粪肥的农业土壤可普遍提高微生物对磺胺类抗生素的抗性, 同时土壤中存在较高丰度的sul1 和sul2 , 可能是因为磺胺类抗生素产量大、价格低、供应充足, 是全球畜禽养殖行业中经常使用的抗生素种类之一.
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图 6 土壤中ARGs与MGEs的相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of ARGs and MGEs in different soils |
为了便于分析, 将受养鸡场影响较小、距离养鸡场较远的200 m和300 m处土壤样本舍去, 以对照、距离养鸡场20、50和100 m处及施用鸡粪的土壤构建Venn图[图 5(b)], 发现这5个土壤中共有ARGs 1个, 是氨基糖苷类的aacC.此外, 距离养鸡场20 m和50 m处的土壤中共存ARGs 20个, 主要是氨基糖苷、β-内酰胺类和MLSB; 距离养鸡场20、50和100 m处的土壤中共存ARGs 3个, 分别是blaCMY 2-02、aac(6′)-Ib(aka aacA4)-03 和ermF.由于距离养鸡场100 m处、对照和施用粪污土壤中的ARGs种类相对较少, 因此本实验土壤共有的ARGs仅1种.
2.4 鸡粪及土壤中抗生素抗性机制比较分析所有鸡粪中抗生素抗性机制, 发现细胞保护和抗生素失活机制占比较大, 是鸡粪中关键的抗性机制[图 7(a)], 但养殖期不同其抗性机制相对丰度存在较大差异.与其它养殖期相比, 育成期抗生素失活相对丰度较高, 而细胞保护的相对丰度较低; 初产期则细胞保护抗性机制相对丰度较高, 抗生素失活相对丰度较低.不同养殖期抗生素抗性机制的差异亦表征了携带ARGs的耐药微生物间的差异[44].耐药菌中某些ARGs能够编码一种或多种功能的酶或蛋白提高自身对环境中多种抗生素的抵抗能力, 如外排泵机制将进入细胞的抗生素或重金属等毒性物质迅速泵出胞外[45], 细胞保护机制通过产生保护蛋白引起核糖体构型发生改变, 从而产生自我保护机制使耐药菌免受抗生素等物质的毒害.有研究表明, 动物粪便中的抗生素对耐药菌具有选择性压力, 可以诱导ARGs产生[23].而5个养殖期鸡粪中的抗生素组成存有差异, 所以, 各个养殖期的抗生素抗性机制相对丰度均不相同.
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(a)鸡粪; (b)土壤 图 7 鸡粪和土壤中抗生素抗性机制分析 Fig. 7 Mechanism analysis of antibiotic resistance of poultry manure and soil |
周边及施用粪污土壤中的抗生素抗性机制种类及所占比例差异较大[图 7(b)]: 对照、在距离养鸡场20、50和200 m及施用粪污的土壤中有4种抗性机制, 其它2个距离处土壤中没有未知机制.距离养鸡场100、200和300 m处的土壤中抗生素失活及外排泵占比较大, 是主要的抗性机制; 但距离养鸡场20 m处和施用粪污的土壤中仅外排泵占比超过60%, 是主要的抗性机制.其中, 外排泵机制是革兰氏阳性菌和阴性菌中最主要的一类抗性机制之一, 在四环素类ARGs中大约有60%的基因属于外排泵机制类.如tetA、tetY和tetZ等基因能够编码相关外排泵蛋白, 将四环素泵到细胞外, 减少胞内四环素含量及对自身的毒害[46], 而其它类型抗生素的原理也类似.同时有报道指出, 编码外排泵蛋白基因常位于MGEs如转座子、整合子和质粒等上, 并常与其它ARGs相连, 这些基因的出现大大增加了微生物的多重耐药性.一旦致病菌将多重耐药基因整合在自身的基因组上, 则可能会通过食物链传递到人体内[47], 对肠道微生态、人体健康构成威胁.由此推断, 本研究中距离养鸡场20 m处及施用鸡粪的土壤中ARGs的污染风险较高.
2.5 鸡粪和土壤中抗性基因与可移动元件相对丰度的相关性采用Pearson相关分析法分别对鸡粪和土壤中的ARGs与MGEs进行分析(表 4).其中鸡粪中β-内酰胺酶类与MGEs、氨基糖苷类、MLSB类和ARGs相对丰度总和与MGEs分别呈极显著(P＜0.01)、显著(P＜0.05)正相关性.在土壤样品中氯霉素类和ARGs相对丰度总和分别与MGEs呈极显著(P＜0.01)、显著正相关性(P＜0.05).已有研究发现养殖场粪污和周边土壤中ARGs均与MGEs(整合子和转座子)存在显著或极显著的正相关性[10].在本研究中氨基糖苷类、β-内酰胺酶类、MLSB类和氯霉素类ARGs与MGEs之间的显著或极显著正相关性以及鸡粪、土壤样品中较高丰度的MGEs, 均表明养殖场鸡粪和土壤中ARGs发生水平迁移的可能性较高, 进一步表明了MGEs是加剧这些ARGs在养殖场环境中迁移转化的主要因素.
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表 4 鸡粪和土壤中ARGs与MGEs的相关性1) Table 4 Correlation analysis between ARGs and MGEs in poultry manure and soil |
2.6 鸡粪中抗生素含量与抗生素抗性基因相对丰度间的相关性
养殖场抗生素的大量使用对ARGs的发生和扩散起重要的促进作用.采用Pearson相关分析法得到鸡粪中氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、β-内酰胺酶类和MLSB类抗生素含量与对应ARGs丰度的相关系数依次为: 0.711、-0.540、0.589、0和0, 均未达显著水平.Tang等[21]对农田土壤和养殖场粪污的研究发现, 氨基糖苷类和四环素类等抗生素含量均和其对应ARGs丰度间存在极显著相关关系, 张俊华等[10]对西吉养殖场牛粪的研究也发现了同样的结果.而Ji等[48]研究上海某大型动物养殖场粪便及周边农田土壤中ARGs指出: 大部分ARGs丰度对其相应的抗生素含量间没有强烈响应.以上不同研究结果表明, 抗生素可以影响ARGs分布, 但抗生素含量并不是影响ARGs传播扩散的唯一因素[22], 其它环境因素可能也会影响ARGs的组成和传播.
土壤中仅检测到喹诺酮类和少量的四环素类抗生素, 大部分抗生素未能检出, 故此处没有对土壤中抗生素浓度与其对应的ARGs丰度间的相关性研究.
2.7 鸡粪和土壤中抗生素抗性基因相对丰度之间的相关性鸡粪中ARGs相关性分析的结果如表 5所示. 氨基糖苷类ARGs相对丰度与β-内酰胺酶类和MGEs; 多药类与万古霉素类; β-内酰胺酶类与MLSB类和MGEs; MLSB类与MGEs均呈现显著正相关(P＜0.05); 四环素类、万古霉素类和磺胺类ARGs相对丰度与其它种类ARGs均不相关.土壤中相关性分析结果表明, 氨基糖苷类ARGs相对丰度与四环素类、万古霉素类、磺胺类和MLSB类; 四环素类与MLSB类; 万古霉素类与磺胺类和MLSB类; 磺胺类与MLSB类和MGEs与氯霉素类均呈极显著正相关(P＜0.01); 而多药类和β-内酰胺酶类ARGs相对丰度与其他类ARGs均不相关.
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表 5 鸡粪和土壤中ARGs间的相关性 Table 5 Correlation analysis between ARGs and ARGs in poultry manure and soil |
有研究指出, 不同类型ARGs间显著的正相关性亦反映出这些ARGs可能共现在相同的MGEs上[49], 自然界中累积的抗生素对ARGs的富集具有选择压力, 能同时促进其对应的和其它种类的ARGs水平提高[15].在本研究中无论是鸡粪还是土壤样本中并未检测到β-内酰胺类抗生素, 但其对应的ARGs均以不同的丰度出现在样本中, 进一步表明β-内酰胺类ARGs可能与抗生素的共选择作用有关.已发现类似的研究现象, 如美国某实验室在高控制环境下研究了在猪饲料中外源添加金霉素(100 g ·t-1)、磺胺甲嘧啶(100 g ·t-1)和青霉素(50 g ·t-1)这3种混合抗生素对猪肠道内ARGs的影响, 发现施用抗生素组中氨基糖苷类ARGs丰度较对照组增加了近100倍[50]; Zhu等[15]研究中国某三省大型集约化养猪场附近长期施用堆肥的农田土壤中ARGs的多样性, 发现未使用任何含有氨基糖苷类产品的猪粪样品中检测到较高丰度的氨基糖苷类ARGs, 其丰度是未添加组的10 000倍.涂棋[13]的研究指出, 土壤生境中相关环境因子可能对ARGs起到共选择作用.而本研究土壤中各类ARGs间的正相关性明显强于鸡粪中, 该结果可能是由于土壤生境比鸡粪的更复杂多样导致的.
3 结论(1) 养殖场鸡粪中四环素类、氨基糖苷类和磺胺类为主要抗生素, 育雏期抗生素含量较高, 初产期最低.鸡粪中氨基糖苷类ARGs数目最多.育成期AGRs数目最多、初产期最低.
(2) 距离养鸡场最近的土壤中抗生素含量明显较高.施用鸡粪可以显著提高土壤中的喹诺酮类抗生素含量.随着距养殖场距离的增加, 养殖场周边土壤中ARGs数目和种类都逐渐减少; 施用鸡粪的土壤与距离养殖场50 m处土壤中的ARGs种类和总相对丰度相当.
(3) 鸡粪中抗生素的作用机制主要是细胞保护和抗生素失活, 育成期抗生素失活机制相对丰度较高, 细胞保护机制相对丰度较低, 初产期相反.距离养鸡场20 m及施用鸡粪的土壤中外排泵占比较大.
(4) 鸡粪中β-内酰胺酶类、氨基糖苷类和MLSB类ARGs都存在水平移动风险; 土壤中氯霉素类ARGs存在水平移动风险.鸡粪中抗生素残留量并不是导致ARGs迁移转化的唯一因素.土壤中各类ARGs之间的共现性明显强于鸡粪.
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