2022, Vol. 43
2. 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室, 北京 100085
2. State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
早在1943年, 青霉素就被引入临床治疗.到目前为止, 已有数千种抗生素被应用于医疗、水产养殖和动植物生产等领域.然而, 由于抗生素的不合理应用导致的细菌耐药性增强和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)加速传播日益严重[1].全球因微生物耐药性引起的健康问题, 导致每年需要花费大约1万亿欧元支出[2].预测到2050年, 每年因耐药性微生物感染致死的人数将达上千万人[3]. 2006年Pruden等[4]的研究第一次将ARGs作为新型环境污染物提出之后, 许多学者在医疗废水[5]、养殖废水[6, 7]、污水处理厂[8~10]、地下水[11]、河流海洋[12]、地表水[13]、沉积物[14~16]、土壤[17~20]和空气中[21, 22]都检测到ARGs的存在, 而一旦含有ARGs的菌群成为优势菌种, 将对当地生态环境安全和人类健康造成极大的危害.
土壤中含有种类丰富的微生物, 也是ARGs巨大的储存库, 研究者们从远离人类活动干扰的北极、阿拉斯加冻土中提取到的DNA中发现存在对β-内酰胺类、四环素类、糖肽类和氯霉素类等抗性的基因[23~25], 说明ARGs存在于原始的自然环境中.林岚等[15]的研究通过分析西太平洋深海和黄海沉积物中抗性基因含量的差别, 发现人类活动导致的环境变化会使微生物在面对环境选择压力时能够产生耐受性, 加速ARGs的传播.
抗生素是环境抗生素抗性的选择压力已经成为普遍共识[26], 而重金属近年来也作为环境微生物抗生素抗性选择压力而被大量研究.有研究表明, 土壤中的重金属Cu会提高大环内酯类抗性基因[27]、四环素类抗性基因和万古霉素抗性基因[28]的丰度, 土壤中Zn和Cu的累积可能导致磺胺类与四环素类抗性基因的丰度增加[29].基因水平转移是ARGs在环境中传播扩散的重要机制[30], 可移动的基因元件可通过接合、转化和转导等方式将ARGs从一株菌转移到另一株菌中, 从而使后者获得抗性.矿区环境受到采矿活动影响, 重金属污染较严重, 目前针对矿区土壤环境ARGs的相关研究还比较少, 本研究通过高通量荧光定量PCR(HT-qPCR)技术, 对亚洲最大露天铜矿——江西省德兴铜矿周边土壤和沉积物环境中ARGs和可移动元件(mobile genetic elements, MGEs)的种类和丰度进行分析, 并探究环境重金属和MGEs对检出抗性基因种类和丰度的影响.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况德兴铜矿位于江西省上饶市德兴市信江流域乐安河附近, 是亚洲最大的铜矿之一[31], 也是第一大伴生金矿和伴生银矿, 目前生产规模为处理矿石10万t ·d-1.德兴市素有“铜都”、“银城”和“金山”之称.自唐、宋以来, 德兴铜矿区域就开始了铜矿开采, 粗放式开采导致整个区域内零星遍布了数以百万方计的历史遗留酸性废渣和逾千个废弃矿洞[32].
1.2 样品采集2019年6月, 在江西省德兴市德兴铜矿区设置7个采样点, 编号1~7, 7个采样点布设如表 1和图 1所示.每个采样点采集表层(0~10 cm)土壤1 kg, 装入灭菌塑料袋, 放置低温箱带回实验室进行下一步处理.
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表 1 德兴铜矿区土壤/沉积物采样点情况 Table 1 Soil/sediment sampling sites of Dexing copper mine |
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图 1 德兴铜矿区采样点分布示意 Fig. 1 Map of sampling sites of Dexing copper mine |
称取土壤或沉积物样品0.5 g, 浓硝酸-浓盐酸-氢氟酸-高氯酸消解后, Pb和Cd用石墨炉进行测定, Cu和Zn用火焰原子吸收分光光度法进行测定.
1.4 DNA提取将采回土样充分混匀并除去土壤中的植物根系和砾石, 每个编号取2个平行样, -80℃下保存至DNA提取.使用FastDNA® SPIN kit for Soil试剂盒(MP Biomedical, 美国)提取总DNA, 实际操作参照试剂盒内说明书, 提取的DNA采用Nano Drop 2000(Thermo)进行检测.DNA样品于-20℃下保存备用.
1.5 ARGs测定利用Wafergen SmartChip实时PCR系统(Wafergen, Fremont, CA), 采用HT-qPCR方法, 检测各样品中的ARGs, 使用了296对引物, 包括283个ARGs、12个MGEs和1个16S rRNA基因.HT-qPCR实验操作和相对基因拷贝数计算方法等见文献[10].将每个ARGs的相对基因拷贝数分别除以16S rRNA基因的相对基因拷贝数, 得到每个ARGs的相对丰度.
1.6 数据分析处理HT-qPCR数据时, 利用OriginPro 2017进行ANOVA分析、Pearson相关性分析和热图分析(Heatmap), 利用Rstudio软件进行冗余分析(RDA).
2 结果与分析 2.1 重金属检出含量样品中4种被测重金属含量见表 2和图 2. 7个采样点中, Zn、Cu、Cd和Pb均有超背景值的点位.其中, 6号点位ω(Zn)、ω(Cu)和ω(Cd)均为各点位最大值, 分别为83.73、630.50和1.54 mg ·kg-1, ω(Pb)也很高, 仅次于5号采样点的样品, 为36.3 mg ·kg-1; 6、3和7号采样点ω(Cu)分别达到630.50、506.58和440.99 mg ·kg-1, 分别超背景值的31、25和22倍. 6号采样点为大坞河入乐安河口沉积物, 3号采样点为大坞河沉积物, 7号采样点为德兴铜矿尾矿库尾沙, 德兴铜矿区这些采样点位的Cu含量远超背景值, 说明人为采矿活动加剧了土壤中重金属Cu的污染程度, 德兴铜矿区的重金属Cu污染不容忽视.
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表 2 德兴铜矿区土壤/沉积物指标检测结果1)/mg ·kg-1 Table 2 Heavy metal contents of Dexing copper mine sampling sites/mg ·kg-1 |
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横坐标数字表示采样点; 不同小写字母表示采样点间差异显著(P < 0.05) 图 2 德兴铜矿区土壤重金属指标检测结果 Fig. 2 Heavy metal contents of Dexing copper mine sampling sites |
德兴铜矿7个采样点中, 共检测到9类主要类型的ARGs, 包括氨基糖苷类(aminoglycosides)、β-内酰胺类(β-lactamases)、喹诺酮类氯霉素类(FCA)、大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B抗性基因(MLSB)、多重耐药类(multidrug)、磺胺类(sulfonamide)、四环素类(tetracycline)、万古霉素类(vancomycin)和其他类(others).各采样点ARGs检出种类数分别为21、13、66、15.5、52.5、70和23, 均值为37, 检出数量显著高于其他点位的是6、3和5(P < 0.05, 图 3). 6号采样点为大坞河入乐安河口沉积物, 3号采样点为大坞河沉积物, 5号采样点为德兴铜矿住宅小区土壤. 6和3号采样点检出数量相对较高, 可能与样品中Cu含量较高有关.
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不同小写字母表示采样点间差异显著(P < 0.05) 图 3 德兴铜矿样品中检测到的ARGs种类数 Fig. 3 Number of ARGs detected in Dexing copper mine sampling sites |
对德兴铜矿中ARGs的相对丰度水平进行分析(图 4), 结果表明, 各样点中ARGs相对丰度范围为0.3×10-2~8.5×10-2, 其中6号采样点的ARGs相对丰度显著高于其他点位(P < 0.05), 其相对丰度达到8.5×10-2, 其次是4、5和3号采样点, 其相对丰度分别为5.5×10-2、4.8×10-2和4.3×10-2.
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不同小写字母表示采样点间差异显著(P < 0.05) 图 4 德兴铜矿样品中ARGs相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of ARGs in Dexing copper mine sampling sites |
从ARGs对应的抗生素来看, 德兴铜矿区检出的ARGs主要类别为多重耐药类、MLSB、β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类抗性基因(图 5).从ARGs所对应的抗性机制来看, 外排泵为主要的抗性机制, 其次是抗生素失活机制(图 6).
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图 5 德兴铜矿样品中检测到的各类ARGs所占比例 Fig. 5 Proportion of various types of ARGs detected in Dexing copper mine sampling sites |
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图 6 德兴铜矿样品中检测到的各类ARGs所占比例 Fig. 6 Proportion of various types of ARGs detected in Dexing copper mine sampling sites |
基于德兴铜矿土壤中ARGs的组成和丰度, 经热图分析可以很好地展示ARGs组成差异与分布(图 7).由图 7可以看出, ARGs丰度最高的3个采样点分别是6号(大坞河入乐安河口沉积物)、5号(德兴铜矿住宅小区土壤)和3号(大坞河沉积物). 6号采样点中氨基糖苷类、β-内酰胺酶类、MLSB、磺胺类、四环素类抗性基因的相对丰度都较高, 5号采样点中氨基糖苷类、β-内酰胺类和万古霉素类的抗性基因相对丰度较高, 3号采样点中多重耐药类抗性基因相对丰度较高.
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图 7 德兴铜矿采样点ARGs分布热图 Fig. 7 Heatmap of ARGs of Dexing copper mine sampling sites |
德兴铜矿各采样点MGEs检出相对丰度如图 8所示.从中可知, 各采样点中6号采样点MGEs相对丰度显著高于其他点位, 其次是5和3采样点.各采样点MGEs相对丰度与ARGs相对丰度检出规律基本一致.MGEs与ARGs检出丰度的Pearson相关性分析见表 3.从中可知, MGEs总丰度与ARGs总丰度显著正相关(P < 0.05), 其Pearson相关系数r为0.79.其中, 磺胺类、MLSB和四环素类这3类抗性基因与MGEs丰度呈极显著相关关系(P < 0.01), 提示这3类ARGs的丰度可能与MGEs介导的水平基因转移密切相关.同时, 部分抗性基因类别之间也存在极显著的相关关系(P < 0.01), 包括β-内酰胺类和氨基糖苷类(r=0.94), 磺胺类和MLSB(r=0.99), 四环素类和MLSB(r=0.95), 磺胺类和四环素类(r=0.95).
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采样点1的相对丰度为0; 不同小写字母表示采样点间差异显著(P < 0.05) 图 8 德兴铜矿采样点MGEs相对检出丰度 Fig. 8 Relative abundance of MGEs in Dexing copper mine sampling sites |
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表 3 MGEs与ARGs检出丰度的Pearson相关性分析1) Table 3 Pearson correlation analysis between concentrations of ARGs and MGEs |
本研究中共检出12种MGEs, 其组成比例如图 9所示.从中可知, 占比最高的MGEs为TnpA 04, 占比47%, 其次为Inti 1占比26%.
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1. Inti 1(clinic), 2. Inti 1LC, 3. Inti 2(占比为0), 4. Inti 3, 5. IS 613, 6. TnpA 01, 7. TnpA 02, 8. TnpA 03, 9. TnpA 04, 10. TnpA 05, 11. TnpA 07, 12. Tp 614 图 9 德兴铜矿MGEs组成 Fig. 9 MGEs composition of Dexing copper mine sampling sites |
对德兴铜矿采样点各重金属浓度与ARGs检出丰度和种类进行Pearson相关性分析, 结果见表 4.从中可知, 重金属Cu含量与ARGs的检出种类数呈显著正相关(P < 0.05), Pearson相关系数达0.79.
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表 4 重金属含量与ARGs检出种类和丰度的Pearson相关性分析1) Table 4 Pearson correlation analysis between ARGs and heavy metals |
进一步对德兴铜矿采样点ARGs相对丰度与4种重金属含量进行RDA分析.结果表明, RDA1与RDA2两个排序轴的解释度分别为44.05%和38.37%, 累积解释度达到82.42%. 4种重金属中, 只有Cu对ARGs的检出丰度表现出显著影响(P < 0.05, 图 10).德兴铜矿采样点主要检出的ARGs类型中, 氨基糖苷类和磺胺类与Cu含量呈正相关性.采样点3、5和6号与重金属Cu和Cd含量呈正相关性.
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1~7表示采样点 图 10 ARGs相对丰度与重金属含量的RDA分析 Fig. 10 Redundancy analysis (RDA) of the relative abundance of ARGs and heavy metals |
本研究采用HT-qPCR对德兴铜矿周边土壤和沉积物中ARGs进行了检测与定量分析.从ARGs的检出种类来看, 共检出70种ARGs, 这与在绵阳市的紫土丘陵区畜禽养殖土壤检出79种ARGs种类结果相似[19], 高于沈阳蔬菜地土壤中检测出的21种抗性基因[17], 但低于福建省岩市境内山谷型尾矿库水体中检测的106种ARGs[33].
在抗性基因相对丰度方面, 本研究中德兴铜矿ARGs相对丰度介于0.3×10-2~8.5×10-2, 全球土壤ARGs的相对丰度水平约在10-7~10-2[34], 由此可见德兴铜矿的ARGs相对丰度属于较高水平, 与沈阳[17]和北京[18]蔬菜地土壤因过度施肥以及抗生素残留土壤中的ARGs相对丰度结果类似, 说明土壤中Cu含量升高也可能导致ARGs相对丰度升高.由图 3和图 4可以看出, 6号采样点的ARGs种类和相对丰度最高, 其次是3号采样点, 这两个采样点与其他采样点不同, 他们汇集了大坞河旁德兴铜矿采矿场的排水, 可能形成了一个重金属元素高并含有复杂成分的采矿工艺废液沉积的土壤环境, 进而影响了土壤中微生物的分布与结构, 从而导致了ARGs种类和丰度的增加, 4和5号采样点为人口活动密集点, 分别位于中学附近和住宅小区, 其土壤ARGs的丰度仅次于6号采样点, 这可能是由于人类活动和上游铜矿排水的共同影响, 导致抗生素抗性基因的丰度提高.Ji等[35]对上海养殖场畜禽粪便和周围土壤抗生素抗性基因研究表明, 重金属Cu与人类活动都有可能通过改变土壤微生物的多样性, 从而影响土壤中抗生素抗性基因的种类和丰度.
本研究中, ARGs与MGEs丰度呈显著正相关(表 3), 这与Ma等[36]的研究通过高通量测序技术和宏基因组学分析不同生态系统中ARGs与MEGs丰度之间相关性得出的结论相似.由图 9可知, 转座酶基因TnpA 04和一类整合子基因Inti 1是德兴铜矿最主要的2种MGEs, 而TnpA 04基因和Inti 1基因是常见的可能参与基因水平转移的一类MGEs, 这与乌鲁木齐公园土壤MGEs的研究结果类似[37], 说明TnpA 04基因和Inti 1基因有可能参与了ARGs的传播扩散.有研究表明, 一类整合子的Inti 1基因与磺胺类[38, 39]和四环素类[40]等多种抗性基因存在相关性, 本研究中磺胺类、四环素类和MLSB这3类抗性基因与MEGs丰度呈极显著相关关系(P < 0.01), 由此可以推测, 水平基因转移可能是采样区磺胺类、四环素类和MLSB等3类抗性基因传播扩散的重要机制.
土壤成分复杂而多样, 作为重金属和ARGs的储存库, 土壤重金属可以综合多种土壤环境因子(如营养盐含量和pH值等)共同影响土壤中微生物群落结构, 从而影响ARGs种类和丰度.有研究表明, 在污水处理厂周边土壤[8, 9]和养殖厂沉积物[7]等土壤环境中, 重金属含量与ARGs丰度存在极显著的相关性, 说明重金属污染可能是影响ARGs丰度的一个主要原因.He等[39]通过研究养鸡场粪便、土壤、沉积物和水样中ARGs的含量与重金属环境参数的关系, 间接揭示了重金属对ARGs的存在和分布起到联合筛选作用.Zhao等[7]的研究通过分析黄河三角洲沉积物中ARGs与沉积物中重金属和养分的关系, 直接证实了营养物和重金属的协同筛选对海水养殖沉积物中ARGs动力学变化起到重要作用.黄福义等[33]对尾矿水体环境中ARGs污染研究发现, Cu、TOC和MGEs对尾矿库水体环境抗生素抗性基因的赋存和演变可能具有重要作用.Cu是德兴采矿区土壤和沉积物中高富集重金属元素, 重金属Cu含量与ARGs检出种类和丰度均呈显著正相关关系, 提示德兴铜矿区Cu的高含量存在可能是该区域抗生素抗性基因形成的重要驱动因子.
重金属对ARGs的影响机制主要分为4大类, 即协同抗性、交叉抗性、共调控和生物膜反应[41].有研究表明, Cu、Cd、Pb和Zn这4种重金属, 会促进淡水细菌中的RP4质粒的结合转移[42], 而该质粒包含多种耐药性基因, 包括氨苄青霉素耐药基因、卡那霉素耐药基因和四环素耐药性基因.重金属Cu可以破坏细菌细胞膜从而促进质粒DNA通过菌膜, 促使ARGs在细胞间传播.不同的重金属离子还会导致细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成和细胞膜通透性的增强, ROS响应以及改变共轭转移和调节基因mRNA的表达, 从而促进抗性基因的共轭转移[43~46].
4 结论(1) 德兴铜矿区土壤/沉积物环境中存在着种类较丰富和丰度水平较高的ARGs, 大坞河入乐安河口和富家坞采矿场大坞河两个采样点检测的ARGs种类和丰度都最高, 德兴铜矿区检出的ARGs主要类别为多重耐药类、MLSB、β-内酰胺类、四环素类和氨基糖苷类抗性基因, 外排泵为主要的抗性机制, 其次是抗生素失活机制.
(2) Pearson相关性分析和RDA分析表明, 重金属Cu含量与ARGs检出种类和丰度均呈显著正相关关系(P < 0.05), 提示德兴铜矿区Cu的高含量存在可能是该区域抗生素抗性基因形成的重要驱动因子.
(3) 德兴铜矿各采样点共检测了12种MEGs, 其中TnpA 04和Inti 1是德兴铜矿最主要的MEGs, ARGs与MGEs丰度呈显著正相关(P < 0.05), 推测水平基因转移是采样区环境ARGs产生的重要机制.
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