2022, Vol. 43
2. 南开大学环境科学与工程学院, 天津 300350;
3. 最高人民检察院检察技术信息研究中心, 北京 100144
2. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300350, China;
3. Procuratoral Technology and Information Research Center, Supreme People's Procuratorate, Beijing 100144, China
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是环境中广泛存在的一类典型持久性有机污染物, 因其大多具有致癌、致畸和致突变等毒理效应, 被国际公认为应优先控制的有机污染物[1, 2].土壤是PAHs的汇, 也是源[3].国内外大量农田和工业场地土壤中检出了不同程度的PAHs污染[4, 5].修复PAHs污染土壤, 管控污染风险, 对于保障土壤生态环境和人居环境安全具有重要的现实意义.植物修复技术是近年来最具潜力的有机污染土壤修复技术之一, 具备可操作性强、成本低廉和环境友好等优点[6].在植物修复过程中, 相比于植物自身对土壤中PAHs的吸收和积累, 根系分泌物的存在发挥了更为关键的作用[7~9], 其所营造的根际微环境是有机污染物有效性和毒性得以快速消减的重要原因.
根系分泌物是植物与根际微生物相互作用的中间媒介, 其不仅为根际微生物提供主要碳源和能源, 而且不同植物根系分泌物的种类和数量也影响根际微生物种群的结构及数量, 塑造出有独特性与代表性的微生物群落[10, 11].根系分泌物种类繁多, 已鉴定的约有200多种.植物根系分泌物会对污染物胁迫产生响应[12], 修复过程中污染物种类和浓度的变化影响着根系分泌物的组分和浓度, 且根系分泌物随着离根系距离的增加呈浓度递减效应, 这使得根际土壤微生物群落具备时空的多样性.Miao等[13]的研究表明, PAHs的去除与土壤微生物群落结构动态变化相关.Jiao等[14]的研究发现豆科植物根际土细菌群落的β多样性对预测菲的降解速率具有重要作用, 越复杂的细菌群落表现出越高的PAHs降解能力.目前学者们对植物根际修复过程及效果进行了较深入地研究[15~17], 但根系分泌物自身的作用被嵌合在复杂的根际效应中不易剥离分析; 并且受植物种类、环境条件、土壤性质、采样时间和采样点根际距离等因素影响, 目前针对根系分泌物自身对有机污染土壤微生物群落的影响效应的研究不便直接比较.因此, 有必要研究确定组分和浓度的根系分泌物对PAHs污染土壤微生物群落的影响, 从而为揭示植物根系分泌物在PAHs污染土壤修复中的作用机制提供理论依据.
模拟根系分泌物包含了根系分泌物中最常见的含碳化合物, 如糖类、小分子酸和氨基酸等, 组分明确, 浓度可控, 适合作为模式根系分泌物对植物修复作用机制进行同领域对比研究.目前关于模拟根系分泌物对土壤中PAHs去除的影响已有相关报道, 但其对PAHs污染土壤中微生物群落的影响仍缺乏足够的了解.芘是一种有代表性的高分子量PAHs, 含有4个对称苯环, 结构上与多种致癌PAHs相似, 其生物降解过程和路径已被广泛研究, 适于作为PAHs的模式化合物进行修复机制研究.因此, 本文通过Illumina NovaSeq高通量测序技术, 研究模拟根系分泌物对芘污染土壤微生物群落结构和功能的影响; 同时以有机污染土壤常用的修复植物黑麦草为受试植物, 采集其根系分泌物, 研究等量的植物实际根系分泌物对芘污染土壤微生物群落的效应, 并对二者进行比较分析, 以期为研究植物根际修复PAHs污染土壤提供科学参考.
1 材料与方法 1.1 供试材料以芘作为PAHs的代表, 购自Sigma-Aldrich公司, 纯度＞98%.供试植物为多年生黑麦草(Lolium perenne L.).供试土壤为山东济南农田土, 采自36°42′29″N, 117°04′40″E.部分性质如下: pH为8.25, ω(有机质)为5.2%, 阳离子交换量为22.6 cmol ·kg-1, ω(全氮)为2.28 g ·kg-1, ω(全磷)为0.96 g ·kg-1, ω(全钾)为13 g ·kg-1, 质地为壤土.土壤中本底ω(芘)为346 μg ·kg-1.土壤经自然阴干、过2 mm筛后, 加入适量芘的丙酮储备液至芘含量为40 mg ·kg-1.将土样置于通风橱使丙酮充分挥发, 封口避光室温老化60 d, 备用.
1.2 实验设置称取10 g老化后的芘污染土壤于40 mL棕色无菌EPA瓶中, 加入无菌水或根系分泌物溶液使其含水率为20%, 用封瓶膜封口后置于生化培养箱中, 25℃培养30 d, 每6 d称重补水.具体处理如下: ①自然衰减组, 向EPA瓶中加入无菌水, 记作CK; ②模拟根系分泌物组, 向EPA瓶中加入模拟根系分泌物溶液, 记作ARE(artificial root exudates); ③实际根系分泌物组, 向EPA瓶中加入实际黑麦草根系分泌物溶液, 记作RE(root exudates).土壤中初始添加的模拟根系分泌物及实际黑麦草根系分泌物含量均为40 mg ·kg-1.各处理均设置3平行, 共9个样本.本实验结束后, 取各处理土壤样本分别提取DNA进行高通量测序, 并测定芘的残留量.
1.3 模拟根系分泌物的配制模拟根系分泌物依据文献[18, 19]配制, 组成为: 果糖(50 mmol ·L-1)、葡萄糖(50 mmol ·L-1)、蔗糖(50 mmol ·L-1)、琥珀酸(25 mmol ·L-1)、苹果酸(25 mmol ·L-1)、精氨酸(12.5 mmol ·L-1)、丝氨酸(12.5 mmol ·L-1)和半胱氨酸(12.5 mmol ·L-1).使用无菌水配制.
1.4 实际根系分泌物的获取以黑麦草根系分泌物作为实际根系分泌物的代表.黑麦草根系分泌物采用水培法获取[20].黑麦草种子浸于3% H2 O2溶液中消毒20 min, 无菌水冲洗3次, 无菌水浸泡过夜.次日将种子置于无菌培养皿灭菌滤纸上催芽.将催芽1 d的种子嵌入自制聚四氟乙烯板搁种孔内.将种子整板转移至含170 mL无菌Hoagland's营养液的1 L量筒中, 控制搁板位置在营养液液面处.将量筒置于25℃培养箱(光暗比14 h ∶10 h, 25℃)中培养15 d.取出整板黑麦草, 用无菌水冲洗板及黑麦草根部, 然后置于100 mL无菌水中(500 mL高型烧杯), 根部避光, 培养箱中培养24 h, 收集的溶液过0.45 μm水系滤膜即为黑麦草根系分泌物.对根系分泌物冷冻干燥, 保存于-20℃冰箱备用.
1.5 土壤DNA提取、PCR扩增及高通量测序土壤DNA的提取及16S rDNA扩增子测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成.采用CTAB法从土壤样本提取基因组DNA, 对16S rDNA的V3~V4区进行PCR扩增.扩增引物为341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGAC TACNNGGGTATCTAAT-3′).PCR产物经电泳检测后, 对目的条带进行回收和文库构建.对合格文库使用NovaSeq6000上机测序, 采用双端测序的PE250策略.对测序得到的原始数据进行拼接和过滤, 得到有效数据进行处理分析.
1.6 芘的测定土壤中的芘采用超声提取HPLC法测定[21, 22].称取2 g冷冻干燥后的土样于离心管中, 加入10 mL二氯甲烷, 用涡旋振荡器混匀后, 于超声清洗仪中超声10 min(功率500 W, 频率40 kHz), 取出离心管进行离心, 将上清液转移至50 mL鸡心瓶中.重复3次, 合并萃取液.将鸡心瓶旋蒸至近干, 加入4 mL甲醇, 超声促溶后, 溶液过0.45 μm有机系针头过滤器转移至自动进样小瓶中, 通过HPLC测定(安捷伦1260).检测条件为: 流动相为甲醇∶水=9 ∶1, 流速1 mL ·min-1, 进样量2 μL, 色谱柱为安捷伦InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 (4.6 mm×100 mm, 2.7 μm), 柱温25℃, DAD检测器, 检测波长240 nm, 采集时长4 min.方法回收率为84.7% ~87.7%.
1.7 数据处理与分析测序数据在诺禾致源售后工具平台(https://magic.novogene.com/)进行处理.利用Uparse软件(Version 7.0.1001)以97%的一致性将有效数据聚类成为最小分类操作单元(operational taxonomic unit, OTU).用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库对代表OTU进行物种注释分析, 在各分类水平统计各样本的群落组成.使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算OTU、Chao1、ACE和Shannon等α多样性指数以及欧式距离、非加权距离和Bray-Curtis距离, 基于距离分别进行PCA、PCoA和NMDS等β多样性分析[23].使用LEfSe软件进行LEfSe分析.使用R软件(Version 2.15.3)进行α多样性及β多样性指数组间差异分析、ANOSIM分析和组间差异物种分析.提取KEGG数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列利用BLASTN算法将其比对至SILVA数据库, 实现SILVA数据库功能注释, 获取测序样品的功能注释信息, 进行Tax4Fun功能预测.
芘的测定数据通过SPSS Statistics 19.0软件进行处理和方差分析.
2 结果与分析 2.1 测序结果3组土壤样本共检测出4 901个OTU, 分属32个门、54个纲、122个目、233个科、585个属和389个种.各组稀释曲线如图 1(a)所示, OTU数目先快速上升, 后趋于平缓, 说明随着测序量的增大, 初期检出大量物种, 后期样本群落的物种丰富度变化趋缓, 低丰度物种逐渐被检出, OTU上升速率降低, 更多的数据量只会产生少量新的OTU.以OTU排序编号为横坐标, OTU相对丰度为纵坐标, 绘制了等级聚类曲线[图 1(b)], 来直观反映样本中物种的丰富度和均匀度.随着测序量增大, 3条曲线在横轴上的跨度变大, 反映物种的丰富度越来越高, 曲线在纵轴上趋于平缓, 反映物种分布逐渐均匀.表 1中的覆盖度指数显示, 3组样本的文库覆盖率为99.0%左右, 说明测序数据量合理, 序列信息能够反映样本群落的真实信息.
|
图 1 在相似度97%水平下的稀释曲线和等级聚类曲线 Fig. 1 Rarefaction curve and rank abundance at 97% similarity level |
|
表 1 土壤细菌群落α多样性 Table 1 The α diversity metrics of soil bacterial community |
对3组土壤样本的OTU进行比较, 结果如图 2所示.CK、ARE和RE组的OTU数分别为3 377、3 306和3 323, 其中3组共有OTU数目为2 157, 占各组OTU的63.9%以上, 说明3组样本的共有微生物占大多数. 3组各自特有的OTU数目分别为728、363和344, 分别占总OTU数的21.6%、11.0%和10.4%. CK组特有OTU数目最多, 说明CK组较另外2组有较多的特有微生物种类. 3组两两比较, ARE与RE组共有OTU数最大, 为2 715个, 高于CK与ARE(2 385)组或CK与RE组共有OTU数(2 421), 说明与CK组相比, ARE与RE这两组的微生物种类具有更高的相似性.
|
图 2 基于OTU的Venn图 Fig. 2 Venn graph based on OTU distribution |
门水平上的细菌群落组成如图 3(a)所示.各处理组的主要共同优势物种有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)的微生物, 相对丰度占总体的96.1%以上.变形菌门的相对丰度最高, 在各处理组中的占比分别为47.3%(CK组)、44.8%(ARE组)和41.4%(RE组).ARE和RE处理分别使其丰度降低了2.5%和5.9%, RE处理的降低幅度略大.拟杆菌门的相对丰度受根系分泌物影响较为明显, 在CK组中为3.6%, 添加ARE和RE分别使其提高了3.0%和7.9%, 且RE的影响程度大于ARE.ARE组相较于其它两组, 芽单胞菌门的占比相对略高, 为6.7%(CK 5.5%; RE 5.9%).但不论是变形菌门、拟杆菌门还是芽单胞菌门, 其相对丰度在各处理组间的变化未达到统计学意义上的显著程度(P>0.05).
|
(a)门水平; (b)属水平 图 3 门水平和属水平上土壤细菌群落组成 Fig. 3 Composition of soil bacterial community at the phylum level and genus level |
属水平上的细菌群落组成如图 3(b)所示.CK组可鉴定出的主要优势物种有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas, 18.9%)、乳酸杆菌属(Lactobacillus, 0.4%)、芽孢杆菌属(Bacillus, 3.2%)、溶杆菌属(Lysobacter, 3.7%)、肉杆菌属(Carnobacterium, 1.3%)和斯科曼氏球菌属(Skermanella, 0.9%), 合计占比为28.4%.与CK组相比, ARE和RE处理分别使鞘氨醇单胞菌属丰度降低了4.3%和7.9%(P为0.155和0.024), 使乳酸杆菌属增加1.9%和2.3%(P为0.015和0.238), 使斯科曼氏球菌属增加1.4%和1.1%(P为0.043和0.093).此外, CK组中的肉杆菌属在ARE和RE组未被检出, 但CK组中未被鉴定出的拟杆菌属(Bacteroides)在ARE和RE组被检出, 分别占比0.3%和1.5%.
2.3 α多样性分析α多样性是指特定群落或生境内的物种多样性, 常用指标为OTU、Chao1、ACE和Shannon指数等.前3个指标反映物种丰富度.Shannon指数兼顾丰富度和均匀度, 反映了细菌群落多样性. 3个处理组的α多样性相关指标如表 1所示.CK、ARE和RE组的OTU值分别为2.34×103、2.33×103和2.34×103, 较为接近.模拟根系分泌物及实际根系分泌物加入土壤后没有显著改变土壤中的物种数.Chao1和ACE指数大小顺序为: RE组＞CK组＞ARE组, 但组间差异不显著(P>0.05), 即细菌群落丰富度无显著差别.ARE和RE组的Shannon指数高于CK组, 说明添加模拟或实际根系分泌物使土壤细菌群落多样性有了一定程度的提高, 但提高不显著(P>0.05).
2.4 β多样性分析β多样性是生境之间的物种多样性, 用以衡量群落之间的差别, 反映样本之间的多样性距离关系以及生物群落之间的分化程度. 3组土壤样本的主成分分析(principle compounent analysis, PCA)、主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)和多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)结果如图 4所示.PCA是根据OTU个数和欧氏距离的应用方差分解, 对多维数据进行降维来揭示样本间群落组成的相似性[图 4(a)].结果显示, CK组样本分布在PC1的左轴, 而ARE和RE组分布在PC1的右轴, 说明CK组与ARE和RE组的细菌群落结构存在差异.ARE和RE组的细菌群落分散于PC2的上下轴, 两组未成簇分开, 表明两组群落结构较为相似.基于非加权距离和Bray-Curtis距离分别进行了PCoA和NMDS的分析, 结果如图 4(b)和4(c)所示, 样本点分布与PCA结果大致相同.以上表明, 添加ARE或RE使土壤细菌群落结构发生了改变, 但ARE与RE组的彼此细菌群落结构差异不大.
|
(a)主成分分析(PCA); (b)主坐标分析(PCoA); (c)无度量多维标定法(NMDS) 图 4 基于OTU信息的多样本比较分析 Fig. 4 Multivariate analysis based on OTU information |
对样本进行了ANOSIM分析, 比较样本的组间差异和组内差异, 如图 5所示.CK与ARE或RE组的R值均大于0, 说明组间差异显著, ARE或RE处理使得细菌群落结构发生了改变.ARE与RE组的R值小于0, 说明组内差异大于组间差异, 佐证了ARE与RE组之间的细菌群落结构相似.
|
(a)ARE组与CK组; (b)CK组与RE组; (c)ARE组与RE组 图 5 Anosim组间差异分析 Fig. 5 Anosim analysis between groups |
采用基于线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)效应量的分析方法(LDA effect size, LEfSe), 寻找在组间具有统计学差异的细菌物种.图 6展示了CK、ARE和RE组两两之间丰度差异显著的物种类别.CK与ARE和RE组分别比较时的LDA得分设置为大于3, ARE与RE两组比较时LDA得分大于2.
|
(a)CK与ARE; (b)CK与RE; (c)ARE与RE 图 6 组间差异物种进化分支图 Fig. 6 Cladogram of discriminating bacteria between groups |
图 6(a)展示了CK组与ARE组丰度差异显著的物种类别.两组比较共得到37个组间差异物种, 其中CK组的差异物种有12个, ARE组的差异物种有25个.ARE组的差异物种具体为: 纲水平上: 类杆菌纲(Bacteroidia)、韦荣球菌纲(Erysipelotrichia)、变形菌纲(δ-Proteobacteria)和unidentified_Bacteria; 目水平上: 小单孢菌目(Micromonosporales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、韦荣球菌目(Erysipelotrechales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)和unidentified_γ-Proteobacteria; 科水平上: 伊格尔兹氏菌科(Eggerthellaceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Muribaculaceae、微纤毛科(Microscillaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)、unidentified_α-Proteobacteria、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、哈林吉亚科(Haliangiaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)和unidentified_γ-Proteobacteria.以上物种在ARE组的丰度均显著高于CK组.
在图 6(b)中可观察到, CK组和RE组共存在39个丰度差异显著的物种类别, 其中CK组23个, RE组有16个.RE组的差异物种中有8个同样也是ARE组的差异物种, 分别为: 拟杆菌目(Bacteroidales)、小单孢菌目(Micromonosporales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、伊格尔兹氏菌科(Eggerthellaceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Muribaculaceae和乳酸杆菌科(Lactobacillaceae); 除此之外, RE组特有的差异物种还有拟杆菌纲(Bacteroidia)、弗兰克氏目(Frankiales)、地衣门菌科(Geodermatophilaceae)、马兜铃菌科(Marinidilaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Geminicoccaceae和螺杆菌科(Helicobacteraceae).ARE和RE组相较于CK组存在差异物种, 说明ARE和RE处理会影响芘污染土壤中的微生物种群, 使部分物种的丰度显著高于CK组.ARE和RE组存在共同的差异物种说明ARE和RE处理对土壤中微生物物种的影响具有一定的相似性.
图 6(c)展示了ARE与RE两组间的丰度差异显著的物种.两组样本共存在8个差异物种.膜壳菌科(Hymenobacteraceae)、暖绳菌科(Caldilineaceae)、粘球菌科(Myxococcaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、暖绳菌目(Caldilineales)和立克次体目(Rickettsiales)等6个物种在ARE组的丰度显著高于RE组.目水平上的unidentified_Acidimicrobiia和科水平上的苦参科(Woeseiaceae)等2个物种在RE组的丰度显著高于ARE组.总体上看, ARE与RE组之间的差异物种较少.
采用LEfSe法对CK、ARE和RE这3组同时进行比较(LDA得分＞3), 结果如图 7所示. 3个处理组间丰度存在显著差异的细菌类群为6个.在CK组中存在4个差异物种, 分别为肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、unidentified_Clostridiales科、动球菌科(Planococcaceae)和鞘氨醇单胞菌种(Sphingomonas_sp), ARE和RE处理使它们丰度显著降低.毛螺旋菌属(parasutterella)在ARE组中的丰度最高, 瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)在RE组中的丰度最高.
|
图 7 不同处理组间土壤细菌差异物种 Fig. 7 Discriminating bacteria among groups |
通过功能注释Venn图可以考察土壤样本间的基因数目分布情况(图 8).CK、ARE和RE组土壤样本共有的基因信息为6 510个KEGG同源序列(KEGG ortholog group, KO), 各自特有的基因信息较少, 分别为5、2和1个KO. 3组土壤样本在不同注释层级上最大丰度排名前10的基因功能信息如图 9(a)和9(b)所示.在第一层级(Level 1)主要有6类丰度较高的基因功能[图 9(a)], 其相对丰度在CK、ARE和RE3组间较为相似.按丰度从高到低依次为: 新陈代谢(metabolism, 47.8% ~48.3%)、遗传信息处理(genetic information processing, 21.1% ~21.3%)、环境信息处理(environmental information processing, 13.1% ~13.3%)、细胞过程(cellular processes, 7.7% ~7.8%)、人类疾病(human diseases, 2.7% ~2.8%)和生物体系统(organismal systems, 1.7% ~1.8%), 前3类功能的丰度之和超过82.4%.在第二层级上[Level 2, 图 9(b)], 丰度排名前10的功能信息分别是: 碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、氨基酸代谢(amino acid metabolism)、膜转运(membrane transport)、翻译(translation)、复制和修复(replication and repair)、能量代谢(energy metabolism)、脂代谢(lipid metabolism)、信号转导(signal transduction)、辅助因子和维生素代谢(metabolism of cofactors and vitamins)和核苷酸代谢(nucleotide metabolism), 其总相对丰度在3个处理组中均为62.4% ~62.5%, 这10类基因功能各自的占比在3组间也较为相似, 表明添加ARE或RE没有明显改变土壤微生物群落的基因功能.在Level 2丰度排名前10的功能信息中, 代谢类功能信息有6个, 分别是碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、脂代谢、辅助因子和维生素的代谢和核苷酸代谢.这6类代谢类功能信息相对丰度占总体比例的35.5% ~35.9%, 占Level 1新陈代谢功能的74.3%, 其中碳水化合物代谢(10.5%)属于代谢中占比最高的基因功能, 这与PAHs污染土壤中微生物可能以PAHs为主要碳源的代谢活动相吻合.
|
图 8 基于Tax4Fun功能注释的Venn图 Fig. 8 Venn graph based on Tax4Fun functional annotation |
|
(a)Level 1功能; (b)Level 2功能 图 9 基于Tax4Fun功能注释的功能基因相对丰度 Fig. 9 Relative abundance of functional genes based on Tax4Fun functional annotation |
根据样品在数据库中的功能注释及丰度信息, 选取丰度排名前35的功能及它们在每组样品中的丰度信息绘制热图, 并从功能差异层面进行聚类, 结果如图 10所示.在第一层级的6类主要基因功能中, CK组中细胞过程(cellular processes)的功能基因丰度高于ARE和RE组, 即向芘污染土壤加入ARE或RE后, 涉及细胞过程的功能基因丰度有所降低, 具体到第二层级为细胞群落原核生物(cellular community prokaryotes)和细胞运动(cell motility).在ARE组中, 丰度较另两组更高的基因功能在第一层级上是新陈代谢, 在第二层级为转运和代谢(transport and catabolism)、转录(transcription)和酶系(enzyme families)等.第三层级上, 果糖和甘露糖代谢(fructose and mannose metabolism)基因丰度显著高于CK组, 可能与ARE组分中含有较高浓度的果糖相关.RE组中的遗传信息处理(genetic information processing)及环境信息处理(environmental information processing)等基因丰度在第一层级相对较高, 在第二层级中免疫系统(immune system)、内分泌及代谢疾病(endocrine and metabolic diseases)、膜转运(membrane transport)、基因信息处理(genetic information processing)和聚糖生物合成与代谢(glycan biosynthesis and metabolism)等较另两组更高.第三层级上, unclassified metabolism基因丰度显著高于CK组, 可能与RE组分较为复杂有关.注释为PAHs降解相关的功能基因(第三层级)在3个处理组之间的丰度未显示出显著差异, 但在第四层级上, 观察到ARE组和RE组分别有596和135个KO丰度与CK组有显著差异, ARE组和RE组之间有12个KO丰度存在显著差异.在第四层级上丰度发生显著改变的功能基因, 在芘的降解过程起了何种作用, 有必要在今后研究中进一步探索.
|
(a)Level 1水平; (b)Level 2水平 图 10 土壤细菌基因功能多样性聚类热图 Fig. 10 Heatmap of bacterial functional diversity |
向含芘土壤中投加根系分泌物30 d后, ARE和RE组中的ω(芘)分别为(4.2±0.2)mg ·kg-1和(4.4±0.1)mg ·kg-1, 比CK组分别降低了14.0%和8.7%, ARE的促进作用略高于RE.这表明添加了模拟和实际根系分泌物后不同程度地促进了土壤中的芘的去除.
3 讨论 3.1 根系分泌物对物种的影响本实验芘污染土壤中的优势物种有变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门等, 其中变形菌门的占比最大, 隶属变形菌门的鞘氨醇单胞菌属在属水平上相对丰度最高.这些优势物种是较常见的PAHs耐受及降解物种[24~26].
ARE和RE的添加没有改变细菌群落的优势物种组成, 处理前后土壤中主要优势菌门和菌属一致, 但不同程度地影响了其相对丰度.ARE和RE处理使变形菌门及其鞘氨醇单胞菌属的丰度有所降低, 但不显著(P>0.05).对于隶属变形菌门的伯克氏菌科添加根系分泌物则有不同表现, ARE处理使其丰度显著提高(P < 0.05).伯克氏菌可产生邻苯二酚2, 3-双加氧酶使芳香族化合物开环裂解, 对芳香族化合物具有高效降解效果[27], ARE的存在促进了其对芘的共代谢.拟杆菌门和拟杆菌纲经ARE和RE处理后丰度增加, 但未达到显著程度(P>0.05), 其下的拟杆菌目和拟杆菌科的相对丰度则增加显著(P < 0.05), 是ARE和RE组相较CK组的差异物种.
ARE和RE组与CK组比较, 有8个区别于CK组的共同差异物种.这8个物种中, 拟杆菌目和拟杆菌科属于拟杆菌门, 小单孢菌目、小单孢菌科和伊格尔兹氏菌科属于放线菌门, 弯曲菌目隶属于变形菌门, 乳酸杆菌科属于厚壁菌门, 均为PAHs降解优势菌.它们在根系分泌物加入后相对丰度得到了显著提高, 说明根系分泌物的添加选择性地促进了PAHs降解菌的生长.同时比较3个处理组, ARE组和RE组的标志物种分别是隶属变形菌门的毛螺旋菌属和隶属厚壁菌门的瘤胃梭菌属.
3.2 根系分泌物对细菌群落的影响添加ARE和RE对芘污染土壤中细菌群落的丰富度和多样性指数有一定影响, 但不显著(P>0.05), 说明ARE和RE的添加未显著改变土壤细菌群落的α多样性.降维分析结果表明, ARE或RE组改变了土壤细菌群落的β多样性, 即添加ARE或RE改变了芘污染土壤中的细菌群落结构, ARE与RE组彼此间群落结构较接近.
ARE和RE的添加没有改变细菌群落的优势物种组成, 但改变了土壤细菌群落结构, 其中的原因值得探究. β降维分析查看的是总体情况, 会展示整体的样本群落组成, 优势物种在处理前后变化不大, 可能低丰度物种发生了较大的变化.差异物种分析结果显示, CK组与ARE组共存在37个丰度差异显著的物种.将这些物种与各分类学水平上的优势物种(TOP10)进行比对, 其中12个为优势物种, 25个为低丰度物种.CK组与RE组共存在39个丰度差异显著的物种, 其中9个高丰度物种, 30个低丰度物种.以上结果佐证了土壤细菌群落结构的改变与低丰度物种的较大变化有关.
目前关于根系分泌物及其组分对PAHs污染土壤中细菌群落多样性影响的报道较少.Wang等[28]的研究发现, 根系分泌物中两种常见脂肪酸的衍生物棕榈酸钠和亚油酸钠使老化PAHs污染土壤中α多样性指数显著降低, 且使细菌群落结构发生了显著变化.王姣龙等[29]研究了根系分泌物中的低分子有机酸对菲污染土壤中细菌群落的影响, 发现了类似结果.Guo等[30]研究了玉米和大豆的根系分泌物对土壤微生物群落的影响, 发现添加根系分泌物使多样性指数有所增加, 且添加初期的多样性指数高于后期; 同时观察到根系分泌物对PAHs的降解有促进效应, 该效应也在添加初期最为显著, 后期减弱, 认为根系分泌物可能随时间被消耗掉了.Li等[15]的研究则表明黑麦草根系分泌物的存在未影响土壤中菲的去除率, 但显著增加了总细菌的丰度, 改变了总细菌群落及菲降解细菌群落的组成和结构.
本研究中, ARE和RE的存在不同程度地促进了土壤中芘的去除, 这与其对土壤微生物物种及群落结构的影响有关.有研究表明污染物的降解较多地倚赖于具有特定功能的分类群[31, 32].根系分泌物的添加选择性促进了PAHs降解菌的生长, 显著提高了其相对丰度.Tax4Fun功能预测显示, ARE组和RE组分别有596和135个KO丰度与CK组相比发生了显著改变.因此推断, 根系分泌物的添加促进了PAHs降解菌的生长, 改变了部分功能基因的相对丰度, 增强了芘的降解效率, 进而降低了土壤中芘的含量.
4 结论(1) 根系分泌物未明显改变芘污染土壤细菌群落的组成, 处理前后土壤中主要优势菌门和菌属一致.然而, 根系分泌物使得优势物种的相对丰度发生了不同程度地变化, 并产生了差异物种. 2个根系分泌物组相较于对照组的共同差异物种均为PAHs降解优势菌, 根系分泌物的添加选择性地促进了PAHs降解菌的生长.
(2) 根系分泌物对芘污染土壤细菌群落的丰富度和多样性影响不大, 对群落结构的影响较为显著, 归因于低丰度物种的较大变化.模拟根系分泌物和黑麦草实际根系分泌物两个处理组之间的群落结构较为相近.
(3) 根系分泌物对土壤中芘的去除有促进作用, 源于PAHs降解菌相对丰度的提高, 部分相关功能基因的丰度得以增加, 从而提高了芘的降解效率, 降低了芘的含量.根系分泌物影响下丰度发生显著变化的功能基因在芘降解中发挥的作用需要进一步探究.
| [1] | Fu X W, Li T Y, Ji L, et al. Occurrence, sources and health risk of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils around oil wells in the border regions between oil fields and suburbs[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2018, 157: 276-284. DOI:10.1016/j.ecoenv.2018.03.054 |
| [2] |
吴志远, 张丽娜, 夏天翔, 等. 基于土壤重金属及PAHs来源的人体健康风险定量评价: 以北京某工业污染场地为例[J]. 环境科学, 2020, 41(9): 4180-4196. Wu Z Y, Zhang L N, Xia T X, et al. Quantitative assessment of human health risks based on soil heavy metals and PAHs sources: take a polluted industrial site of Beijing as an example[J]. Environmental Science, 2020, 41(9): 4180-4196. |
| [3] | Alegbeleye O O, Opeolu B O, Jackson V A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: a critical review of environmental occurrence and bioremediation[J]. Environmental Management, 2017, 60(4): 758-783. DOI:10.1007/s00267-017-0896-2 |
| [4] | Han J, Liang Y S, Zhao B, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs) geographical distribution in China and their source, risk assessment analysis[J]. Environmental Pollution, 2019, 251: 312-327. DOI:10.1016/j.envpol.2019.05.022 |
| [5] | Kuppusamy S, Thavamani P, Venkateswarlu K, et al. Remediation approaches for polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) contaminated soils: technological constraints, emerging trends and future directions[J]. Chemosphere, 2017, 168: 944-968. DOI:10.1016/j.chemosphere.2016.10.115 |
| [6] | Wei Z H, Van Le Q, Peng W X, et al. A review on phytoremediation of contaminants in air, water and soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 403. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.123658 |
| [7] | Liao Q H, Liu H, Lu C, et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils[J]. Science of the Total Environment, 2021, 764. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.144436 |
| [8] | Lu H N, Sun J T, Zhu L Z. The role of artificial root exudate components in facilitating the degradation of pyrene in soil[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 7130. DOI:10.1038/s41598-017-07413-3 |
| [9] |
潘声旺, 袁馨, 刘灿, 等. 芘胁迫对5种羊茅属植物根系分泌的几类低分子量有机物的影响[J]. 环境科学, 2016, 37(6): 2368-2375. Pan S W, Yuan X, Liu C, et al. Effects of pyrene on low molecule weight organic compounds in the root exudates of five species of festuca[J]. Environmental Science, 2016, 37(6): 2368-2375. |
| [10] | Sasse J, Martinoia E, Northen T. Feed your friends: do plant exudates shape the root microbiome?[J]. Trends in Plant Science, 2018, 23(1): 25-41. DOI:10.1016/j.tplants.2017.09.003 |
| [11] | Chiniquy D, Barnes E M, Zhou J L, et al. Microbial community field surveys reveal abundant Pseudomonas population in sorghum rhizosphere composed of many closely related phylotypes[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12. DOI:10.3389/fmicb.2021.598180 |
| [12] | Lapie C, Sterckeman T, Paris C, et al. Impact of phenanthrene on primary metabolite profiling in root exudates and maize mucilage[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2020, 27(3): 3124-3142. DOI:10.1007/s11356-019-07298-x |
| [13] | Miao R H, Guo M X, Zhao X Y, et al. Response of soil bacterial communities to polycyclic aromatic hydrocarbons during the phyto-microbial remediation of a contaminated soil[J]. Chemosphere, 2020, 261. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.127779 |
| [14] | Jiao S, Li Q P, Zai X Y, et al. Complexity of bacterial communities within the rhizospheres of legumes drives phenanthrene degradation[J]. Geoderma, 2019, 353: 1-10. DOI:10.1016/j.geoderma.2019.06.019 |
| [15] | Li J B, Luo C L, Zhang D Y, et al. Diversity of the active phenanthrene degraders in PAH-polluted soil is shaped by ryegrass rhizosphere and root exudates[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2019, 128: 100-110. DOI:10.1016/j.soilbio.2018.10.008 |
| [16] | Guo M X, Gong Z Q, Miao R H, et al. Microbial mechanisms controlling the rhizosphere effect of ryegrass on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in an aged-contaminated agricultural soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 130-142. DOI:10.1016/j.soilbio.2017.06.006 |
| [17] | Jiang L F, Luo C L, Zhang D Y, et al. Shifts in a phenanthrene-degrading microbial community are driven by carbohydrate metabolism selection in a ryegrass rhizosphere[J]. Environmental Science & Technology, 2021, 55(2): 962-973. |
| [18] | Joner E J, Corgié S C, Amellal N, et al. Nutritional constraints to degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in a simulated rhizosphere[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(6): 859-864. DOI:10.1016/S0038-0717(02)00018-4 |
| [19] | Brandt K K, Sjøholm O R, Krogh K A, et al. Increased pollution-induced bacterial community tolerance to sulfadiazine in soil hotspots amended with artificial root exudates[J]. Environmental Science & Technology, 2009, 43(8): 2963-2968. |
| [20] |
胡芳雨, 孟凡波, 张闻, 等. 黑麦草根系分泌物氨基酸组分对PAHs胁迫的响应[J]. 农业环境科学学报, 2020, 39(9): 1937-1945. Hu F Y, Meng F B, Zhang W, et al. Response of amino acids in ryegrass root exudates to polycyclic aromatic hydrocarbon stress[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2020, 39(9): 1937-1945. |
| [21] | Gou Y L, Yang S C, Cheng Y J, et al. Enhanced anoxic biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in aged soil pretreated by hydrogen peroxide[J]. Chemical Engineering Journal, 2019, 356: 524-533. DOI:10.1016/j.cej.2018.09.059 |
| [22] | Košnář Z, Částková T, Wiesnerová L, et al. Comparing the removal of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil after different bioremediation approaches in relation to the extracellular enzyme activities[J]. Journal of Environmental Sciences, 2019, 76: 249-258. DOI:10.1016/j.jes.2018.05.007 |
| [23] |
刘晓华, 魏天兴. 高通量测序分析黄土高原退耕还林区土壤细菌群落特征[J]. 环境科学, 2021, 42(9): 4489-4499. Liu X H, Wei T X. High throughput sequencing analysis of soil bacterial community characteristics in areas under grain for green project in the Loess Plateau[J]. Environmental Science, 2021, 42(9): 4489-4499. |
| [24] |
冯琦. PAHs污染对农田土壤微生物群落组成的影响[D]. 大连: 大连理工大学, 2019. Feng Q. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) pollution on microbial community composition in farmland[D]. Dalian: Dalian University of Technology, 2019. |
| [25] |
唐涛涛, 李江, 杨钊, 等. 多环芳烃生物降解及转化途径的研究进展[J]. 石油学报(石油加工), 2019, 35(2): 403-413. Tang T T, Li J, Yang Z, et al. Research progress on biodegradation and transformation pathways of polycyclic aromatic hydrocarbons[J]. Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section), 2019, 35(2): 403-413. DOI:10.3969/j.issn.1001-8719.2019.02.023 |
| [26] | Koshlaf E, Shahsavari E, Haleyur N, et al. Effect of biostimulation on the distribution and composition of the microbial community of a polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated landfill soil during bioremediation[J]. Geoderma, 2019, 338: 216-225. DOI:10.1016/j.geoderma.2018.12.001 |
| [27] | Morya R, Salvachúa D, Thakur I S. Burkholderia: an untapped but promising bacterial genus for the conversion of aromatic compounds[J]. Trends in Biotechnology, 2020, 38(9): 963-975. DOI:10.1016/j.tibtech.2020.02.008 |
| [28] | Wang Q L, Hou J Y, Yuan J, et al. Evaluation of fatty acid derivatives in the remediation of aged PAH-contaminated soil and microbial community and degradation gene response[J]. Chemosphere, 2020, 248. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.125983 |
| [29] |
王姣龙, 谌小勇, 闫文德. 低分子有机酸对土壤中菲降解及细菌群落结构的影响[J]. 生态学报, 2019, 39(19): 7179-7188. Wang J L, Chen X Y, Yan W D. Effects of low-molecular-weight organic acids on the degradation of phenanthrene and bacterial community structure in soil[J]. Acta Ecologica Sinica, 2019, 39(19): 7179-7188. |
| [30] | Guo M X, Gong Z Q, Miao R H, et al. The influence of root exudates of maize and soybean on polycyclic aromatic hydrocarbons degradation and soil bacterial community structure[J]. Ecological Engineering, 2017, 99: 22-30. DOI:10.1016/j.ecoleng.2016.11.018 |
| [31] | Kumar A, Singh V K, Singh P, et al. Microbe mediated remediation of environmental contaminants[M]. Duxford: Woodhead Publishing, 2021. |
| [32] | Yu X M, Shen T, Kang X, et al. Long-term phytoremediation using the symbiotic Pongamia pinnata reshaped soil micro-ecological environment[J]. Science of the Total Environment, 2021, 774. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.145112 |