磷是植物必需的营养元素之一, 是限制作物产量的重要因子.但土壤中的磷极易被吸附固定, 使得磷肥的利用率很低^[1~3].世界上使用的磷肥主要是从不可再生的矿产资源中获得, 过量施用磷肥不仅导致磷矿的储量逐渐枯竭, 还会引起水体富营养化等生态环境问题^[4].因此为减少磷矿的开采以及矿质磷肥的过量施用, 提升化学磷肥的农学效益至关重要^[5].土壤微生物作为评价土壤生物学特性的指标, 能够改善土壤结构, 使土壤中营养元素更好地被植物吸收利用, 在土壤养分循环及有机质分解等方面起重要作用^{[6, 7]}.土壤磷转化功能微生物便是一类与土壤磷素密切相关的微生物, 其中解磷微生物作为土壤难溶性磷活化的主要驱动者^[8], 在将难溶性磷转化为可溶性的磷酸盐时分泌磷酸酶, 而磷酸酶主要由phoC和phoD编码^{[9, 10]}.当土壤中磷素有效性含量较低时, 土壤中的解磷微生物受到胁迫后分泌的磷酸酶可提高土壤磷素的有效性, 缓解植物受磷素的胁迫^{[11, 12]}.西南地区土壤大多为酸性土壤, 在较低pH环境下, 土壤矿物表面吸附的磷可转化形成含磷的表面沉淀, 造成矿物溶解转化以及磷生物有效性的进一步降低^[13], 使得磷缺乏成为限制西南地区农业发展的主要因素之一.因此, 研究土壤磷转化功能基因与土壤磷素供给之间的微生物学机制对提高西南地区土壤磷素有效性具有重要的指示意义^{[14, 15]}.

生物炭作为一种土壤改良剂具有较强的吸附力、极大的比表面积和发达的孔隙结构, 在土壤微生态调控和缓解温室效应等方面具有良好的效应^[16~21].有研究表明向土壤中施用生物炭可对土壤磷的有效性和微生物群落产生影响.Cui等^[22]的研究发现生物炭可通过改变土壤pH和阳离子交换能力, 从而增加土壤中磷的有效性.冯慧琳等^[23]的研究通过田间试验, 分析了不同生物炭添加量对土壤细菌群落多样性的影响, 发现生物炭可在一定程度上增加细菌多样性及改变菌群结构.同时, 也有学者称有机肥施入土壤后对土壤全磷和速效磷含量都有显著提升作用^[24].

目前, 关于生物炭对土壤微生物群落影响的研究主要集中在生物炭对土壤细菌、真菌和放线菌种类的影响, 而关于生物炭对根际土壤和非根际土壤中磷转化功能微生物phoC和phoD群落的影响机制尚不十分清楚, 关于生物炭与有机肥、化肥配施后对土壤磷素有效性影响的研究也较少.因此, 本研究以玉米秸秆和稻壳秸秆为供试材料, 通过化肥和有机肥配施生物炭, 分析柠檬根际和非根际土的phoC和phoD群落结构的演变和响应机制, 对于生物炭的农业利用具有一定的指导意义.

供试土壤为紫色潮土, 采自重庆市潼南区太安镇小岭村柠檬基地, 将采集后的土壤放置于阴凉干燥处, 经自然风干后, 去除其中的小石块、动植物残体, 再碾碎过1 cm筛, 保存备用; 再将部分过1 cm筛的土壤样品进一步碾碎过3 mm筛, 用于培养试验.初始土壤的养分基本情况: pH 5.20, ω(有机质)为8.68 g·kg^-1, ω(全氮)为0.68 g·kg^-1, ω(全磷)为0.22 g·kg^-1, ω(碱解氮)为67.31mg·kg^-1, ω(硝态氮)为34.64 mg·kg^-1, ω(有效磷)为9.14 mg·kg^-1, ω(速效钾)为244.12 mg·kg^-1.

供试腐熟猪粪(有机肥)和新鲜猪粪(新鲜有机肥)取自潼南温氏种猪场, 其基本性质见表 1.供试生物炭为玉米秸秆生物炭和稻壳生物炭, 由四川省久晟农业有限责任公司提供, 其分别以玉米秸秆和稻壳为原料, 在500℃高温厌氧条件下热解2 h制备, 两种生物炭养分含量见表 2.供试柠檬品种为尤力克, 苗龄为嫁接7个月的脱毒苗, 来自重庆市潼南区国家科技农业园区智能化柠檬脱毒育苗中心.

表 1 (Table 1)

表 1 有机肥基本性质 Table 1 Basic properties of organic fertilizer 猪粪类型 pH ω(N) /g·kg-1 ω(有效氮) /g·kg-1 ω(P)(P2O5肥) /g·kg-1 ω(K)(K2O肥) /g·kg-1 当季(120 d)缓释效率/% 碱解氮 速效磷 速效钾 腐熟 7.7 22.91 0.35 51.5 8.8 35.3 34.8 41.5 新鲜 7.7 21.46 0.13 31.3 7.9

表 1 有机肥基本性质 Table 1 Basic properties of organic fertilizer

表 2 (Table 2)

表 2 生物炭基本性质 Table 2 Basic properties of biochar 生物炭类型 pH ω(碳)/g·kg-1 ω(氮)/g·kg-1 ω(磷)/g·kg-1 ω(钾)/g·kg-1 玉米秸秆 9.8 518.11 1.105 1.833 14.46 稻壳 9.5 238.52 0.8077 1.754 6.827

表 2 生物炭基本性质 Table 2 Basic properties of biochar

本试验共设6个处理: ①对照(CK)、②传统施肥(F)、③化肥+20 t·hm^-2稻壳生物炭(FP)、④化肥+10 t·hm^-2稻壳生物炭+10 t·hm^-2玉米生物炭(FPM)、⑤有机肥+20 t·hm^-2稻壳生物炭(PP)和⑥新鲜有机肥+20 t·hm^-2稻壳生物炭(NPP), 每个处理4次重复, 试验采取随机区组设计.称取过1 cm筛的风干土15 kg, 共24份, 分别按照上述处理加入生物炭和化肥, 柠檬幼苗单株基肥纯氮2.625 g、磷2.625 g和钾1.83 g, 将上述生物炭、有机肥和基肥充分与土混匀装入直径22 cm和高30 cm的PVC圆桶中.装盆放置15 d后定植柠檬, 每钵1株, 定植时各处理的柠檬苗保持大小基本一致, 均选用株高50 cm左右的柠檬苗, 定植后, 浇水灌透.定植后每2个月, 以基肥1/3的氮、磷和钾素的量进行追肥, 各处理保持等氮、磷和钾的输入.平日进行适时适量浇水管理, 以防止肥料流失.种植9个月后破坏性采集根际、非根际土壤样品, 分析土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、NO₃^--N、NH₄⁺-N、有效磷、速效钾、phoC和phoD拷贝数及相对丰度等指标, 阐明生物炭对柠檬根际土壤有机磷转化的微生物机制.传统施肥使用的氮、磷和钾肥品种分别为尿素(N 46%)、过磷酸钙(P₂O₅ 12%)和氯化钾(K₂O 60%).微肥来自北美联邦农大集团生产的硼锌锰铁镁钙硅复合微量元素水溶肥料, 各元素含量: B、Zn、Mg、Si、Ca、Mn和Fe均大于12%, pH 6.0.除CK处理外, 各处理保持等氮的输入处理(表 3).

表 3 (Table 3)

表 3 各试验处理施肥量 Table 3 Fertilizer amount of each treatment 施肥处理 化肥/g 有机肥 /g 新鲜有机肥 /g 稻壳生物质炭 /g 玉米生物质炭 /g 微量元素 /g 尿素 过磷酸钙 氯化钾 CK — — — — — — — — F 5.70 21.87 3.05 — — — — 2.16 FP 5.47 19.93 1.53 — — 133.35 — 2.16 FPM 5.43 19.88 0.68 — — 66.675 66.675 2.16 PP — — — 307.85 — 133.35 — — NPP — — — — 337.12 133.35 — —

表 3 各试验处理施肥量 Table 3 Fertilizer amount of each treatment

土壤样品采集为破坏性采样, 先打开定植盆, 取出带土试验苗, 去除黏附在根系上的较大颗粒土, 并用细毛刷轻轻刷下黏附在须根上的根际土, 将其收集在无菌自封塑料袋中封好, 同时收集等量的非根际土.完成采样后, 将装于自封袋中的土样带回实验室, 放于-20℃冰箱中储存.准确称取0.5 g鲜土, 根据MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒说明进行土壤总DNA提取, 采用荧光定量PCR和T-RFLP技术进行phoC和phoD拷贝数和基因相对丰度的测定与分析.另外将新鲜植株根收集在无菌自封塑料袋中封好, 带回实验室后先用自来水冲洗干净后用蒸馏水冲洗后放入烘箱中105℃杀青30 min, 再在70℃下烘干备用.

① 测定DNA样本浓度. ②phoC和phoD荧光定量PCR所需引物见表 4. ③phoC和phoD荧光定量PCR和T-RFLP体系及程序见表 5.

表 4 (Table 4)

表 4 phoC和phoD荧光定量PCR引物 Table 4 phoC and phoD gene fluorescence quantitative PCR primers 名称 引物名称 序列(5′-3′) phoC phoC-A-F1 CGGCTCCTATCCGTCCGG phoC-A-R1 CAACATCGCTTTGCCAGTG phoD ALPS-F730 CAGGTGGGACGACCACGAGGT ALPS-R1101 GAGGCCGATCGGCATGTCG

表 4 phoC和phoD荧光定量PCR引物 Table 4 phoC and phoD gene fluorescence quantitative PCR primers

表 5 (Table 5)

表 5 phoC和phoD荧光定量PCR和T-RFLP体系和程序 Table 5 The phoC and phoD gene fluorescence quantitative PCR and T-RFLP system and procedures 技术 名称 体系 程序 PCR phoC 25 μL体系, PCR Mix 12.5 μL, 引物0.3 μL, DNA 3 μL(10 ng·μL-1), ddH2O 8.9 μL 预变性95℃ 3 min, 变性95℃ 30 s, 退火54℃ 35 s, 延伸72℃ 25 s, 45个循环 phoD 20 μL体系, PCR Mix 10 μL, 引物0.5 μL, DNA 1 μL(10 ng·μL-1), ddH2O 8 μL 预变性94℃ 3 min, 变性94℃ 1 min, 退火57℃ 1 min, 延伸72℃ 2 min, 35个循环 T-RFLP phoC 25 μL体系, PCR Mix 12.5 μL, 引物0.3 μL, DNA 1 μL(10 ng·μL-1), ddH2O 10.9 μL 预变性95℃ 3 min, 变性95℃ 30 s, 退火58℃ 30 s, 延伸72℃ 20 s, 45个循环, 最终延伸72℃ 5 min phoD 50 μL体系, PCR Mix 25 μL, 引物0.6 μL, DNA 2 μL 预变性94℃ 3 min, 变性94℃ 1 min, 退火59℃ 1 min, 延伸72℃ 2 min, 35个循环, 最终延伸72℃ 7 min

表 5 phoC和phoD荧光定量PCR和T-RFLP体系和程序 Table 5 The phoC and phoD gene fluorescence quantitative PCR and T-RFLP system and procedures

(1) Real-Time PCR标准样品的制作   选取l份质量高的PCR产物, 采用DNA凝胶纯化试剂盒纯化目的基因片段, 并采用克隆技术获得单克隆子.基因测序工作由上海生工生物工程有限公司完成.将测序结果导入MEGA 5.0软件, 经过剪裁处理选取一个插入片段序列完整(两端引物完整)、长度合适(目标长度160~250 bp)的克隆子.利用质粒提取试剂盒提取克隆子的质粒, 测定DNA浓度, 将其以10倍为间隔系列稀释成实时荧光定量PCR测定标准品.各样品平行间所测定的C_t值差异很小, 即样品平行间一致度较好试验测定值可信度较高.其次, 标准样品PCR过程中熔解温度的测定值做熔解曲线, 熔解曲线无杂峰表明扩增片段长度一致无引物二聚体.分别以10倍浓度梯度的标准样品中DNA模板浓度与C_t值为横纵坐标的标准曲线, 由于Real-Time PCR绝对定量是建立在模板的初始浓度与域值循环数C_t值关系的基础上, 因此为保证样本定量有稳定可重复的试验结果, Real-Time PCR标准曲线参数的优化非常重要.

(2) 样品定量   将样品与标准品一起在StepOne PULS(ABI, Foster, CA, USA)上进行Real-Time PCR检测, 包括阴性对照在内每个样品设3个重复.每个循环中荧光收集在83℃下进行, 以防止由于引物二聚体的存在所引起的误差.熔解曲线程序为65~98℃, 每0.2℃读数, 其间停留6 s.

T-RFLP分析各功能基因采用不同的引物、扩增体系和程序, 其中每对引物的正向引物都带有FAM荧光标记.①phoC和phoD扩增所需引物见表 4; ②phoC和phoD扩增体系和程序见表 5; ③phoC和phoD扩增产物的酶切.

phoC和phoD扩增的PCR产物分别利用HhaⅠ和MspⅠ限制性内切酶进行单酶切.在37℃的恒温培养箱中放置14~16 h, 然后再在80℃的恒温烘箱中放置30 min使其失活.最后送生工生物工程(上海)股份有限公司利用ABI Prism 3100基因分析仪进行T-RFLP分析.

采用Excel 2019和SPSS 23.0进行数据处理和图表绘制, 利用CANOCO软件对土壤环境参数和微生物群落结构进行基于距离尺度的冗余分析(RDA), 表中数据均为平均值±标准偏差, 不同处理之间的多重比较采用LSD最小显著差异法, 图表中的不同字母表示显著性差异(P＜0.05).

基于T-RFLP分析技术, 不同施肥处理下根际和非根际土壤中phoC相对丰度如图 1所示.无论是根际土还是非根际土, 93 bp所代表的T-RF片段都是土壤中phoC微生物群落的优势片段, 在非根际土壤中片段93 bp占比在66.43%~40.02%之间, 其中以CK处理最高; 在根际土壤中, 片段93 bp占比在33.47%~63.63%之间, 其中以F处理最高; 配施生物炭后的处理明显降低了根际和非根际土壤中片段93 bp的占比, 但同时也增加了phoC的相对丰度.与非根际土相比, 片段154 bp在根际土中占比明显降低, 而片段71 bp和74 bp在根际土中的占比有明显的提高.对根际土壤phoC而言, 配施生物炭的处理较对照处理和单施化肥的处理, 增加了原本没有的103bp和105bp T-RFs片段.

图 1

Fig. 1

(a)根际土,(b)非根际土 图 1 不同施肥处理下根际土和非根际土phoC T-RFs相对丰度 Fig. 1 Community structure of relative abundance of phoC gene T-RFs in rhizosphere soil and non-rhizosphere soil under different fertilization treatments

不同施肥处理对根际和非根际土壤中phoD相对丰度的影响如图 2所示, 可以看到, 无论是根际土还是非根际土, phoD酶切所得到的末端限制性片段均比phoC的多.另外, 根际土壤phoD的相对丰度较非根际土壤的复杂, 其phoD酶切得到21个T-RFs, 非根际土phoD酶切得17个T-RFs. 35 bp所代表的片段是根际、非根际土中phoD的优势片段, 片段35 bp所占比例在根际土中处于20.14%~61.49%之间, 在非根际土中占比处于15.88%~41.26%, 根际土中片段35 bp所占的比例较非根际土有明显的提升, 并且无论根际或非根际土中, 该片段的占比均以F处理最高, 在根际土和非根际土中的占比分别达61.49%和43.96%.从不同的施肥处理上来看, 配施生物炭降低了土壤中片段35 bp的占比, 其中以有机肥配施生物炭的处理降低得最为明显. phoD相对丰度中另一优势片段是355 bp, 无论是根际或者非根际土壤, 片段355 bp的占比均表现为施肥增加了该片段的占比, 其中以化肥配施生物炭的FP和FPM处理增加得最多.

图 2

Fig. 2

(a)根际土,(b)非根际土 图 2 不同施肥处理下根际土和非根际土壤phoD T-RFs相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of phoD gene T-RFs in rhizosphere soil and non-rhizosphere soil under different fertilization treatments

不同施肥处理下植株根中phoD相对丰度的差异如图 3所示.从中可以看出, 35 bp所代表的T-RFs片段同样也为植株根中phoD的优势片段, 占比范围在42.73%~75.08%, 其中以有机肥配施生物炭的PP和NPP处理下片段35 bp占比最多, 分别达67.87%和75.08%.植株根中另一优势片段是43 bp, 其中以F处理下其占比最高, 达28.55%, 化肥和有机肥配施生物炭降低了植株根中43 bp的占比.同时, 有机肥配施生物炭使植株根phoD在酶切后得到的末端限制性片段数增多.

图 3

Fig. 3

图 3 不同施肥处理下植株根phoD T-RFs相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of phoD gene T-RFs in plant roots under different fertilization treatments

在本研究中, 利用荧光PCR技术对基因进行定量分析, 为直观展现结果, 本研究采用phoC和phoD拷贝数对10求对数的结果.图 4为不同施肥处理下phoC和phoD拷贝数的变化特征.就phoC而言, 非根际土壤中phoC拷贝数的范围在1.44×10⁷~2.00×10⁸ copies·g^-1之间, 施肥后的拷贝数明显降低, 配施生物炭后进一步降低, 而在根际土壤中各处理之间的变化不显著.就phoD而言, 在非根际土壤中其拷贝数在1.05×10⁷~4.78×10⁸ copies·g^-1之间, 施肥显著降低了phoD的拷贝数(P＜0.05); 而在根际土壤中, 有机肥配施生物炭使得phoD拷贝数有显著增加(P＜0.05), PP和NPP处理较CK分别增加了2.48%和5.16%; 另外, 对于植株根来说, 有机肥配施生物炭后的phoC拷贝数有所增加, 而phoD拷贝数在各处理下较CK均降低.

图 4

Fig. 4

(a)phoC, (b)phoD; 不同小写字母表示不同处理下不同位置基因拷贝数差异显著(P＜0.05) 图 4 不同施肥处理下根际土、非根际土和柠檬根phoC和phoD拷贝数变化特征 Fig. 4 Variation characteristics of phoC geneand phoD gene copy number in rhizosphere soil, non-rhizosphere soil, and lemon root under different fertilization treatments

对T-RFLP群落结构各种群丰度结果进行趋势分析(detrended correspondence analysis, DCA), 发现选择线性模型更为合理.运用冗余分析(RDA)phoC微生物群落结构与土壤基本性质间的相关性(图 5), 其中土壤基本性质包括pH、有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、NO₃^--N、NH₄⁺-N、有效磷和速效钾, 这些指标均采用土壤常规分析方法进行测定.就非根际土壤而言, phoC微生物群落结构排序轴特征值分别为0.5784、0.2259、0.0231和0.0164, 分别解释了57.84%、22.59%、2.31%和1.64% phoC的变化.总磷解释了33.6%的phoC群落变化, 与phoC的群落结构呈极显著相关关系(P＜0.01). phoC的群落结构与NO₃^--N和NH₄⁺-N呈显著相关(P＜0.05).根际土中phoC的群落结构排序轴特征值分别为0.4636、0.2291、0.1422和0.1111, 分别解释了46.36%、22.91%、14.22%和11.11% phoC的变化.与非根际土相比, 根际土phoC的群落结构受到了更多理化性质的调控, 其中与有机质、总氮、碱解氮、NH₄⁺-N、NO₃^--N和pH都呈极显著的相关关系(P＜0.01), 与速效钾呈显著相关关系(P＜0.05).

图 5

Fig. 5

图 5 非根际和根际土壤phoC群落与土壤基本性质的RDA排序 Fig. 5 RDA sequence diagrams of non-rhizosphere and rhizosphere soil phoC gene communities and basic soil properties

运用冗余分析(RDA), 分析phoD微生物群落结构与土壤基本性质间的相关性(图 6).就非根际土壤而言, phoD细菌群落结构排序轴特征值分别为0.3302、0.2670、0.1424和0.1137, 分别解释了33.02%、26.70%、14.24%和11.37% phoD群落变化, 其中phoD细菌群落结构与pH、NO₃^--N、NH₄⁺-N、速效钾、有效磷和有机质都有极显著相关关系(P＜0.01), 与总钾呈显著相关(P＜0.05).根际土phoD细菌群落结构排序轴特征值分别为0.4766、0.2293、0.1677和0.0891, 分别解释了47.66%、22.93%、16.77%和8.91%的phoD群落变化.其中phoD细菌群落结构与pH、总氮、总磷、NH₄⁺-N、速效钾和有机质呈极显著相关关系(P＜0.01), 在非根际土壤和根际土壤, pH值都是phoD细菌群落结构最主要的影响因子.

图 6

Fig. 6

图 6 非根际和根际土壤phoD群落与环境因子变化的RDA排序图 Fig. 6 RDA sequence diagram of changes in soil phoD gene community and environmental factors in non-rhizosphere and rhizosphere

通过皮尔逊相关性分析, phoC和phoD拷贝数与土壤基本性质的相关性如表 6所示, 总体看来, phoC拷贝数与土壤基本性质之间无显著或极显著的相关关系, 而phoD拷贝数与土壤基本性质有较强的相关性, 其中非根际土壤phoD拷贝数与NO₃^--N呈显著的负相关关系(P＜0.05), 根际土壤中, phoD拷贝数与土壤pH呈极显著正相关关系(P＜0.01).

表 6 (Table 6)

表 6 phoC和phoD拷贝数与土壤理化性质的相关性分析1) Table 6 Correlation analysis of phoC and phoD gene copy number and soil physical and chemical properties 项目 区域 全氮 全磷 全钾 碱解氮 NO3--N NH4+-N 有效磷 速效钾 有机质 pH phoC 非根际 0.462 0.361 0.069 0.552 -0.018 0.738 0.466 0.325 -0.229 -0.276 拷贝数 根际 -0.090 -0.088 0.421 0.335 -0.271 -0.572 0.237 -0.001 0.074 -0.005 phoD 非根际 -0.564 -0.497 0.783 -0.303 -0.884* -0.367 -0.449 -0.402 -0.561 0.719 拷贝数 根际 0.318 0.232 -0.592 -0.344 -0.744 -0.690 -0.352 -0.391 0.592 0.922** 1)*表示在0.05级别(双尾), 相关性显著, **表示在0.01级别(双尾), 相关性极显著

表 6 phoC和phoD拷贝数与土壤理化性质的相关性分析1) Table 6 Correlation analysis of phoC and phoD gene copy number and soil physical and chemical properties

本研究利用qPCR对不同施肥处理phoC和phoD的拷贝数进行定量分析, 结果表明, 在非根际土壤中, 配施生物炭后phoC和phoD的拷贝数均有所降低, 原因可能是配施生物炭增加了土壤有效磷含量, 缓解了微生物的磷饥饿, 减少了对磷酸酶的分泌, 从而减少了相应的编码基因.同时通过phoC和phoD拷贝数与土壤基本性质的相关性分析, 可以看到phoC拷贝数与pH呈负相关关系, 而phoD拷贝数与pH呈正相关关系, 这是因为phoC是编码酸性磷酸酶的基因, 而phoD是编码碱性磷酸酶的基因, 酸性磷酸酶的最适pH区间在4~6, 碱性磷酸酶的最适pH区间在8~10^[25], 随着土壤pH的升高, 酸性磷酸酶活性降低, 编码酸性磷酸酶的基因phoC拷贝数也随着减少, 相反, 土壤pH的增加使得碱性磷酸酶活性增强, 从而也增加了相应的phoD拷贝数.另外, 从phoC和phoD T-RFs相对丰度图中也可以看出, 根际土壤中的末端限制性片段数要高于非根际土壤(图 1和图 2), 表现出了明显的根际效应.这是因为植物根系释放的各种分泌物, 可以为微生物提供营养来源, 从而使微生物富集在根际土壤中.大量研究已表明根际土壤微生物丰度和活性远高于非根际土壤^{[26, 27]}, 其中解磷微生物的分布表现出强烈的根际效应^{[28, 29]}, 因此表现为根际土中编码磷酸酶的phoC和phoD拷贝数多于非根际土.

对于phoC来说, 从T-RFs相对丰度可知(图 1), 在非根际土壤中CK处理片段93 bp是绝对的优势片段, 而化肥和有机肥配施生物炭处理下减小了该片段相对占比的同时又增加了末端限制性片段数.结合RDA分析, 在非根际土壤中, 总磷解释了33.6%的phoC的群落变化, 与phoC微生物群落结构呈极显著相关关系(P＜0.01).这可能是因为在施肥过后, 缓解了土壤中存在的磷饥饿的问题, 植物因此减少对磷酸酶的分泌, 这可以从在非根际土壤中施肥处理的phoC拷贝数比CK处理低得到印证.磷饥饿的缓解同时又促进了其他微生物的繁殖, 从而增加了土壤微生物的多样性, 影响了微生物的群落结构组成, 增加了施肥处理与CK处理之间phoC的群落结构差异.而在根际土壤中, 通过根际土壤phoC与土壤理化性质变化的RDA分析发现, 根际土phoC微生物群落结构受到了更多理化性质的调控, 其中与有机质、总氮、碱解氮、NO₃^--N、NH₄⁺-N和pH都呈极显著的相关关系(P＜0.01), 与速效钾呈显著相关关系(P＜0.05).这可能是因为非根际土中解磷微生物相较于根际土少^[27], 相应地磷酸酶活性也低, 磷素不能被有效利用, 从而使得磷素成为非根际土中phoC主要的阻碍因子.相反, 根际土壤由于受到根际效应的强烈影响, 土壤中磷的有效性大大增加, 缓解了磷素的匮乏状况, 并且根际土中微生物相对丰度更高, 大大增强了根际土壤中养分的竞争关系, 从而导致了更多的养分限制, 使得phoC微生物群落结构受到更多的理化性质的调控, 而不同处理之间的理化性质都存在一定的差异, 所以在根际土壤中各处理phoC微生物群落结构的差异更大.

对于phoD来说, 其微生物群落结构明显比phoC微生物群落结构更为复杂, 这是因为phoC是酸性磷酸酶的编码基因, 酸性磷酸酶主要是由植物合成, 而phoD是碱性磷酸酶的编码基因, 碱性磷酸酶主要源自土壤细菌、真菌和其它的土壤微生物^[30], 因此土壤中带有phoD的微生物种类较phoC更为丰富.根据phoD微生物群落结构与土壤基本性质间相关性分析, 非根际土壤phoD微生物群落结构与pH、NO₃^--N、NH₄⁺-N、速效钾、有效磷和有机质都有极显著相关关系(P＜0.01), 与总钾呈显著相关(P＜0.05).根际土壤phoD微生物群落结构与pH、总氮、总磷、NH₄⁺-N、速效钾和有机质呈极显著相关关系(P＜0.01).说明土壤中phoD微生物群落结构同时受到了多种环境因子的调控.无论在非根际土壤或是根际土壤, pH对phoD微生物群落结构的影响最为强烈, 说明pH是影响phoD微生物群落活性的主要环境因子.CK和F处理的phoD微生物群落结构较为类似, 而配施生物炭后, 其群落结构产生了较大的分异.这可能是因为生物炭施用后, 由于其自身特点, 为微生物的生存提供了有利条件, 有利于原本处于竞争劣势的微生物的生存繁殖, 进而改变土壤中phoD微生物群落结构.另外, phoD以钙作为辅助因子^[31], 而生物炭含有丰富的钙离子, 所以可以增加phoD拷贝数, 并且配施生物炭后可以增加酸性土壤的pH值, 大量研究表明, 土壤pH值的增加, 有利于增加phoD拷贝数^[32].本研究phoD拷贝数与土壤基本性质之间的相关性分析结果也显示, 在根际土壤中, phoD拷贝数与土壤pH呈极显著正相关关系(P＜0.01).所以生物炭施用后增加了phoD的拷贝数和末端限制性片段数, 进而形成更加稳定复杂的phoD微生物群落结构, 增强有机磷矿化的微生物潜力.

土壤微生物代谢生长繁殖需要C、N和P等多种元素, 所以在土壤中碳氮磷元素的循环过程彼此间密切相关, 竞争和协作是植物和微生物、微生物和微生物之间的重要特性之一^[33].研究表明, 在土壤环境中添加外源碳, 比如秸秆、生物炭和有机肥等, 可以增加土壤中微生物的丰度, 微生物的增加促进了土壤的养分转化和相关酶的分泌, 提高相关土壤养分的有效性; 同时还对土壤微生物的群落结构产生重要影响, 促进多功能性微生物的生长, 从而促进土壤中养分的循环利用^[34].在本研究中, 生物炭的添加, 增加了土壤中可利用的碳源, 改善了微生物的生存环境, 促进了微生物的生长繁殖, 微生物在利用碳氮元素的同时也增加了对磷素的需要, 从而通过分泌磷酸酶矿化分解土壤中利用率较低的有机磷, 释放出植物和微生物可以直接利用的可溶性磷酸盐, 来维持自身增殖的需要.

(1) 根际土和非根际土中, phoD微生物群落结构比phoC更复杂, 93 bp和35 bp分别是phoC和phoD微生物群落的优势片段, 化肥和有机肥配施生物炭后增加phoC的相对丰度; 根际土phoC和phoD的微生物群落结构均比非根际土复杂.

(2) 在非根际土壤中, 化肥和有机肥配施生物炭后phoC拷贝数均有所降低, FP、FPM、PP和NPP处理较CK分别降低了9.18%、11.46%、10.97%和13.76%; 在根际土壤中, 有机肥配施生物炭的PP和NPP处理的phoD的拷贝数有所增加, PP和NPP处理较CK分别增加了2.48%和5.16%; 在植株根中, 有机肥配施生物炭增加了phoC拷贝数, 而所有处理较CK均降低了phoD拷贝数.

(3) 总磷是影响非根际土壤phoC微生物群落结构的主要因子(P＜0.01), 而在根际土壤, phoC微生物群落结构受到更多土壤性质的调控, 不同处理间根际土phoC微生物群落结构差异较非根际土更明显.在根际和非根际土壤中, phoD微生物群落结构均受到多个土壤基本性质的调控, pH是影响phoD拷贝数最关键的环境因子, 且phoD拷贝数与土壤基本性质有更强的相关性.