2021, Vol. 42
2. 中国制浆造纸研究院, 北京 100020;
3. 北京市北运河管理处, 北京 101100
2. China National Pulp and Paper Research Institute, Beijing 100020, China;
3. Beijing North Canal Manage Office, Beijing 101100, China
沉积物细菌是水生生态系统重要组成部分[1], 具有极其丰富的基因多样性, 并在能量流动[2, 3]和碳、氮、硫、有毒有害污染物分解和转化过程中发挥重要作用[4~8].沉积物细菌群落结构的空间分布格局变化是深入研究沉积物生物多样性产生和维持机制的前提[9].环境选择和扩散过程是水生生态系统细菌群落结构多样性构建的两个基本竞争过程, 二者对细菌在空间变化的贡献率随研究尺度的变化, 结论有所差异[10~15].不同于大型动植物生物地理学模式研究, 沉积物中细菌的多样性在空间尺度及其构建机制方面的研究非常有限[16].
再生水在缓解城市河湖用水方面发挥重要作用, 但再生水向淡水生态系统的释放很大程度上改变了受纳水体的生物多样性及其地理分布格局[17, 18].这种非常规水源携带的污染物通过低剂量和长期暴露方式影响河流生态系统生物多样性[19, 20], 导致鱼类和底栖动物等高级营养结构逐渐退化, 作为分解者的细菌群落高度发达的特点[21, 22].这种由于再生水引起的物种多样性丧失的现象在特大聚集城市和城市下游集约化农业区的河道尤为严重[23].已有研究证明扩散作用在较小地理尺度下的自然河流中占主导, 但在高度人工化的水生态系统中, 再生水通过补给口与上游来水汇流, 形成小尺度地理空间上明显的环境梯度, 物种分类作用增强[15].基于污染环境下的精细地理尺度的沉积物细菌结构空间变化分析较少.基于此, 本文利用高通量测序技术分析京津冀精细地理尺度下的北运河沉积物细菌群落结构空间变化规律, 通过揭示高度人工化的再生水补给河道沉积物细菌在污染胁迫下的群落变化机制, 以期为城市河道水生态恢复提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况北运河源于北京市昌平区及海淀区一带, 后向南流入通州区, 流经河北, 在天津市汇入海河, 全长260 km.流域总面积为6 166 km2, 其中, 山区面积952 km2, 占16%, 平原面积5 214 km2, 占84%.研究区多年平均降雨量643 mm, 降雨主要集中在6~9月, 约占全年的84%[24].作为京杭大运河的重要组成部分, 北运河主要流经城市化水平高的北京、天津, 人口、产业密集, 是海河流域骨干行洪排涝河道之一[24].北运河流域土地利用类型和污染源差异导致河流地理空间尺度上存在潜在环境梯度, 其次, 上游流经北京城区, 93%的水源来源于城市人口消耗的经处理废水, 4%是未经处理的废水; 位于京津之间的中游地区主要流经农田, 农业化肥和农药污染是中游地区主要的污染物; 下游进入天津地区, 接受来自天津经处理和未处理的废水[25].由于地处平原地区, 水流流速缓慢致使水流中裹挟的浊物逐步沉淀, 最终导致河道淤积严重[26].
1.2 采样点布设与样品采集2019年9月在研究区按照均匀布点并兼顾考虑流域尺度点源与非点源污染类型分布原则设置并采集河道新鲜沉积物(图 1).其中, 1~5号为上游样点(upstream samples, US)、6~10号中游样点(midstream samples, MS)和11~14号为下游样点(downstream samples, DS).同时采用全球定位系统(GPS, Garmin Legend, Garmin USA)记录采样点位置.将采集的新鲜沉积物放入预先灭菌的铝盒中, 冰袋保存立即带回室内.沉积物样品冷冻干燥后, 剔除植物、昆虫和石块杂质, 混合均匀后研磨, 过60目筛, 装入自封袋中, -20℃避光保存备用.
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图 1 北运河采样点分布示意 Fig. 1 Sampling locations in the North Canal River |
沉积物中的氨氮(NH4+-N)和亚硝酸盐氮(NO2--N)的测定采用氯化钾溶液提取分光光度法; 总氮(TN)的测定采用过硫酸钾消解紫外分光光度法; 总磷(TP)的测定采用钼酸盐分光光度法; 总有机碳(TOC)的测定采用重铬酸钾氧化分光光度法; 阴阳离子(Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3--N和SO42-)的测定采用离子色谱仪.
1.3 高通量测序将采集好的新鲜未经处理的沉积物样品取适量于1.5 mL离心管中, 送至诺禾致源科技有限公司进行微生物PCR扩增和16S rDNA高通量测序, 扩增引物为: 314F(CCTAYGGGRBGCASCAG); 806R(GG ACTACNNGGGTATCTAAT), 扩增区间为V3-V4区.
1.4 数据处理与分析 1.4.1 序列分析将测序得到的OTU序列均按97%的序列相似度对有效序列进行比对, 获得界、门、纲、目、科、属、种和OTUs这8个不同分类单元下丰度统计数据矩阵.
1.4.2 数据分析利用PRIMER5.0计算Bray-Curtis相似性矩阵和相似性百分比(SIMPER), 分析组间和组内平均秩相似性差异.在此基础上, 基于Bray-Curtis相似性的非度量多维尺度分析(NMDS)和Global检验.利用SPSS 24.0进行皮尔逊相关分析、单因素ANOVA分析、判别分析和独立样本Kruskal-Wallis检验.利用R语言进行邻体矩阵主坐标分析(PCNM)生成6个空间向量(V1~V6).利用Canoco5.0进行向前选择和方差分解分析, 在方差分解分析中, 环境变量解释变异量[E]和空间变量解释变异量[S], 总解释变异量[E+S].基于环境和空间估算, 将沉积物细菌群落组成的总变化分为4个变异部分：只有环境变量能解释的变异量[E/S], 只有空间变量能解释的变异量[S/E], 为环境变量和空间变量共享的变异量[E∩S]和未能解释的变异量1-[E+S].利用Origin 2018绘制物种丰度热图和环境因子箱图.
2 结果与分析 2.1 北运河沉积物细菌群落空间变化模式为分析北运河沉积物细菌群落空间变化模式, 将高通量测序的数据经过预处理后, 绘制不同分类水平NMDS分布格局图, 结合Global检验分析上、中、下游群落在NMDS分布上的差异性(图 2).从图 2可知, 较高的分类水平具有更均质化的分布格局, 而较低分类水平NMDS分布图中不同空间样点具有更加清晰的分布界限和范围.具体表现为：界和门水平的高级分类单元群落间差异不显著(P>0.05), 而纲、目、科、属、种和OTUs水平群落结构在上、中、下游呈现差异显著(P < 0.05).进一步分析Global检验的R值在不同分类水平的变化趋势, 从高级分类单元到低级分类单元依次为0.138、0.267、0.218、0.291、0.511和0.458, 同样表明这种差异性随分类水平的降低而增强, 物种分离程度越来越大.
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Global显著性检验：*表示P < 0.1, **表示P < 0.05, ***表示P < 0.01; 图中绿色表示US; 蓝色表示MS; 红色表示DS 图 2 北运河沉积物微生物群落不同分类水平NMDS分析 Fig. 2 NMDS analysis of different classification levels of microbial communities in the sediments of the North Canal River |
采用Global检验和SIMPER分析表征不同群落间差异和群落内相似性(表 1).从分析结果可知, 随着分类水平的降低, 空间分区间的组间差异逐渐增大, 而组内相似性逐渐减小.具体而言, 除界和门水平之外, 其余等级上、中、下游群落结构两两检验结果均存在显著差异(P < 0.05).OTUs水平具有最高的组间差异系数(47.52%), 较纲水平差异性系数增加158%, 种水平具有最高的组内相似性系数(72.66%), 较纲水平降低了12.26%.组间差异性系数较组内相似性系数在表征群落结构差异方面的敏感性更高.
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表 1 基于Bray-Curtis相异性的区域间不同分类水平沉积物细菌群落变化分析1) Table 1 Analysis of Bray-Curtis dissimilarity based on the changes in bacterial communities in sediment of different classification levels between regions |
2.3 空间变化模式对细菌群落组成的影响
基于群落组成丰度的单因素ANOVA分析筛选上、中、下游具有显著差异的类群(图 3).从图 3可以看出, 不同分类水平的筛选结果较为一致, 如群落组成差异显示红细菌目(Rhodobacterales)及其低级分类水平中优势的红细菌科(Rhodobacteraceae)和优势的大不里士菌属(Tabrizicola)均表现为显著差异及其低级分类水平中的优势的柄杆菌科(Caulobacteraceae)和苯基杆菌属(Phenylobacterium)同样均表现为显著差异; 脱硫杆菌目(Desulfobacterales)及其低级分类水平中的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)和硫杆球菌属(Desulfococcus)在目、科和属水平均具有显著差异; 厌氧绳菌目(Anaerolineales)和厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)则在目和科水平具有显著差异.
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图 3 不同分类水平物种组间差异显著热图 Fig. 3 Heat map of significant differences between species with different classification levels |
从群落丰度在空间的变化模式看, 目水平弗兰克氏目(Frankiales)、红细菌目(Rhodobacterales)和柄杆菌目(Caulobacterales), 科水平伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、鱼孢菌科(Sporichthyaceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)和柄杆菌科(Caulobacteraceae), 属水平的苯基杆菌属(Phenylobacterium)、多核菌属(Polynucleobacter)、大不里士菌属(Tabrizicola)和甲基胞囊菌属(Methylocystis)均表现出上游显著富集、中游次之、下游显著减少的变化模式.其次, 目水平厌氧绳菌目(Anaerolineales)和脱硫杆菌目(Desulfobacterales), 科水平的厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)和脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae), 属水平的脱氮单胞菌属(Denitratisoma)、黄杆菌属(Luteolibacter)和脱硫球菌属(Desulfococcus), 种水平的双歧脱硫球菌(Desulfococcus_biacutus)、产气梭状芽孢杆菌(Clostridium_gasigenes)、产碱假单胞菌(Pseudomonas_alcaligenes)和奥斯陆莫拉菌(Moraxella_osloensis)均表现为中游显著富集、上下游显著减小的空间变化模式.
2.4 细菌群落空间变化的环境解释为分析环境因子对细菌群落空间变化的影响, 采用判别分析及回代验证结果逐步判别筛选出Ca2+、SO42-和TOC共3个指标在上游、中游和下游空间变异显著(图 4), 且下游的Ca2+、SO42-和TOC浓度高于上游和中游地区.进一步分析各环境因子相关关系(表 2), 可知沉积物Ca2+、SO42-和TOC与NH4+-N、NO2--N、TN、Mg2+呈现显著正相关关系, 表明这些环境因子具有较为相似的空间变化趋势.进一步根据NMDS排序的第一轴(X轴)与各环境因子相关关系识别环境因子与微生物群落的关系(表 2), 从分析结果可以看出, NO2--N、Ca2+、SO42-与微生物群落的变化呈现显著负相关关系, 其次, TOC与NH4+-N和Mg2+与微生物群落的变化也具有较高的相关程度, 表明上游和中游段沉积物微生物净化过程主要以氮、碳等主要的生物地化循环及盐分等次要生物地化循环过程为主, 下游净化效果较差.
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*表示P < 0.05; **表示P < 0.01; ***表示P < 0.001 图 4 环境因子判别分析结果箱图 Fig. 4 Box plot of environmental factor discriminant analysis results |
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表 2 相关系数矩阵1) Table 2 Pearson correlation coefficient matrix |
2.5 细菌群落空间变化模式形成机制
通过向前选择获取了6个环境变量(TP、Na+、NH4+、Ca2+、NO3--N和SO42-)和3个空间向量(V1、V2和V5)对物种不同分类水平进行方差分解分析(图 5).由方差分解结果可知, 在目、科、属和种水平上, 所有因素共同解释了沉积物细菌群落变异分别为78.8%、82.6%、82.9%和81.0%.其次, 环境因子对不同分类水平沉积物细菌群落多样性的构建贡献率中均具有显著影响.其中, 环境因子对目、科、属和种水平分别占总变异量的57.8%([E]：P=0.024)、57.7%([E]：P=0.018)、57.4%([E]：P=0.020)和56.9%([E]：P=0.026); 与环境因子相比, 空间因子可以解释变异量要低得多, 空间因子对不同分类水平沉积物细菌群落结构也具有显著影响, 在目、科、属和种水平分别占总变异量的40.2%([E]：P=0.002)、38.5%([E]：P=0.004)、38.7%([E]：P=0.004)和41.8%([E]：P=0.002).
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图片左侧数值=[E/S]; 中间数值=[E∩S]; 右侧数值=[S/E]; 下方的数值=1-[E+S] 图 5 基于环境和空间因子对不同分类水平沉积物细菌群落相对作用的方差分解 Fig. 5 Variation in composition based on the relative effects of environmental and spatial factors on the bacterial communities of different classification levels |
细菌群落结构和功能特征是与环境长期适应的结果[27~29].当细菌群落生境受到再生水补给扰动时, 河道沉积物中细菌群落组成特征和功能特性均可产生时空变异[18, 19].补给口尺度再生水扰动对河道沉积物细菌群落的影响范围主要发生在距补给口1 200 m的范围内[19].在再生水与上游来水径向渐变混合过程中, 沉积物微生物净化过程主要与碳、氮和磷等主要的生物地化循环有关, 并表现为距补给口2 000 m处细菌群落与上下游趋于相似[18].再生水中高浓度的碳、氮、磷含量、缓慢的水流和水体内部较长的更新周期是导致补给口尺度细菌群落空间变化的直接原因.京津冀段260 km长的北运河由于受到人类活动强烈干扰, 从而有别于自然河道[30].河岸带不同地区土地利用形成潜在非点源污染, 河道上、中游密集和广泛分布污水处理厂排污口点源污染及上、中、下游河道生态修复措施综合作用形成了沿河流潜在环境梯度[31, 32].其中, 季节性降雨对各类污染物具有稀释作用[33].受水流持续扩散和污染物源汇动力学同质化效应影响, 较小的地理尺度下扩散主导的河流细菌群落多样性形成机制使得细菌群落结构在内表现出较高相似性[23], 从而间接使影响密集分布的排污口尺度下细菌群落多样性形成机制中环境选择作用弱化.因此, 受到人类活动强烈干扰的北运河, 关注其再生水汇入在区域或流域尺度上对河道水质与浮游细菌的群落的影响是较排污口尺度影响更为重要的研究方向.
3.2 北运河再生水补给河道沉积物细菌群落空间变化分析本研究中基于高通量测序结果的细菌群落结构在京津冀区域尺度空间变异分析, 显示区域尺度再生水汇入对河道沉积物细菌群落的影响导致细菌群落在上、中、下游地理空间尺度上表现出显著的空间变化模式.其中, 流经天津段接受未处理和经处理废水则是导致下游盐分离子和TOC显著升高的直接原因, 高度人工化的城市河道生态修复工程对水质和沉积物的净化作用是导致上、中游无机氮磷营养元素、盐分离子和TOC显著降低的间接原因, 二者综合作用影响微生物细菌群落空间变化.
北运河上游河岸带植被生态修复工程与湿地植物根际典型微生物相关类群对再生水水质特性中富含的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、TDS等盐分离子和TN、NH4+-N等, 多形态无机氮的净化是导致以碳、氮、硫等主要的生物地化循环有关的菌属在上游显著富集、中游次之、下游显著减少的主要原因.已有研究表明弗兰克氏菌是与植物具有共生固氮作用的典型根际微生物, 与沉积物中氮循环具有密切关系[34].作为典型的促进植物生长的根际微生物, 弗兰克氏目(Frankiales)中的伯克氏菌科(Burkholderiaceae)不仅参与氮循环[35], 同时包含了环境中腐生生物、植物病原体、致病菌及人和动物的主要病原体[36].弗兰克氏目(Frankiales)中鱼孢菌科(Sporichthyaceae)属于兼性厌氧菌, 主要参与典型淡水生态系统中支系与低分子量碳转化[37].红细菌目(Rhodobacterales)是可使用有机底物和硫化物的异养微生物, 高度多样化的红细菌目(Rhodobacterales)可参与有氧呼吸、厌氧发酵、硫氧化、固碳和固氮等新陈代谢过程, 从而与沉积物碳、氮和硫循环中发挥重要作用[38].红细菌目(Rhodobacterales)中的红细菌科(Rhodobacteraceae)是水环境中具有较高有机化合物代谢多样性的异养细菌, 借助藻类分泌物和裂解物在水环境细菌群落中大量繁殖并占据主导地位[39].柄杆菌目(Caulobacterales)与柄杆菌科(Caulobacteraceae)因其通常生活在寡营养水生环境中, 进一步佐证上游沉积物细菌群落具有较高的碳、氮生物地化循环效能[40], 其中, 苯基杆菌属(Phenylobacterium)所有菌株仅在氯代唑、安替比林等人工化合物上生长[41], 表征其可能来源于植被带养护和高尔夫草坪维护过程中除草剂等非点源污染和再生水中痕量持久性抗生素类点源污染.北运河中游半人工化侧砌、底砌工程导致再生水与包气带地下水水力交换过程有别于上游自然河道[42], 进而影响沉积物细菌类群对再生水中富含的与碳、氮和硫等主要生物地化循环有关的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、TDS等盐分离子和TN、NH4+-N等多形态无机氮的净化, 导致菌属类型主要并表现为中游富集、上下游显著减少的空间变化模式.其中, 已有研究证明污水处理厂河道补给可增加沉积物中厌氧绳菌目(Anaerolineales)的丰度, 并在碳水化合物和肽的厌氧代谢中发挥重要作用[43].脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)、脱硫球菌属(Desulfococcus)、双歧脱硫球菌(Desulfococcus_biacutus)在中游显著富集, 表征这些微生物在中游沉积物硫循环中发挥重要功能[44~47].而黄杆菌属(Luteolibacter)、产气梭状芽孢杆菌(Clostridium_gasigenes)和奥斯陆莫拉菌(Moraxella_osloensis)多表现为腐物寄生菌等, 多为呼吸道分泌物或人和动物肠道致病菌[48~50], 表征再生水中病原微生物的控制仍需加强[51].
3.3 北运河再生水补给河道沉积物细菌群落空间变化机制作为河流生态系统细菌群落结构多样性构建的两个基本竞争过程, 环境选择和扩散过程对细菌在空间变化的贡献率随研究尺度的变化结论有所差异[10~15].通过水流持续扩散和污染物源汇动力学同质化效应影响, 扩散作用在较小地理尺度下的自然流动河流中占主导.在高度人工化的水生态系统中, 再生水通过补给口与上游来水汇流, 形成小尺度地理空间上明显的环境梯度, 物种分类作用增强[15], 从而使得上、中、下游群落结构不仅具有最高的组间差异系数, 而且具有较高的组内相似性系数.本研究分析结果显示精细地理尺度作用下的高度人工化的城市河道沉积物细菌群落多样性构建过程是由环境选择和地理扩散共同作用为主, 且环境选择在不同分类水平的细菌群落空间变化中均占主导作用.
4 结论(1) 北运河沉积物细菌群落空间变化模式和群落结构差异性分析结果均表明：较高的分类水平具有更均质化的分布格局; 而较低分类水平空间样点具有更加清晰的分布界限和范围, 且这种分布界限随分类水平的降低越来越清晰; 组间差异性同样随着分类水平的降低而增强.
(2) 空间变化模式对细菌群落组成的影响结果表明：弗兰克氏目(Frankiales)和红细菌目(Rhodobacterales)等典型根际微生物表现为上游显著富集, 与碳氮硫循环相关的厌氧绳菌目(Anaerolineales)和脱硫杆菌目(Desulfobacterales)表现为中游富集, 苯基杆菌属(Phenylobacterium)表现为上游富集, 以及产气梭状芽孢杆菌(Clostridium_gasigenes)和奥斯陆莫拉菌(Moraxella_osloensis)等致病菌表现为中游显著富集.
(3) 北运河沉积物细菌群落多样性构建机制分析：沉积物中与再生水水质特性具有密切关系的Ca2+、SO42-和TOC与NH4+-N、NO2--N、TN、Mg2+间存在显著正相关关系, 这些环境因子在空间上均表现为下游浓度高于上游和中游地区.典型环境因子与细菌群落的负相关关系表明其在净化再生水水质特性中富含的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、TDS等盐分离子和TN、NH4+-N等多形态无机氮过程中发挥重要作用.总的来看, 北运河沉积物细菌群落多样性构建过程是由环境选择和地理扩散共同作用为主, 且环境选择在不同分类水平的细菌群落空间变化中均占主导作用.
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