微生物是水域生态系统的重要组成部分, 既受到水域水质因子的影响, 又对水域水质有着反作用^[1], 因此, 水域微生物群落状况与水质状况有着密切的联系^[2], 并能够反映特定水体的水质状况^[3].小流域是农业面源、工业源发生和汇集的源头, 小流域的水质状况将直接影响着整个流域的水质安全.目前关于小流域的研究主要集中在对小流域径流氮磷输出^[4]、盐基离子排放^[5]、抗生素污染分布^[6]和溶解性碳的来源特征等^[7], 而对小流域水体微生物群落特征及影响因素的研究还未见报道.长江流域水系发达, 小流域众多, 因此, 小流域在整个长江流域生态环境保护中起着不可或缺的作用, 而随着长江上游生态保护屏障建设上升为国家战略, 对长江上游小流域污染的防控与治理就显得更为迫切.因此, 本文以长江上游典型的小流域——重庆市涪陵区李渡新区小流域为研究对象, 对小流域内流经不同污染源的水体断面进行采样分析, 并结合高通量测序技术(Illumina)分析了小流域内径流水体及受纳水体微生物的群落特征, 考察了微生物的群落特征与水体理化因子的关系, 并探讨小流域水体微生物组成对受纳水体微生物组成的可能影响, 其结果对小流域水环境质量和生态保护具有重要的指导意义, 同时也对长江上游水环境保护及管理提供重要借鉴.

李渡新区位于涪陵西部, 距涪陵主城12 km, 是涪陵规划的新城区和工业园区, 属中亚热带湿润气候, 地势由西北向东南升高.常年平均气温18.1℃, 平均降水量1 072 mm, 海拔175~980 m之间, 沿江优势明显, 土壤以灰棕紫色水稻土为主.农作物主要为水稻、玉米和红苕等^[8].李渡工业园区重点发展食品医药、新材料、装备制造等.

本文结合涪陵李渡新区小流域不同河段流经区域的污染物排放特征分别在支流水体流经农业耕作区、工业园区、入江口等水域设置采样点, 并根据采样位点对采集的水样进行分类, 采样点上游河段仅流经农业耕作区的归入A组, 包括XLY1、XLY2、XLY4和XLY6等4个采样点位.采样点上游河段先流经农业耕作区又流经工业园区的归入B组, 包括XLY3、XLY10和XLY11等3个采样点位.由于支流河段水深小于1 m, 且河宽小于5 m, 因此只在河中央水面下0.5 m处采集水样.在入江口干支流汇集后采集的样品归入C组, 包括XLY5、XLY7、XLY8和XLY9等4个采样点位.入江口每个采样点位分别在水面下0.5 m处、河底以上0.5 m处采样水样, 混合后代表该采样点位的水样.采样时间为2018年11月29~30日, 采样时段为下午14:00~17:00.采样点分布见图 1.样品采集时, 使用灭菌的聚四氟乙烯塑料瓶在水面下0.5 m处采集水样, 用于微生物分析的水样通过0.22 μm的滤膜进行抽滤, 过滤好后的滤膜放置在无菌离心管中于-80℃保存, 并使用15 kg干冰送测.测定溶解性有机碳(dissolved organic carbon, DOC)的水样经0.45 μm的滤膜过滤后, 装入普通玻璃样品瓶中, 冷藏避光保存.测定水体理化性质水样用尼龙筛网过滤去除杂质后, 冷藏保存待测.

图 1

Fig. 1

图 1 李渡新区小流域水体采样点示意 Fig. 1 Schematic diagram of water sampling points in the small watershed of the Lidu New Area

水样pH采用pH计直接测定, 铵态氮、硝态氮和亚硝态氮采用紫外分光光度法测定.水样经消解后, 用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-3000)测定水样中Mn²⁺、As³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Cr⁶⁺的质量浓度.水样化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)采用化学需氧量消解仪法测定.水样DOC采用总有机碳分析仪测定.

用于微生物分析的样品送到上海派森诺生物科技股份有限公司进行微生物组总DNA提取, 目标片段PCR扩增, 扩增区域为标准细菌16S V3-V4, 引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT), 产物回收纯化、荧光定量、文库制备及Illumina MiSeq高通量测序.

序列数据统计：首先对样品进行平行测序, 随后采用滑动窗口法对双端序列做质量初筛, 利用FLASH软件对重叠碱基进行配对连接, 运用QIIME软件识别疑问序列, 调用USEARCH工具剔除嵌合体序列, 从而获得样本有效序列, 最后对其进行生物信息统计分析.

OTU分析数据：运用QIIME软件, 调用UCLUST这一序列比对工具, 对取得的序列按相似度为97%的序列进行归并和OTU划分, 并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列, 进行生物信息统计分析.对OTU丰度矩阵中的全体样本按最低测序深度水平进行随机重抽样, 用QIIME软件获得每个样本Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数.使用QIIME软件, 获取各样本在门、纲、目、科和属水平上的组成和丰度.

典型对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)通过CANOCO FOR WINDOWS 4.5进行.相关性分析采用SPSS13.0进行.数据和图表采用Excel及CANOCO FOR WINDOWS 4.5进行, 多重比较采用LSD法检验.

A、B和C这3组水样的基本理化性质见表 1.总体上水质偏弱碱性, 水体总磷均大于0.02 mg ·L^-1, 且水体中仅硝态氮的浓度就已经大于0.2 mg ·L^-1的临界值.说明3个区域水体均存在水体富营养化的风险.刘远模^[8]对李渡新区主要农作物的施肥情况进行的调查也发现, 该区域氮肥施用过多, 部分氮素养分随径流进入水体, 引起水体富营养化.同时, 城镇生活污水的排放, 也加剧了小流域水体富营养化的进程.

表 1 (Table 1)

表 1 水体的基本理化性质1) Table 1 Basic physical and chemical properties of the water samples 项目 A组 B组 C组 pH 8.26±0.25a 8.61±0.51a 8.21±0.38a 氨氮/mg·L-1 0.11±0.02a 0.08±0.05ab 0.07±0.01b 硝态氮/mg·L-1 0.88±0.16a 0.99±0.40a 0.82±0.54a 亚硝态氮/mg·L-1 0.06±0.01a 0.11±0.03b 0.03±0.01c 总磷/mg·L-1 0.09±0.08a 0.10±0.07a 0.04±0.02a 磷酸盐/mg·L-1 0.06±0.05a 0.07±0.05a 0.02±0.01a 硫化物/mg·L-1 0.02±0.01a 0.03±0.02a 0.02±0.01a DOC/mg·L-1 5.94±3.67ab 6.19±2.12b 3.39±1.28a Mn2+/mg·L-1 0.07±0.09a 0.03±0.01a 0.02±0.01a As3+/mg·L-1 0.01±0.01a 0.02±0.02a 0.01±0.02a Fe3+/mg·L-1 0.22±0.19ab 0.13±0.04a 0.35±0.23b Zn2+/mg·L-1 0.03±0.01a 0.01±0.00b 0.03±0.02a Pb2+/mg·L-1 0.02±0.01a 0.02±0.02ab 0.03±0.01b Cu2+/mg·L-1 0.00±0.00a 0.00±0.00a 0.00±0.00a Ni2+/mg·L-1 0.01±0.00a 0.00±0.00b 0.00±0.00b Cr6+/mg·L-1 0.01±0.00a 0.01±0.01a 0.00±0.00a 1)a、b和c表示组间差异是否显著, 相同字母表示组间差异不显著, 不同字母表示组间差异显著

表 1 水体的基本理化性质1) Table 1 Basic physical and chemical properties of the water samples

水体理化性质在A组和B组样品之间存在显著性差异的因子为亚硝态氮、Zn²⁺和Ni²⁺, 其中A＞B的因子为Zn²⁺和Ni²⁺, 说明Zn²⁺和Ni²⁺主要来源于农业源的贡献.A＜B的因子为亚硝态氮, 说明亚硝态氮主要来源于工业源的贡献.Zn²⁺是水稻、玉米等农作物不可或缺的微量元素, 流域内粪肥和专用锌肥的施用增加了Zn²⁺通过地表径流进入临近水体的风险^[9].此外, 粪肥、化肥及农药的施用, 也增加了农区土壤中Ni²⁺的积累^[10].水体理化性质在B组和C组样品之间存在显著性差异的因子为亚硝态氮、DOC、Fe³⁺和Zn²⁺.B＞C的因子包括亚硝态氮和DOC, 说明李渡新区小流域是长江干流水体中亚硝态氮和DOC的重要来源.水体理化性质如pH、硝态氮、总磷、磷酸盐、硫化物、Mn²⁺、As³⁺、Cu²⁺和Cr⁶⁺在A、B和C组水样之间无显著差异, 而亚硝态氮含量存在显著性差异(P_AB=0.03; P_AC=0.02; P_BC=0.02).

样品中OTU交叠情况见图 2.从中可以看出, 3组水样中含有的微生物种类分别为3 724个、2 610个和2 993个.A组和B组共有种类1 678个, A组和C组共有种类1 662个, B组和C组共有种类1 254个, A、B和C组共有种类1 011个.去除丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTUs, 分类出的OTUs包含16 220个门、16 200个纲、15 885个目、14 490个科和12 328个属.

图 2

Fig. 2

图 2 OTUs交叠Venn图 Fig. 2 OTUs overlapping Venn diagram

3组水样中微生物占比数据对采样点分组的PLS-DA偏最小二乘法判别分析的结果见图 3, 其中每个样点代表一个样本, 颜色相同的样点属于同一分组, 相同分组的样点以椭圆标出.同一分组的样点彼此之间距离越近, 同时不同分组的样点之间的距离越远, 表明分组效果越好.从图 3中可以看出, A组内XLY1与其他3个样点差异较大, B组内XLY3与其他两个样点差异较大, 但总体上分组效果较好.A、B和C组之间存在显著的差异.

图 3

Fig. 3

图 3 采样点分组的PLS-DA偏最小二乘法判别分析 Fig. 3 Partial least squares discriminant analysis of the sample grouping

由图 4(a)可知, Chao1指数和ACE指数表现为A < C < B, 也即3组水样微生物的丰富度表现为A < C < B.由图 4(b)可知, 由Simpson指数和Shannon指数表征的微生物多样性, 均表现为A < B < C.

图 4

Fig. 4

图 4 多样性指数之间的对比 Fig. 4 Comparison of diversity indexes

但T-test检验的结果表明, A、B和C组水体微生物的Simpson指数(P_AB=0.33; P_AC=0.21; P_BC=0.14)、Shannon指数(P_AB=0.28; P_AC=0.37; P_BC=0.33)、Chao1指数(P_AB=0.29; P_AC=0.26; P_BC=0.47)和ACE指数(P_AB=0.49; P_AC=0.46; P_BC=0.43)差异不显著.

表 2列出了群落多样性指数与环境因子之间Spearman相关性分析的结果.从表 2中可以看出, 总磷(r为-0.79~-0.84, P≤0.01)和磷酸盐含量(r为-0.71~-0.80, P≤0.01)均与生物多样性指数呈极显著负相关关系.其他环境因子与水体微生物群落多样性指数之间相关关系不显著.

表 2 (Table 2)

表 2 群落多样性与环境因子的关系1) Table 2 Spearman correlation analysis of diversity index and environmental factors 项目 Simpson指数 Chao1指数 ACE指数 Shannon指数 r P r P r P r P pH -0.34 0.31 -0.46 0.15 -0.52 0.10 -0.39 0.24 磷酸盐 -0.80 0.00 -0.71 0.01 -0.78 0.01 -0.76 0.01 氨氮 0.10 0.77 0.22 0.51 0.26 0.44 0.34 0.30 硝态氮 0.10 0.77 -0.04 0.91 -0.07 0.84 0.12 0.72 亚硝态氮 -0.28 0.41 -0.14 0.69 -0.21 0.53 -0.22 0.51 总磷 -0.84 0.00 -0.79 0.00 -0.84 0.00 -0.83 0.00 硫化物 0.17 0.62 -0.12 0.73 -0.11 0.75 0.09 0.79 Mn2+ 0.24 0.48 0.05 0.89 -0.03 0.92 0.48 0.14 As3+ 0.24 0.47 0.22 0.51 0.24 0.48 0.22 0.51 Fe3+ 0.30 0.37 0.07 0.84 0.14 0.69 0.30 0.38 Zn2+ 0.12 0.74 0.01 0.97 0.10 0.76 0.18 0.60 Pb2+ 0.27 0.43 0.26 0.48 0.31 0.36 0.15 0.65 Cu2+ -0.32 0.33 -0.37 0.26 -0.47 0.15 -0.30 0.37 Ni2+ -0.27 0.42 -0.03 0.94 -0.05 0.89 -0.09 0.80 Cr6+ 0.18 0.59 0.45 0.17 0.50 0.12 0.32 0.34 DOC -0.01 0.98 0.08 0.81 -0.04 0.91 0.21 0.54 1)P < 0.05表示二者存在显著相关性; P < 0.01表示二者存在极显著相关性

表 2 群落多样性与环境因子的关系1) Table 2 Spearman correlation analysis of diversity index and environmental factors

门水平上(见表 3), A组水样中占比最大的微生物菌门是放线菌门、其次是变形菌门、蓝细菌门和拟杆菌门等, B组水样中占比最大的是变形菌门, 其次是拟杆菌门、放线菌门和厚壁菌门等, C组水样中占比最大的是变形菌门, 其次是放线菌门、蓝细菌门和拟杆菌门等.微生物占比在A组和B组水样之间存在显著性差异的菌门为拟杆菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、装甲菌门、酸杆菌门、Epsilonbacteraeota、芽单胞菌门和互养菌门.其中A＞B的菌门包括浮霉菌门、装甲菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门, 说明这些菌门主要来源于农业源的贡献.其中, A＜B的菌门包括拟杆菌门、厚壁菌门、Epsilonbacteraeota和互养菌门, 说明这些菌门主要来源于工业源的贡献.本文中流经工业园区的B组水样中厚壁菌门的占比是其他两组水样的6.66~12.65倍, T-test检验的结果也表明, B组与A和C组之间均存在显著性差异.同时, 拟杆菌门、Epsilonbacteraeota和互养菌门的占比也表现为B组水样最大, B组与A和C组之间均存在显著性差异.

表 3 (Table 3)

表 3 水体微生物在门水平上所占的比例1)/% Table 3 Proportion of bacteria in the water at a phylum level/% 项目 A组 B组 C组 变形菌门(Proteobacteria) 32.53±7.18a 43.67±10.80a 37.13±13.42a 放线菌门(Actinobacteria) 37.33±14.69a 24.17±14.66a 33.93±11.90a 蓝细菌门(Cyanobacteria) 14.65±22.64ab 0.63±0.45b 18.18±9.12a 拟杆菌门(Bacteroidetes) 8.50±3.67a 25.33±11.97b 4.20±1.12c 浮霉菌门(Planctomycetes) 1.83±1.77a 0.30±0.17b 1.68±0.64a 绿弯菌门(Chloroflexi) 2.25±3.14ab 0.03±0.06a 0.30±0.08b 厚壁菌门(Firmicutes) 0.20±0.20a 2.53±0.72b 0.38±0.25a 装甲菌门(Armatimonadetes) 0.13±0.13a 0.00±0.00b 2.03±1.32c 酸杆菌门(Acidobacteria) 1.20±1.50a 0.03±0.06b 0.88±0.13a 梭杆菌门(Fusobacteria) 0.10±0.08a 1.60±2.34ab 0.00±0.00b Epsilonbacteraeota 0.10±0.08a 1.20±0.52b 0.13±0.05a 疣微菌门(Verrucomicrobia) 0.28±0.29ab 0.10±0.10a 0.40±0.29b 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes) 0.23±0.17a 0.03±0.06b 0.25±0.13a 硝化螺旋菌门(Nitrospirae) 0.25±0.50ab 0.00±0.00a 0.13±0.10b Patescibacteria 0.10±0.12a 0.10±0.00a 0.25±0.37a 互养菌门(Synergistetes) 0.03±0.05a 0.10±0.00b 0.00±0.00a 1)a、b和c表示组间差异是否显著, 相同字母表示组间差异不显著, 不同字母表示组间差异显著

表 3 水体微生物在门水平上所占的比例1)/% Table 3 Proportion of bacteria in the water at a phylum level/%

微生物占比在B组和C组水样之间存在显著性差异的菌门为蓝细菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、装甲菌门、酸杆菌门、Epsilonbacteraeota、疣微菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和互养菌门.其中B＞C的菌门包括拟杆菌门、厚壁菌门、Epsilonbacteraeota和互养菌门, 说明李渡新区小流域是长江干流水体这些微生物菌门的重要来源.微生物占比在A、B和C组水样之间无显著性差异的菌门包括变形菌门、放线菌门和Patescibacteria等.在A、B和C之间均存在显著性差异的菌门包括拟杆菌门和装甲菌门等.

属水平上(见表 4), A组水样中占比最大的微生物菌属是hgcI_clade, 其次是CL 500-29 _marine_group、Limnohabitans、红育菌属、黄杆菌属和Polynucleobacter等, B组水样中占比最大的是黄杆菌属, 其次是hgcI_clade、不动杆菌属、Limnohabitans、红育菌属、假单胞菌属和噬氢菌属等, C组水样中占比最大的是hgcI_clade, 其次是CL 500-29 _marine_group、Limnohabitans、红育菌属和Polynucleobacter等.B组水样中黄杆菌属的占比是A组水样的4.55倍, 是C组水样的21.47倍.但B组水样中CL 500-29 _marine_group的占比是A组水样的1/5, 是C组水样的1/8.而在A、B和C这3组水样中占比较大的hgcI_clade、Limnohabitans和红育菌属等菌属间无显著性差异.与A和C两组水样相比较, B组水样中占比明显增大的菌属是黄杆菌属和噬氢菌属等.

表 4 (Table 4)

表 4 水体微生物在属水平上所占的比例1)/% Table 4 Proportion of bacteria in the water at a genus level/% 项目 A组 B组 C组 hgcI_clade 19.08±13.46a 15.30±11.11a 18.43±10.86a Limnohabitans 7.05±3.14a 7.73±1.62a 9.28±6.24a 黄杆菌属(Flavobacterium) 4.48±2.93a 20.40±12.37b 0.95±0.29c CL500-29_marine_group 7.40±4.44a 1.50±1.31b 12.23±1.31c Chloroplast目某属 10.70±18.64ab 0.10±0.10b 8.13±3.97a 红育菌属(Rhodoferax) 4.58±2.93a 6.90±2.52a 3.70±5.07a Polynucleobacter 4.28±3.33a 3.37±3.07a 3.50±3.23a 不动杆菌属(Acinetobacter) 0.45±0.83a 9.33±11.50a 2.18±2.64a Chloroplast目某属 1.83±2.00a 0.20±0.10b 6.45±3.86c 假单胞菌属(Pseudomonas) 0.88±1.48ab 4.07±3.37a 0.28±0.10b Pseudarcicella 1.70±1.50ab 2.20±1.06a 0.58±0.42b Aurantimicrobium 2.25±2.28a 1.57±0.31a 0.25±0.17b Microbacteriaceae科某属 1.93±1.96a 1.83±0.61a 0.10±0.08b 噬氢菌属(Hydrogenophaga) 0.63±0.66a 3.17±2.22b 0.38±0.24a 食酸菌属(Acidovorax) 1.20±0.91a 1.27±0.35a 0.90±1.07a Burkholderiaceae科某属 1.08±0.60a 0.77±0.15a 0.85±0.25a Virgulinella_ fragilis 0.50±0.59a 0.03±0.06b 1.83±1.31c Rhodoluna 1.60±2.02ab 0.80±0.53a 0.18±0.15b Burkholderiaceae科某属 0.80±0.37a 0.53±0.12a 1.10±0.18b Rhizobiales_Incertae_Sedis科某属 1.58±1.82a 0.20±0.00a 0.45±0.06b Gemmataceae科某属 0.90±1.21a 0.23±0.12a 1.10±0.45b Armatimonas 0.13±0.13a 0.00±0.00b 2.00±1.36c 分枝杆菌属(Mycobacterium) 1.13±0.43a 0.80±0.40a 0.30±0.14b Sporichthyaceae科某属 0.55±0.50a 0.67±0.55a 0.43±0.39a Tabrizicola 0.55±1.03ab 0.07±0.06a 0.88±0.64b Pseudorhodobacter 0.40±0.32a 0.50±0.20a 0.60±0.37a Candidatus_Planktoluna 0.83±0.97a 0.40±0.20a 0.20±0.40a Sediminibacterium 0.43±0.29a 0.37±0.38a 0.50±0.26a 1)a、b和c表示组间差异是否显著, 相同字母表示组间差异不显著, 不同字母表示组间差异显著

表 4 水体微生物在属水平上所占的比例1)/% Table 4 Proportion of bacteria in the water at a genus level/%

属水平上, 微生物占比在A组和B组水样之间存在显著性差异的菌属为黄杆菌属、CL 500-29 _marine_group、Chloroplast目某属、噬氢菌属、Virgulinella_ fragilis和Armatimonas.其中A＞B的菌属包括CL 500-29 _marine_group、Chloroplast目某属、Virgulinella_ fragilis和Armatimonas, 说明这些菌属主要来源于农业源的贡献.其中, A＜B的菌属包括黄杆菌属和噬氢菌属, 也进一步说明这些菌属主要来源于工业源的贡献.

微生物占比在B和C组水样之间存在显著性差异的菌属为黄杆菌属、CL 500-29 _marine_group、Chloroplast目某属、Chloroplast目某属、假单胞菌属、Pseudarcicella、Aurantimicrobium、Microbacteriaceae科某属、噬氢菌属、Virgulinella_ fragilis、Rhodoluna、Burkholderiaceae科某属、Rhizobiales_Incertae_Sedis科某属、Gemmataceae科某属、Armatimonas、分枝杆菌属和Tabrizicola.其中B＞C的菌属包括黄杆菌属、假单胞菌属、Pseudarcicella、Aurantimicrobium、Microbacteriaceae科某属、噬氢菌属、Rhodoluna和分枝杆菌属, 说明李渡新区小流域是长江干流水体这些微生物菌属的重要来源.微生物占比在A、B和C之间无显著性差异的菌属为hgcI_clade、Limnohabitans、红育菌属、Polynucleobacter、不动杆菌属、食酸菌属、Burkholderiaceae科某属、Sporichthyaceae科某属、Pseudorhodobacter、Candidatus_Planktoluna和Sediminibacterium等.在A、B和C之间均存在显著性差异的菌属为黄杆菌属Flavobacterium、CL 500-29 _marine_group、Chloroplast目某属、Virgulinella_ fragilis和Armatimonas.

利用CANOCO软件, 将属水平上占比大于1%的微生物菌属与水体的pH、总磷、磷酸盐和铵态氮等17个环境因子进行Forward分析和CCA分析, 结果如图 5和图 6所示.从图 5中可以看出, 总磷和磷酸盐与第一主轴和第二主轴均呈正相关, Pb²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺和Ni²⁺与第一主轴呈正相关, 与第二主轴呈负相关, 亚硝态氮、硝态氮、pH、DOC、硫化物、Cu²⁺和As³⁺与第一主轴呈负相关, 与第二主轴呈正相关.氨氮、Cr⁶⁺和Mn²⁺与第一主轴及第二主轴均呈负相关.亚硝态氮、总磷、磷酸盐、pH和Zn²⁺对微生物群落的解释量分别为0.26、0.21、0.20、0.15和0.14, 对水体中微生物群落分布有较大的影响.图 5中箭头连线的长度表示环境变量与微生物分布的相关程度, 连线越长, 相关性越大, 反之相关性越小^[11].从图 5中可以看出, 箭头连线最长的是总磷, 其次是磷酸盐, 这与群落多样性与环境因子的相关性分析的结果相一致.

图 5

Fig. 5

图 5 环境因子与属水平上微生物占比的CCA分析 Fig. 5 Canonical correspondence analysis of environmental factors and microbial proportions at genus level in the water samples from different sources

图 6

Fig. 6

图 6 环境因子与属水平上微生物占比的CCA分析 Fig. 6 Canonical correspondence analysis of environmental factors and microbial proportions at genus level in the water samples from different sources

各样点与环境因子的夹角(锐角表示正相关, 钝角表示负相关)可以看出^[11](如图 6)：B组的大部分样点如XLY10和XLY11的微生物群落组成与硝态氮、总磷及磷酸盐正相关, 与Zn²⁺、Fe³⁺和铵态氮负相关; A组的大部分样点如XLY1、XLY2、XLY4和C组的大部分样点如XLY5、XLY7和XLY9的微生物群落组成与Zn²⁺、Fe³⁺和铵态氮等正相关, 与硝态氮、总磷及磷酸盐负相关.将代表环境因子的箭头延长, 样点垂直投射于射线上, 沿着箭头方向, 环境因子对样点微生物群落的影响程度增大.XLY6样点微生物群落组成受总磷及磷酸盐的影响程度最大, XLY10和XLY11样点微生物群落组成受硝态氮的影响程度最大, XLY1和XLY9样点微生物群落组成受铵态氮的影响程度最大.

属水平优势菌属与环境因子的Spearman相关性分析的结果见表 5.从中可以看出, Limnohabitans、Rhodoferax和Acidovorax与硝态氮呈显著正相关关系.Flavobacterium、Polynucleobacter、Pseudarcicella和Hydrogenophaga与亚硝态氮呈正相关关系, 而CL 500-29 _marine_group与亚硝态氮呈负相关关系.Microbacteriaceae科某属和Hydrogenophaga与总磷呈正相关关系.Flavobacterium和Pseudomonas与硫化物含量呈正相关关系, Aurantimicrobium和Microbacteriaceae科某属与Mn²⁺呈极显著正相关关系, Limnohabitans、Rhodoferax和Acidovorax与As³⁺呈显著正相关关系, Aurantimicrobium和Microbacteriaceae科某属与DOC呈显著正相关关系, CL 500-29 _marine_group与DOC呈显著负相关关系.Limnohabitans与Cu²⁺呈显著正相关关系.

表 5 (Table 5)

表 5 属水平优势菌属与环境因子的Spearman相关性分析1) Table 5 Spearman correlation analysis of dominant bacteria at genus level and environmental factors 项目 pH 硝态氮 亚硝态氮 总磷 硫化物 Mn2+ As3+ DOC Cu2+ hgcI_clade 0.05 -0.35 -0.15 0.14 -0.33 -0.16 -0.13 -0.18 -0.42 Limnohabitans -0.30 0.61* 0.03 0.03 -0.48 0.08 0.57* -0.02 0.61* Flavobacterium 0.66* 0.42 0.90** 0.49 0.62* -0.03 0.32 0.21 0.17 CL500-29_marine_group -0.62* -0.01 -0.81** -0.42 -0.32 -0.40 -0.07 -0.72* -0.34 Chloroplast目某属 -0.34 -0.15 -0.37 -0.18 0.17 -0.24 -0.37 -0.24 -0.17 Rhodoferax 0.06 0.84** -0.62* 0.30 -0.01 0.26 0.80** 0.15 0.55 Polynucleobacter 0.02 -0.37 0.79** -0.24 -0.22 0.51 -0.09 0.42 -0.23 Acinetobacter 0.26 -0.21 0.38 0.14 -0.08 -0.15 -0.24 0.31 0.55 Chloroplast目某属 -0.04 -0.49 0.22 -0.17 0.04 -0.32 -0.52 -0.47 -0.21 Pseudomonas 0.55 0.51 0.36 0.36 0.68* -0.05 0.55 -0.06 -0.20 Pseudarcicella 0.16 0.08 0.76** -0.09 0.05 0.60 0.45 0.53 -0.09 Aurantimicrobium 0.15 0.04 0.29 0.05 -0.12 0.87** 0.29 0.78** 0.29 Microbacteriaceae科某属 0.23 -0.03 0.58 0.66* -0.08 0.75** 0.18 0.78** 0.28 Hydrogenophaga 0.57 0.34 0.66* 0.99** 0.35 -0.09 0.18 0.26 0.40 Acidovorax -0.15 0.67* -0.01 -0.23 -0.36 -0.09 0.57* -0.20 0.52 1)*表示P < 0.05, **表示P < 0.01

表 5 属水平优势菌属与环境因子的Spearman相关性分析1) Table 5 Spearman correlation analysis of dominant bacteria at genus level and environmental factors

李渡新区小流域是长江干流水体中亚硝态氮、DOC的重要来源.亚硝酸盐因其具有着色、防腐和抗氧化等作用, 在食品加工领域广泛应用.而以榨菜为特色的食品工业是李渡工业园区重点发展的领域.榨菜加工过程中产生的高盐废水会影响污水处理过程中亚硝态氮的硝化过程, 使硝化反应不完全, 导致水体中亚硝态氮积累^[12].崔燕^[13]对小清河口亚硝酸盐来源研究也发现, 水体中亚硝态氮主要是硝化细菌利用铵态氮进行硝化反应的过程中产生.也有学者认为亚硝酸盐积累很可能是由于体系内无机碳源不足所造成的^[14].水体DOC的来源众多, 如城市雨水径流^[15]、工业废水排放和以坡耕地为主的农业源径流输入等^[16].DOC是水体溶解性有机物的重要组成部分, 王齐磊等^[17]对临近农业小流域——重庆涪陵区王家沟水体溶解性有机物的研究也表明, 临近稻田是小流域水体中溶解性有机物重要来源.而城镇化程度较高的河流水体溶解性有机物的含量也较高^[18].

一般地, 干流水体流速快, 而支流处于相对缓流的状态, 易于微生物的聚集和增殖, 但干流水体由于汇入支流的多样性, 增加了干流水体中稀有微生物出现的概率, 因此支流水体生物多样性小于干流.本文中, 随着径流流经区域类型多样, 径流水体微生物的多样性也逐渐增大.同时, 由于工业园区生产环境的极端性及工业废水处理过程中特异性菌群的加入, 使表征物种丰富度的Chao1指数和ACE指数表现为C < B.但从总体上看, 小流域内流经不同污染源的水体微生物丰富度和多样性并没有呈现显著的差异性. 3组水样的生物多样性指数与水体总磷和磷酸盐含量均呈极显著负相关关系, 主要原因在于磷是水体富营养化的重要限制因子, 水体中过量总磷和磷酸盐的存在, 使水中优势菌群大量繁殖, 充分占据了非优势菌群的生态位, 使非优势菌群的种群和数量明显减少, 进而降低了水体中微生物的多样性.吴霖^[19]的研究也发现, 黄渤海河口区浮游细菌丰度与磷酸盐浓度呈显著负相关关系.

邹沈娟^[20]对以农业面源为主要污染源的梁子湖微生物群落结构研究发现, 水体中最丰富的微生物菌门是放线菌门, 其次是变形菌门、拟杆菌门和蓝细菌门等, 这与本研究的结果相一致, 这可能与农田径流中农药和抗生素代谢有关^[21].王鹏等^[22]对河道水体黑臭前后微生物种群变化研究发现, 厚壁菌门是影响黑臭的关键门, 本文中工业园区径流的输入是小流域水体朝黑臭水体转变的主要原因所在.乔江涛等^[23]发现互养菌门是秸秆厌氧发酵的优势菌群, 属于严格厌氧菌, 来源于工业源排放的可能性较大.拟杆菌门以肠道菌群居多, 主要来源于小流域生活污水及人畜粪污的排放, 厚壁菌门与废水及废弃物的厌氧处理有关^[24], 主要来源于工业有机废水的排放.梁杰超等^[3]对长江中游枯水季水体菌群的测序结果也表明, 变形菌门为水体微生物优势菌门, 其次是放线菌门、拟杆菌门及蓝细菌门, 这与本文的结果相一致, 这可能与变形菌门包含了绝大多数反硝化功能菌群有关^[25].

黄锦等^[26]对不同施肥模式下的稻田水体微生物测序的结果发现, 稻田水体主要优势菌属为hgcI_clade等.李建柱等^[27]对鱼菜共生体系水体微生物测序的结果也发现, hgcI_clade和CL 500-29 _marine_group是水体主要的优势菌群, 这与本文的结果相一致, 二者可能通过促进水环境碳、氮循环等途径改善水质.黄杆菌属和噬氢菌属属于典型的反硝化菌属^{[27, 28]}.噬氢菌属具有耐高温耐盐嗜油的特性, 通常也是城市污水及工业废水处理活性污泥中优势菌群^[29~31].宋淑芬等^[32]的研究也表明黄杆菌属、假单胞菌属的出现可能与水体富营养程度有关, 黄杆菌属是常见的好氧反硝化细菌, 假单孢菌属、嗜氢菌属为异养硝化-好氧反硝化菌, 同时, 假单孢菌属还是一种反硝化聚磷菌, 在磷的转化和循环过程中也有重要作用^[33].此外, 黄杆菌属和分枝杆菌属也是潜在的水源性病原菌属^[2].

一方面, 从水样的理化性质来看, 亚硝态氮是3组水样之间唯一存在显著性差异的因子, 另一方面, 属水平占比较大且在3组水样之间存在显著差异的CL 500-29 _marine_group和黄杆菌属等菌属均与亚硝态氮呈极显著相关关系.其中, 黄杆菌属、Pseudarcicella、噬氢菌属与亚硝态氮呈正相关关系, 这可能与该区域亚硝酸盐的外源输入有关.而CL 500-29 _marine_group、红育菌属与亚硝态氮呈负相关关系.CL 500-29 _marine_group在促进水体碳、氮循环有一定作用^[27], 而碳氮比对短程反硝化过程中亚硝态氮的生成和转化有重要影响^[34].红育菌属(Rhodoferax)属于异养脱氮菌^[35], 且冬季较低的水温有利于其生长^[36], 因而其占比与亚硝态氮呈负相关关系.王欢等^[37]的研究也表明, 亚硝态氮是影响碧流河水库细菌群落结构的主要环境因子之一.Zhang等^[38]的研究表明, 磷酸盐有利于厌氧氨氧化代谢反应, 增加水体中氮的去除.随着总磷浓度的增加, 水体中产毒微藻的丰度和占比也随之增加, 使水中微生物群落丰度降低^[39].DOC与Aurantimicrobium、Microbacteriaceae科某属呈显著正相关关系, 可能是水体中溶解性有机碳给微生物生长提供了充足的碳源, 而CL 500-29 _marine_group菌属参与了水中溶解性有机碳的降解^[27], 因而与DOC呈显著负相关关系.Flavobacterium、Pseudomonas与硫化物含量呈正相关关系, 可能与二者具有相同的输入源有关.重金属对水体微生物的影响具有两面性.本文中3组水样Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和As³⁺的含量均较低, 且都分别与水体中某些微生物的占比呈显著正相关关系.一方面, 金属离子如Cu²⁺和Zn²⁺是微生物酶的重要组成部分, 另一方面, 低浓度的重金属可刺激微生物生长, 增加微生物的生物量碳^[40].水体pH是影响水体微生物群落结构的重要因素, 可通过影响微生物的生命代谢活动等对微生物的群落结构产生影响.刘峰等^[11]的研究表明, pH是汾河入黄口水体微生物群落结构的主要影响因子之一.pH值与黄杆菌属占比呈显著正相关关系, 芦燕等^[28]的研究也表明, 黄杆菌属等反硝化菌属是水生和湿生生境共有的优势菌且与pH值呈正相关关系.于景丽等^[41]的研究也表明, 黄杆菌属更喜欢pH值相对高的生境.CL 500-29 _marine_group与pH呈负相关关系, 这可能与pH值影响了细菌内酶的活性有关^[42].Rhodoferax菌属中的某些菌株具有硝化功能^[35], 可以通过同化作用利用氨生成硝酸盐.Limnohabitans与氮循环相关, 能够分解水中的水华和蓝藻^[43], 使有机氮转变成无机氮如硝酸盐氮等.Acidovorax菌属是典型的反硝化脱氮菌属^[44], 充足的硝酸盐可能为Acidovorax菌属的生长提供了充足的氮源.因而水体中Limnohabitans、Rhodoferax和Acidovorax菌属的占比与硝态氮呈显著正相关关系.

(1) 李渡新区小流域是受纳水体中亚硝态氮、DOC的重要来源, 亚硝态氮可能与流域内工业源的输入有关.

(2) 小流域内流经不同污染源的水体微生物丰富度和多样性没有呈现显著的差异性, 微生物多样性指数与水体总磷和磷酸盐含量均呈极显著负相关关系.

(3) 门水平上, 流经农业区的径流以放线菌门占比最大; 流经工业区的径流以变形菌门占比最大.属水平上, 流经农业区的径流以hgcI_clade占比最大; 流经工业区的径流以黄杆菌属占比最大, 黄杆菌属也可能与流域内工业源的输入有关.

(4) 亚硝态氮、总磷、磷酸盐、pH和Zn²⁺等是影响小流域水体微生物群落的主要环境因子, DOC、硝态氮和重金属离子(如Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和As³⁺等)也与水体中某些微生物菌属的占比存在相关性.