环境科学  2020, Vol. 41 Issue (5): 2044-2049   PDF    
西安市秋冬季市区与山区微生物气溶胶组成特征及来源
谢雯文1, 路瑞1, 慕飞飞1, 戚玉珍1, 白文艳1, 李彦鹏1,2     
1. 长安大学环境科学与工程学院, 西安 710054;
2. 长安大学旱区水文与生态效应教育部重点实验室, 西安 710054
摘要: 为探究城市市区与山区微生物气溶胶组成特征及来源,在西安市市区(城区和郊区)及南郊山区设立3个采样点,采集细颗粒物、土壤及叶片样本.通过高通量测序法,解析不同采样点真菌与细菌群落结构,考察其时空变化特征;使用Source Track源解析技术对空气中微生物进行来源分析.结果表明,不同采样点真菌、细菌菌属差异较大,说明地理位置对空气中微生物的群落结构影响显著;冬季市区检测出较多的潜在真菌致病菌和细菌致病菌,且具有较高的相对丰度和多样性.通过源解析技术发现,在局部源叶片和土壤中,叶片表面微生物是空气中微生物的主要潜在源,且秋季叶片对空气中微生物的贡献率高于冬季.本研究不仅为空气中生物气溶胶的溯源研究提供了一定基础,也为深入了解大气中微生物污染特性和为我国空气环境质量评价与疾病预防提供一定的科学依据.
关键词: 真菌      细菌      群落结构      来源分析      生物气溶胶     
Characteristics and Sources of Microbial Aerosols in Urban and Mountainous Areas in Autumn and Winter in Xi'an, China
XIE Wen-wen1 , LU Rui1 , MU Fei-fei1 , QI Yu-zhen1 , BAI Wen-yan1 , LI Yan-peng1,2     
1. School of Environmental Science and Engineering, Chang'an University, Xi'an 710054, China;
2. Key Laboratory of Subsurface Hydrology and Ecology in Arid Areas, Ministry of Education, Chang'an University, Xi'an 710054, China
Abstract: To explore the bioaerosol composition characteristics and sources in urban areas and mountains, three sample sites were selected in urban (urban, suburban) and southern mountainous areas in Xi'an, and air, soil, and leaf samples were simultaneously collected. The fungi and bacteria community structures at different sampling sites were analyzed through a high-throughput sequencing method, and their spatio-temporal variations were also examined. Moreover, a source track technique was used to identify the source of microorganisms in the air. The results showed that the fungi and bacteria at different sampling sites were significantly different, indicating that the geographical location has a significant influence on the community structure of microorganisms in the air. In winter, more potential fungal pathogens and bacterial pathogens were detected in urban areas with high relative abundance and diversity. In addition, the results showed that the main local source of fungi and bacteria was the leaf surface, of which the contribution rate of bacteria in the air fine particles was up to (55±30)%. This study can provide a scientific basis for understanding the characteristics of microbial pollution in the atmosphere, and for air environment quality evaluation and disease prevention in China.
Key words: fungi      bacteria      community structure      Source Track      bioaerosol     

生物气溶胶是大气气溶胶的重要组成部分之一, 通常是指空气动力学直径小于100μm且携带微生物或来源于生物性物质的气溶胶, 主要包括细菌、真菌、病毒、花粉和动植物碎片等[1], 空气中的微生物主要是附着在空气颗粒物上.大气细颗粒物(PM2.5)作为主要的空气污染物, 具有粒径小、比表面积大等特点[2], 微生物易富集在其表面, 对环境质量产生严重影响.生物气溶胶中含有大量病原体[3, 4], 这些病原体会通过人体的皮肤、呼吸道和消化道侵入, 致使过敏性疾病、呼吸道感染和慢性肺病等疾病发病率升高, 对人类健康存在严重的威胁[5].

由于生物气溶胶受人类活动和工农业生产等社会因素影响, 使得微生物浓度和群落结构存在明显的空间差异[6~9].Kim等[10]和夏晓敏等[11]的研究表明, 繁华的交通干线、商业中心微生物浓度明显较高且微生物群落较为丰富;Bowers等[12, 13]的研究指出, 城市和乡村的微生物群落结构存在较大差异, 不同采样点之间大气颗粒物中细菌群落组成和相对丰度有所不同.综合前人研究可知, 不同地点的微生物群落特征有所不同.

自然界中的微生物, 通常是由动植物、土壤和天然水体等载体释放.Bowers等[12]通过监测空气样本和土壤微生物样本, 得出近地层空气中的细菌部分来源于土壤的结论.除此之外, Fan等[14]的研究表明, 空气中的潜在致病菌群落结构组成变化可以通过土壤和叶片等局部潜在源的改变解释.因此, 以土壤和叶片为潜在源, 研究其对空气中微生物的贡献率, 有利于判断微生物来源和实施空气质量控制.

本文主要以秋冬季西安市不同区域生物气溶胶为研究对象, 在郊区、城区和山区这3个不同的采样点进行PM2.5空气颗粒物样本和微生物潜在来源(叶片和土壤)采集, 通过高通量测序和Source Track源分析方法, 对比3个不同采样点微生物群落结构多样性, 分析潜在来源对微生物的贡献率, 以期为了解西安市空气微生物分布提供基本信息, 并为区域疾病预防和空气质量改善等方面提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 样品采集

本研究共设置3个采样点, 分别位于西安市郊区、城区和南郊山区.郊区采样点位于长安大学渭水校区原位实验场(渭水, 34.37°N, 108.91°E), 城区采样点位于长安大学雁塔校区某实验楼顶(雁塔, 34.22°N, 109.18°E, 距地面高度27 m), 两个采样点远离主干道, 周围主要是居民住宅和学校, 人流量较大, 绿化程度高, 主要树木种类有广玉兰、香樟树和梧桐树等, 可归为市区采样点;山区采样点位于南郊山区秦岭支脉-翠华山脚下(秦岭, 34.02°N, 109.01°E), 该采样点远离主干道, 山脉植被茂密, 落叶植物居多, 主要树木种类有白蜡树、银杏树、桦树等, 且人流量小. 3个采样点周围均无潜在工业污染源.采样时间为2018年10月23~29日、2019年1月13~18日, 共计12 d.

本次采样使用ZR-3930型大气颗粒物采样器(青岛众瑞)进行, 同时将3个采样点的PM2.5样本采集到直径为47 mm的无菌聚碳酸酯膜上(英国Whatman).采集的PM2.5样品采用高通量测序法测定空气中真菌与细菌群落结构.同时, 对采样点周围, 半径约15 m区域内的叶片和土壤进行采集, 采集的叶片距地高度约1.5~2.0 m, 采集5~6棵不同树木, 每棵树木5片叶片;采集土壤为无植物生长的地表土, 选取8个采样点采集后混合.采样前, 所有采样容器在121℃高压蒸汽灭菌锅(上海LDZX-40BI)中灭菌20 min.采样前后均需对过滤器进行消毒.本次采样获得PM2.5空气、叶片和土壤样本各36份.

1.2 DNA提取、PCR扩增和Illumina测序

大气颗粒采样器的采样流量为16.7 L·min-1, 每次采样时间为1 h, 得到滤膜空气样品.将得到的样品放入无菌样品管中, 带回实验室, 在-80℃冰箱内低温保存.将同一采样点采集的叶片样本放入1 000 mL锥形瓶中, 加入100 mL缓冲溶液洗脱表面微生物, 得到洗脱液.将混合好的土壤和叶片表面微生物样品保存, 提纯备用测序分析.在超净台将滤膜样本用无菌刀分为两份, 分别用于真菌、细菌检测.每两天的样品编为一组进行DNA提取, 进行微生物种属鉴定.使用OMEGA Soil DNA Kit试剂盒分别提取每组样本中的DNA.采用Nano Drop ND-2000 (Nano Drop Technologies, Wilmington, DE)分光光度计测定基因组DNA浓度和纯度, 提取DNA作为PCR扩增模板.将扩增后的产物进行纯化, 符合测样要求后, 送往测序公司进行高通量测序分析.

1.3 数据分析

使用SPSS 25.0进行t检验.当P值小于0.05时, 表示在95%的置信区间内具有统计学上的显著差异.使用R(64 3.5.3)对数据进行统计分析和可视化, Source Track源分析技术进行微生物溯源解析[15, 16].利用Origin 8.5统计画图.

2 结果与讨论 2.1 西安市城区与山区细颗粒物中微生物群落多样性变化

表 1为不同采样点PM2.5中真菌和细菌的群落多样性.从总体上看, 秋季各采样点的真菌群落的丰富度和多样性显著高于冬季.从Chao1和ACE指数来看, 秋季市区采样点的群落丰富度显著高于郊区采样点(P < 0.05);冬季山区采样点的真菌群落丰富度略高于市区两个采样点(P < 0.05).同时, 看出秋冬两季Shannon指数稳定在5~7之间, Simpson指数均大于0.9, 说明3个采样点的真菌种类较多, 且离散程度大.其中, 市区采样点的Shannon指数和Simpson指数显著高于山区, 说明相比于山区, 市区的真菌群落丰富度较高, 且离散性大.OTUs数显示, 秋冬两季, 门水平、属水平的真菌种类均是市区高于山区.

表 1 西安市区与山区PM2.5中真菌和细菌群落多样性 Table 1 Diversity of fungal and bacterial communities in PM2.5 in urban and mountainous areas of Xi'an

分析细菌群落多样性可以看出, 总体上秋季各采样点的细菌群落的丰富度和多样性低于冬季各采样点.从Chao1和ACE指数来看, 秋季郊区采样点最高, 冬季城区采样点最高, 说明秋冬两季市区采样点的细菌丰富度高于山区.冬季的Shannon指数达到7~8.5, Simpson指数达到0.97~0.99, 表示冬季细菌种类多且离散度大.统计门水平和属水平下OTUs数, 数据显示秋季郊区采样点最高, 冬季市区采样点最高.与真菌相同, 秋季郊区采样点的丰富度和多样性最大, 冬季城区采样点的丰度和多样性最大, 说明秋冬两季市区的细菌群落丰富度和多样性高于山区.

2.2 西安市市区与山区颗粒物中微生物群落结构变化 2.2.1 颗粒物中真菌群落结构变化

图 1为门水平下3个不同采样点微生物中真菌的群落结构组成.从中可知门水平下, 3个采样点真菌群落结构相似度较高, 但相对丰度存在差异, 主要由子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)构成, 这与前人的研究高度相似[14, 17~19].其中, 子囊菌门(Ascomycota)相对丰度显著高于其他菌群(P<0.05), Du等[18]在对北京市微生物群落结构的季节变化研究中, 同样观察到北京市细颗粒物中子囊菌门(Ascomycota)为主要菌门的现象.

图 1 不同采样点真菌门水平分布 Fig. 1 Horizontal distribution of phylum fungi at different sampling sites

为深入研究不同采样点真菌群落结构的变化, 本研究选取不同采样点相对丰度较大共有优势真菌做物种分布的热图, 结果如图 2所示.从中可以看出, 不同季节、不同采样点真菌的共有菌种相对丰度差异较大.郊区采样点秋季的优势菌种为酵母菌属(Bullera), 冬季的优势菌种为枝孢霉菌属(Cladosporium)、曲霉属(Aspergillus);城区采样点秋季栓菌属(Trametes)相对丰度较高, 冬季集珠霉属(Syncephalis)相对丰度较高;而山区采样点的优势菌种秋季是烟管霉属(Bjerkandera), 冬季是嗜热子囊菌属(Thermoascus).其中, 曲霉属(Aspergillus)产生的毒素会导致过敏[20], 枝孢霉菌属(Cladosporium)会引发肺部感染和哮喘[21].这些结果说明, 冬季市区采样点潜在致病真菌相对丰度较大.与前人的研究对比可以发现[14, 18], 在北京市和西安市的冬季细颗粒物中, 均检测出较高的曲霉属(Aspergillus)、枝孢霉菌属(Cladosporium), 对人体健康存在潜在威胁.此外, 还可以发现不同采样点的真菌优势菌种有所不同, 这与Cao等[22]的研究结果相同, 说明地理位置明显影响空气中真菌的群落结构.

图 2 不同采样点前25种真菌菌属热图 Fig. 2 Heatmap of the first 25 species of fungi at different sampling sites

2.2.2 颗粒物中细菌群落结构变化

图 3为门水平下不同采样点微生物中细菌的群落结构组成.从中可知门水平下, 不同采样点的细菌群落结构同样相似度较高, 相对丰度差异较大, 主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)构成.郊区采样点与城区采样点、山区采样点的相对丰度相差较大, 变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最低(P<0.05), 厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度最高(P<0.05).根据前人研究可知[23, 24], 青岛的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria, 78.8%), 济南的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes, 74.1%), 北京的优势菌门为放线菌门(Actinobacteria, 62.3%), 进一步证实不同区域门水平上细菌群落具有较高的相似性, 但相对丰度不同.

图 3 不同采样点细菌门水平分布 Fig. 3 Horizontal distribution of bacterial phyla at different sampling sites

图 4为不同采样点优势细菌菌属的分布热图.从分析结果可以看出, 不同季节、不同采样点之间的优势菌属的差异较大.秋季, 郊区采样点主要有异常球菌属(Deinococcus), 城区采样点主要有布丘氏菌属(Buttiauxella), 山区采样点主要有水栖菌属(Enhydrobacter).冬季, 郊区采样点的优势菌种变为乳杆菌属(Lactobacillus), 城区采样点变为不动杆菌属(Acinetobacter), 山区采样点是栖热菌属(Thermus), 芽孢杆菌属(Geobacillus).其中, 还在市区采样点检测到较高的假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、马赛菌属(Massilia)等潜在致病菌, 其易引发呼吸道感染、哮喘等疾病, 会对人体健康产生不良影响[17, 25].市区人流量大, 居民区垃圾产生量较大, 温度适宜均会导致细菌致病菌相对丰度增加.类似于Bowers等[13]的研究结果, 不同采样点细菌结构的组成和相对丰度均有所差异.这进一步表明地理位置会影响空气中微生物群落结构.

图 4 不同采样点前25种细菌菌属热图 Fig. 4 Heatmap of the top 25 species of bacteria at different sampling sites

2.3 不同采样点微生物潜在来源分析 2.3.1 不同采样点真菌潜在来源分析

源解析可以揭示不同采样点空气中微生物的变化情况.本研究分析了采样点附近叶片表面和土壤中的微生物组成, 以确定空中微生物的潜在来源.图 5为通过Source Track源分析得到的不同采样点真菌局部来源贡献率.不同采样点叶片对空气中的真菌的贡献率远高于土壤贡献率(P < 0.05), 说明相对于土壤, 空气中的真菌更多来自于叶片.山区采样点叶片对空气中的真菌贡献度更高, 这是由于空气中的真菌孢子大部分都由植物直接扩散, 借助风力在大气中扩散, 而山区植物种类多, 覆盖率大, 有利于真菌孢子释放[26, 27].冬季叶片的贡献率低于秋季(P < 0.05), 这可能由于冬季植物叶片减少和积雪覆盖.

图 5 不同采样点真菌潜在来源贡献度 Fig. 5 Contribution of potential fungal sources at different sampling sites

2.3.2 不同采样细菌潜在来源分析

空气中细菌群落与土壤、植被、水体和动物等各种当地来源有关[28, 29], 局部来源的细菌会影响当地空气中的细菌群落结构[30, 31].本研究探究了空气样本和局部来源(叶片和土壤)的相关性.图 6为不同采样点细菌潜在来源贡献度.根据Source Track源分析结果可知, 叶片对空气中的细菌贡献率大于50%, 说明叶片表面的细菌是空气样本中细菌的主要来源, 这与大气颗粒物的沉降有关.在所有地点, 叶片的细菌对空气中细菌群落的贡献在秋季略有增加.前人的研究表明, 叶片表面是秋季条件致病菌的主要来源[13].值得注意的是, 本研究未考虑树木种类对空气微生物贡献率的影响, 这将在未来进一步研究.

图 6 不同采样点细菌潜在来源贡献度 Fig. 6 Contribution of potential bacterial sources at different sampling sites

3 结论

(1) 采样期间, 市区空气中细菌的群落多样性与丰富度高于山区.

(2) 3个采样点相对丰度前25个共有真菌、细菌菌属差异较大, 说明地理位置影响空气中微生物的群落结构.

(3) 本研究在市区样品中检测出较高的潜在致病菌, 说明在人群密集的区域存在更多的潜在致病菌属.

(4) 来源分析显示, 在局部源叶片和土壤中, 叶片表面微生物是空气中微生物的主要潜在源, 且秋季叶片对空气中微生物的贡献率高于冬季.

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