2020, Vol. 41
氮(N)是限制农作物生长和谷物产量的关键营养素之一[1].近几十年来, 为了农业增产而使用的氮肥越来越多, 然而氮肥的过量使用会引起各种环境问题[2], 包括水体富营养化和栖息地退化[3, 4]等.
现有研究表明, 环境中氮素的去除主要是植物吸收、微生物作用、氮素沉积在土壤及水体底泥这3条途径[5], 微生物脱氮过程可以通过控制氮素的可利用性和排放通量来改变生态系统中的氮循环[6].目前研究较多的微生物脱氮反应主要是反硝化和厌氧氨氧化[7], 其中, 利用NO3-作为电子受体的反硝化作用已被确定为水生生态系统中氮损失的主要微生物途径[7~9], 而厌氧氨氧化也是微生物氮循环中的重要过程, NH4+在厌氧条件下被NO2-氧化而生成N2[7].
农田是陆地生态系统中最重要的N汇之一[4], 中国南方太湖流域农田的主要作物是水稻, 该地区每年施氮量高达300 kg·hm-2[10], 农田中一部分流失的氮肥通过水分进入深层土壤, 而其他一些则随地表径流进入沟道、河岸带、河流和湖泊[11].氮肥地表径流损失已被确定为水环境氮污染的主要因素之一[12].Yang等[4]的研究表明, 在中国南方稻田土壤中, 反硝化和厌氧氨氧化贡献了大部分的氮去除.因此, 分析探讨从农田表层土壤到深层土壤以及从农田到其他土壤环境的这两个氮迁移过程中氮的不同途径去除情况, 对于控制农田生态系统中氮污染以及增加人们对土壤氮循环的认识具有重要意义.然而, 目前关于氮素在农田生态系统中水平和竖直这两个迁移方向上的去除路径及脱氮贡献方面的研究还不多见.
本研究中, 为探究中国南方农田土壤氮迁移过程的反硝化与厌氧氨氧化速率变化和脱氮贡献, 选取太湖流域宛山荡麦稻轮作区作为研究区域, 使用15N示踪技术测量并比较农田不同层深土壤及不同土地利用类型(农田、沟道、湖泊河岸带和湖泊沉积物)表层土壤中的潜在反硝化和厌氧氨氧化速率, 并评估它们对N2产生的贡献和变化情况, 确定环境变量对脱氮速率的影响, 并通过qPCR技术从功能基因绝对丰度方面解释脱氮速率的差异, 以及通过MiSeq测序确定不同土壤中不同微生物相对占比的差异.
1 材料与方法 1.1 研究区域及土壤样品采集研究区域位于无锡市锡山区宛山荡附近(N31°34′32″~31°36′30″, E120°30′12″~120°32′24″), 属太湖流域.该地区农田实行稻麦轮作, 其中水稻生长季节是6~10月, 小麦季节是11月至次年5月.实验采样时间为2018年3月, 采集对象是农田3个不同层深土壤、沟道土壤、河岸带土壤以及湖泊沉积物, 对于每种类型土壤/沉积物, 使用柱状采泥器随机采集5个样本, 为避免伪重复, 它们之间至少相距500 m, 共计30个样本, 且每个采样点样品是在同一区域采集3个样品混合而成, 用以代表该处环境.其中, 农田土壤样品分为0~10 cm表层土壤、20~30 cm耕作层和60~70 cm无扰动层3个土层；沟道、河岸带和湖泊的土壤/沉积物采集深度均为0~10 cm, 代表表层土壤.采集后, 将土壤/沉积物快速放入真空无菌塑料袋中并带回实验室.去除样品中的杂质和根茎后, 将每份样品分为3个子样品, 分别用于添加同位素培养实验, 在-80℃下干燥以分析土壤/沉积物的理化特征, 以及在-80℃下储存用于微生物分析.
1.2 土壤特征分析将土样在105℃下干燥12 h以测定其含水率；将已冷冻干燥的样品与去离子水按1:2.5(质量浓度)比率混匀后, 使用pH计测量样品的pH；用1 mol·L-1 HCl除去样品中的无机碳后, 使用元素分析仪(Elementar Vario MICRO, Germany)测定样品的总有机碳含量(TOC)[13]；使用2 mol·L-1 KCl浸提样品后, 通过连续流分析仪(San++System, Skalar Analytic, Breda, The Netherlands)测定样品中的NH4+-N、NO2--N和NO3--N含量[14].
1.3 同位素示踪培养将采集的样品送至实验室后, 取每份样品的一个子样品置于棕色玻璃瓶中, 加入比例为1:2(质量浓度)的缺氧去离子水(通入高纯氦气以去除溶解氧), 在室温下进行为期5 d的避光预培养.随后取20 g该混匀泥浆加入150 mL血清瓶中, 并加满缺氧去离子水, 然后立即将瓶密封.本实验分为3种处理组添加：①15NH4Cl，②15NH4Cl、Na14NO3和③Na15NO3.最终的N添加量(以干土计, 下同)为135 mg·kg-1[相当于300 kg·(hm2·a)-1的化学氮肥].将泥浆在室温下培养24 h后, 取1 mL饱和ZnCl2溶液加入到血清瓶中以终止微生物活动.从血清瓶中收集15 mL水样, 并使用膜接口质谱仪(MIMS)分析29N2和30N2浓度, 用以计算各样品的潜在反硝化速率与潜在厌氧氨氧化速率[15], 计算公式如下：
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式中, Atotal和Dtotal分别为厌氧氨氧化速率和反硝化速率[nmol·(g·h)-1]；FN是添加Na15NO3组中15NO3-占总NO3-的百分比；P29和P30分别是添加Na15NO3组中利用膜接口质谱仪测得的29N2和30N2产率[nmol·(g·h)-1].
1.4 DNA提取、qPCR和Illumina MiSeq分析采用FastDNA Spin Kit(MP, Biomedicals, CA, USA)从0.5 g经冷冻干燥的土壤/沉淀物样品中进行细菌DNA的提取.使用Nanodrop 2000UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific, USA)检测提取DNA的浓度和纯度.为比较各土壤样品中功能基因的绝对丰度, 在ABI 7500系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中进行反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ, 厌氧氨氧化功能基因ANAMMOX bacterial 16S rRNA(amx)[16~18]的qPCR分析, 细菌16S rRNA高变区V4/V5段扩增的正向引物是515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′), 反向引物是907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)[19], 各功能基因引物信息如表 1所示；反应体系为：2X Taq Plus Master Mix 10 μL, 引物F (5 μmol·L-1) 0.8 μL, 引物R (5 μmol·L-1) 0.8 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O 7.4 μL；反应条件为：95℃预变性5 min, 循环1次, 95℃变性30 s, 退火30 s(nirS、nirK、nosZ和amx退火温度分别为50、55、58和50℃), 循环35次, 72℃延伸1 min.使用纯化后的PCR样品在上海美吉生物医药科技有限公司的Illumina MiSeq测序平台(Illumina Inc., USA)进行测序, 所得到的数据在该公司I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)分析, 去除低质量序列并进行筛分后, 选用相似水平为97%的OTU样本, 最终可得到微生物群落组成信息, 即不同细菌的相对占比.
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表 1 反硝化与厌氧氨氧化功能基因引物 Table 1 Primers for functional genes of denitrification and ANAMMOX |
1.5 统计分析
本研究中, 运用单因素方差分析(one way ANOVA)来确定各项理化性质、脱氮速率及功能基因丰度之间的显著性差异；皮尔逊相关分析(Pearson correlation)用于进一步评价数据之间的相关性；统计学显著性差异水平设置为P＜0.05.采用Excel 2010、SPSS 17.0和Origin 9.0进行所有的数据分析与绘图.
2 结果与分析 2.1 土壤/沉积物理化性质实验区域内农田、沟道、河岸带及湖泊的土壤/沉积物样本的基本理化性质测定结果如表 2所示, 不同生境差异性较大.土壤/沉积物的pH范围为5.44~7.97, 在不同土地利用类型中, 只有0~10 cm深的农田和沟道土壤呈弱酸性, 土壤pH值分别为5.98±0.11和5.89±0.14(n=5).沟道、河岸带土壤及湖泊沉积物含水率显著高于0~10 cm深的农田土壤含水率(P＜0.05), 农田不同层深土壤含水率无明显差别.随着深度的增加, 农田土壤的TOC呈下降趋势(P＜0.05), 与0~10 cm层的农田及沟道土壤相比, 河岸带和湖泊的TOC显著降低(P＜0.05).NH4+-N和NO3--N的最高含量均出现在0~10 cm深的农田土壤中(P＜0.05).各采样点NO2--N含量无明显差异.此外, 样品TOC与无机氮呈显著正相关(与NH4+-N：r=0.531, P=0.003；与NO3--N：r=0.453, P=0.012).
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表 2 土壤/沉积物物理化学性质1) Table 2 Physicochemical characteristics of study area soils/sediments |
2.2 潜在反硝化与厌氧氨氧化速率
根据Thamdrup等[15]的研究, 可由30N2和29N2浓度计算得到各土壤/沉积物样品的潜在反硝化与厌氧氨氧化速率(图 1).本研究结果表明, 在农田各层土壤中, 反硝化速率范围为0~14.07 nmol·(g·h)-1, 0~10 cm土壤层反硝化速率显著高于其他土壤层(P＜0.05), 达到(11.51±1.04)nmol·(g·h)-1, 而0~10 cm土壤层厌氧氨氧化速率最低, 为(0.04±0.01)nmol·(g·h)-1, 20~30 cm土壤层厌氧氨氧化速率显著高于其他层(P＜0.05), 达到(0.48±0.07)nmol·(g·h)-1.各土地利用类型中, 与0~10 cm农田土壤相比, 沟道、河岸带及湖泊样品的反硝化速率显著降低(P＜0.05), 沟道土壤厌氧氨氧化速率显著高于农田0~10 cm、河岸带土壤及湖泊沉积物(P＜0.05).
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(a)土壤剖面不同层深土壤中脱氮速率变化；(b)不同土地利用类型0~10 cm土壤/沉积物中脱氮速率变化；柱状上不同的小写字母表示反硝化/厌氧氨氧化速率在不同采样地之间统计上具有显著性差异(P＜0. 05) 图 1 潜在反硝化与厌氧氨氧化速率 Fig. 1 Potential rate of denitrification and ANAMMOX |
样品的Illumina MiSeq测序结果表明, 研究区域土壤中反硝化微生物所在的门主要是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 而厌氧氨氧化微生物存在于浮霉菌门(Planctomycetes).微生物群落测定结果显示(图 2), 农田0~10 cm、20~30 cm、60~70 cm、沟道、河岸带土壤及湖泊沉积物中反硝化微生物所在门的占比分别为43.0%、45.0%、43.5%、47.7%、42.9%和60.4%, 厌氧氨氧化微生物所在的浮霉菌门丰度分别是5.3%、4.1%、2.8%、6.1%、3.3%和2.3%.
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图 2 各采样点微生物门级别相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of the phyla identified in different soils |
各采样点反硝化功能基因(亚硝酸盐还原酶nirK、nirS和氧化亚氮还原酶nosZ)及厌氧氨氧化基因(amx)绝对丰度的测定结果如图 3所示, 30个样品中nirK、nirS、nosZ和amx的丰度范围分别是7.5×105~1.2×108、2.3×106~1.6×108、3.2×105~7.1×107和3.1×105~2.3×107 copies·g-1.在农田各层土壤中, 0~10 cm层的各基因丰度均显著高于其他土壤层(P＜0.05)；在不同土地利用类型样品中, 农田0~10 cm层nosZ与amx基因丰度显著高于沟道、河岸带及湖泊(P＜0.05)；nirS基因丰度比nirK基因丰度在环境中更高, 且反硝化功能基因nirS和nirK丰度均显著高于厌氧氨氧化功能基因丰度(P＜0.05).
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柱状上不同的小写字母表示反硝化/厌氧氨氧化速率在不同采样地之间统计上具有显著性差异(P＜0.05) 图 3 各采样点功能基因绝对丰度 Fig. 3 Absolute abundance of the functional genes in different soils |
本研究结果表明(图 4), 土壤样品反硝化速率与TOC、NH4+-N和NO3--N呈显著正相关(P＜0.05), 与前人的研究结果一致[6, 20~22], 这是由于大部分反硝化菌属于异养菌, 异养反硝化菌的世代时间明显低于自养菌, 它们需要丰富的有机碳作为电子供体进行反硝化[23]；在自然环境中, NH4+-N经硝化过程被氧化为NO3--N, 而NO3--N是反硝化过程的底物, 故无机氮含量高的环境有利于反硝化的进行.反硝化适宜的pH为7.5, 在各采样点中, 不同于其他采样点的近中性环境, 农田和沟道表层土壤pH呈弱酸性(表 2), 而这两处反硝化速率又明显高于其他环境, 可能受此影响, 加之其他环境因子的共同作用, 致使统计上表现为反硝化速率与pH显著负相关.不同于其他研究[4, 7, 24], 厌氧氨氧化速率与TOC、NH4+-N、NO3--N及反硝化速率之间均无显著相关性(P>0.05), 这可能是因为各采样点的厌氧氨氧化速率太低, 受到的干扰较大.
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图 4 反硝化和厌氧氨氧化速率与环境因子相关性 Fig. 4 Correlations of denitrification and ANAMMOX rate with environmental factors |
在硝酸盐还原过程中, 第二步是亚硝酸盐的还原, nirS和nirK这两个基因用于编码亚硝酸盐还原酶, 而第三步N2O至N2则需要nosZ编码的氧化亚氮还原酶来催化[25, 26].统计分析结果表明, 反硝化速率与nirS、nirK及nosZ等功能基因的绝对丰度均呈显著正相关(图 5), 这与Ding等[16]和Zhi等[17]的研究结论相符；同时, 由于本研究是以N2产生表示反硝化, 直接决定这一过程的nosZ的相关性与显著性(r=0.629, P=0.000)均高于nirS(r=0.367, P=0.046)和nirK(r=0.385, P=0.036)；nirS基因比nirK基因在环境中更为丰富, 表示它在亚硝酸盐还原过程中的主导作用, 这与前人的研究结论[17, 26]相符；反硝化功能基因nirS和nirK丰度均明显高于厌氧氨氧化功能基因丰度(P＜0.05), 说明大部分环境中反硝化微生物丰度显著高于厌氧氨氧化微生物丰度.这些结果从分子水平上解释了反硝化速率的差异性.然而, 厌氧氨氧化速率与amx之间并无显著相关性[图 5(d)], 可能是由于引物覆盖不全和PCR扩增偏差, 所选的amx不能全面覆盖厌氧氨氧化微生物的多样性, 也有报道称是mRNA而不是基因丰度与N2通量密切相关[21].值得一提的是, nosZ丰度与TOC、NH4+-N和NO3--N含量均呈显著正相关, 这可以进一步解释环境因子通过影响功能微生物进而对反硝化速率产生影响.
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图 5 反硝化和厌氧氨氧化速率与功能基因绝对丰度相关性 Fig. 5 Correlations of denitrification and ANAMMOX rate with absolute abundance of functional genes |
MiSeq测序结果表明, 反硝化速率及厌氧氨氧化速率与门级别或属级别的微生物群落相对丰度均无显著相关性, 这可能受不同土壤层、不同土地利用类型中微生物绝对丰度、多样性及功能微生物活性不同的影响[16, 27].
3.3 氮肥迁移与反硝化/厌氧氨氧化速率变化本研究结果表明, 在氮肥的垂直迁移方向上, 即农田各层土壤中, 反硝化最为活跃的区域是0~10 cm土壤层(图 1), 产生的N2占3个土壤层反硝化总量的94.9%, 表明表层土壤反硝化占绝对主导地位, 这与Zhou等[27]的研究结论一致, 且本研究中农田表层土壤最高反硝化速率[14.07 nmol·(g·h)-1]与该研究中的稻田表层土壤[13.40 nmol·(g·h)-1]相接近.大部分反硝化菌为异养菌, 厌氧氨氧化菌以自养菌为主.反硝化速率随土壤深度的增加而显著降低(P＜0.05), 这是由于TOC、NH4+-N和NO3--N等底物的减少所致(表 2), 同时表层土壤功能微生物更为活跃, 相关功能基因绝对丰度更高(图 3).尽管表层土壤中厌氧氨氧化过程可以忽略不计, 但它却是深层土壤中N2的重要来源, 且20~30 cm层的厌氧氨氧化速率超过60~70 cm层, 这种趋势的原因可能是20~30 cm层缺氧环境比较稳定, 干扰小于0~10 cm表层土壤, 在农业生产中表层土壤经常受到扰动, 导致氧气渗透到土壤中, 而与60~70 cm层相比, 20~30 cm土壤层存有更多的营养物质可以支持厌氧氨氧化过程.然而, 可能受采样季节不同的影响, 本研究中农田土壤厌氧氨氧化速率[0.01~0.67 nmol·(g·h)-1]显著低于Zhu等[14]研究的嘉兴稻田土壤[0.25~1.45 nmol·(g·h)-1]和Yang等[4]研究的中国南方稻田土壤[0.14~2.63nmol·(g·h)-1].
本研究结果还表明, 氮肥在水平方向上随地表径流从农田迁移至湖泊, 不同土地利用类型中反硝化速率以农田为最高.相比于沟道、河岸带和湖泊, 农田表层土壤中有更为丰富的TOC、NH4+-N和NO3--N等营养物质(表 2)可以支持更高的反硝化微生物活性, 这可能是稻田土壤更有利于反硝化的原因, nirS、nirK及nosZ等反硝化功能基因绝对丰度的变化也与此一致(图 3).沟道土壤中厌氧氨氧化速率最高, 这可能是土壤含水率最高而创造的缺氧条件以及丰富的NH4+-N和NO3--N长期共存共同作用的结果[28].
3.4 反硝化与厌氧氨氧化脱氮贡献的比较因为环境因子及功能微生物的分布与活性各不相同, 反硝化与厌氧氨氧化对不同土壤层及不同土地利用类型表层土壤中的N2产生有着不同的贡献.在本研究区域内, 农田0~10 cm土壤层中反硝化过程是产生N2的最大贡献者, 占该层N2总产量的99.7%；而在20~30 cm土壤层, 厌氧氨氧化对该层N2产生的贡献率与反硝化相接近, 达到45.5%；而当土壤深度为60~70 cm时, 虽然厌氧氨氧化与反硝化速率均较低, 但厌氧氨氧化过程N2占比达到67.5%, 成为该层N2的最大贡献者, 这与Yang等[4]、Zhu等[14]和Xi等[29]的研究结论类似.尽管在表层土壤以下, 厌氧氨氧化速率高于反硝化速率, 但这些土壤层的N2产生总速率只有表层土壤的10%左右, 因此, 反硝化过程是农田土壤N2产生的主要原因, 厌氧氨氧化过程对于深层土壤N2产生具有显著贡献.对于不同土地利用类型的表层土壤, 除农田外, 沟道、河岸带土壤及湖泊沉积物等环境中厌氧氨氧化过程对于N2产生的贡献在5.8%~8.1%, 说明在这些环境中反硝化仍然是N去除的主要贡献者, 而厌氧氨氧化过程也不能忽略.然而, 本研究中厌氧氨氧化对N2产生的贡献显著低于其它生态系统, 如海洋沉积物(20%~80%)[15], 沉积物岩芯(59%)[30], 河口沉积物(17%~77%)[31]等, 这可能是由于本研究区域内更高的反硝化活动所致.
值得说明的是, 15N同位素示踪培养实验中, 需要添加外源15N底物和预培养以在实验前去除泥浆中所有的本底NO2--N、NO3--N和O2, 添加过量的15N底物和延长培养改变了微生物群落和不稳定有机碳的可用性, 这可能导致高估反硝化和厌氧氨氧化速率[3, 4, 21].因此, 尽管本研究已经证明了反硝化与厌氧氨氧化在氮素迁移过程中脱氮的重要性, 进一步的研究可以建立原位条件以更准确地评估反硝化及厌氧氨氧化在N去除方面的贡献.
4 结论(1) 土壤/沉积物反硝化速率与TOC、NH4+-N和NO3--N含量均呈显著正相关.
(2) 土壤/沉积物反硝化速率与功能基因nirS、nirK及nosZ的绝对丰度均呈显著正相关.
(3) 受TOC、NH4+-N和NO3--N等营养物质及功能微生物的功能基因丰度的共同影响, 在农田氮迁移竖直方向上, 即在农田不同土壤层中, 表层土壤反硝化速率最高, 达到(11.51±1.04)nmol·(g·h)-1, 20~30 cm土壤层厌氧氨氧化速率最高；从农田氮迁移水平方向上看, 农田表层土壤反硝化速率显著高于沟道、河岸带土壤及湖泊沉积物(P＜0.05).
(4) 在各土地利用类型表层土壤中, 反硝化贡献了绝大部分N2的产量(91.9%~99.7%), 而厌氧氨氧化对于深层土壤N2的产生具有显著贡献.
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