近几十年来, 随着工农业生产的发展, 农村、城市的地下水都存在着不同程度的氮污染问题, 农业化肥的过量使用, 尤其是氮肥的过量使用和动物排泄物的处置不当, 使世界许多地方地表水和地下水中硝酸盐的含量不断升高, 硝酸盐污染正日益受到人们广泛地关注, 如何去除水体中的硝酸盐污染已成为迫切需解决的问题^[1].传统的硝酸盐生物处理以异养反硝化过程为主, 该过程需持续消耗有机物, 剩余污泥产量较大, 同时产生N₂ O、NO和CO₂等温室气体^{[2, 3]}.因此开发高效清洁、环境友好的新工艺对于水体中硝酸盐的去除具有重要意义.

Fe⁰廉价易得、具有较强的化学还原性, 因此长期以来就作为化学还原剂用于去除城市污水、工业废水等水体中的硝酸盐污染物^[4~6].同时, 研究发现某些微生物在厌氧条件下、可将低价铁(Fe⁰或Fe²⁺)氧化为高价铁(Fe³⁺)同时将硝酸盐还原为氮气, 这一过程即为铁自养反硝化^[7~10].相比异养反硝化工艺, 这一过程完全不需要外源性有机碳源、无温室气体排放、有望成为颇具优势的绿色生物脱氮技术.近年来, 研究报道厌氧氨氧化(anaerobic ammonia oxidation, ANAMMOX)微生物也具备利用Fe⁰或Fe²⁺为电子供体还原硝酸盐的潜能. Oshiki等^[11]在严格厌氧条件下通过批次实验, 提出ANAMMOX菌可以利用Fe²⁺为电子供体, 将硝酸盐还原成氮气.周健^[12]发现ANAMMOX微生物可以加快Fe⁰还原硝酸盐的反应速率、同时液相中出现明显氮损失.因此, 基于ANAMMOX菌的铁自养反硝化技术有望成为去除水体硝酸盐的新工艺.同时, ANAMMOX工艺自身会产生一定量的硝酸盐副产物, 往往需增加反硝化工艺使出水达标^[13].若ANAMMOX菌能通过利用Fe⁰实现对硝酸盐副产物的原位处理, 避免出水中硝酸盐残留的问题, 将提高整体工艺的脱氮效率、缩减工艺流程.

然而, Fe⁰在pH近中性或偏碱性水溶液中, 表面极易形成Fe₃O₄、γ-FeOOH等铁氧化物, 导致Fe⁰钝化, 阻碍固、液相之间的电子传递, 最终致使反应体系难以长期稳定运行.因此, 基于ANAMMOX微生物的铁自养反硝化相关基础研究仍停留在实验室阶段, 且大多通过批次实验的方式、或在厌氧箱内进行, 研究更多地关注于硝酸盐的去除效果, 而该反应是否可以连续流的方式稳定运行、条件如何控制等方面仍有待研究^[14~18].此外, 在这一过程中ANAMMOX微生物群落的变化、代谢机理、功能基因表达等分子生物学相关基础研究必须通过长期培养的实验方法开展, 而现阶段由于缺少能使反应器长期运行的实验手段, 相关研究仍有待进一步探索.因此, 保证该体系的长期、稳定运行不仅是ANAMMOX微生物铁自养反硝化工艺开发的重要内容之一、同时也是开展ANAMMOX微生物群落的变化和硝酸盐的代谢转化途径等相关基础研究的必要前提.

本研究在不同反应条件下考察ANAMMOX菌利用Fe⁰去除硝酸盐反应的可持续性和稳定性, 探讨合适的运行条件使该反应能长期稳定进行, 通过提供一种利用ANAMMOX菌进行硝酸盐废水处理的新思路, 以期为后续开展ANAMMOX菌以Fe⁰为电子供体还原硝酸盐这一代谢途径的相关基础研究提供实验手段.

1 材料与方法 1.1 实验装置

本实验中平行运行4个连续流上流式反应器, R1为对照组, R2、R3和R4为实验组, 实验装置如图 1所示.反应器采用有机玻璃制成, 顶部加盖, 在中部设置回流点.反应器内径60 mm、高度230 mm, 有效容积0.65 L.反应器外壁用水浴套管包裹, 与外置恒温水浴槽相连, 使反应器内部温度恒定为(35±1)℃.为避免光照对ANAMMOX菌的抑制作用, 反应器外部用黑色塑料布包裹.反应器进水、出水由兰格蠕动泵(BT100-2J)控制, 水力停留时间为10 h.进水采用纯度为99.50%的氮气曝气除氧, 使DO浓度低于0.50 mg ·L^-1.

1.2 接种污泥与实验模拟废水

本实验接种的ANAMMOX污泥来自于实验室长期运行的有效体积为60.00 L的反应器, 污泥颗粒平均粒径1.60 mm、呈砖红色, 污泥性状较好, 总氮去除速率(NRR)在9 kg ·(m³ ·d)^-1左右.取上述ANAMMOX污泥, 分别向每个反应器内各投加80 mL, 污泥浓度MLVSS为3 150.00 mg ·L^-1.本实验采用人工配制的含硝酸盐废水, 其主要成分为：70.00 mg ·L^-1NaNO₃、125.00 mg ·L^-1KHCO₃、54.00 mg ·L^-1 KH₂PO₄和大量元素(包括CaCl₂ ·2H₂O、NaCl、MgSO₄ ·7H₂O和KCl).依照实验目的, 各反应器进水水质略有不同：R1、R2进水pH为7, R3进水pH在不同阶段分别为7、6、5和4, R4进水pH为5; R2进水中另含有0.75 mmol ·L^-1 Fe²⁺.各反应器运行条件如表 1所示.

本实验选用粒径100目的铁粉(铁含量≥98%), 使用前需活化, 即先用0.50 mol ·L^-1 HCl淘洗以去除表面氧化物, 再用脱氧一级水反复冲洗数次、直至浸出液的pH为中性.为避免被空气氧化, 活化后的铁粉立即使用.每个反应器内铁粉的初始投加量为20 g, R1、R2和R3在运行过程中不再更换铁粉, R4每7 d更换新的铁粉.具体操作为：将反应器中的污泥和铁粉混合物全部取出至烧杯中, 静置5 min, 由于铁粉比重较大会沉在底部, 将上层生物质倒出.随后用脱氧一级水数次淘洗烧杯里残留物直至将污泥完全从铁粉中分离出来; 最后将全部污泥倒回反应器中, 并投加20 g经活化后的新鲜铁粉.

1.3 测定指标和方法

运行过程中反应器进出水pH值、NH₄⁺-N、NO₂^--N、NO₃^--N、Fe²⁺、总Fe和ORP按照文献[19]进行测定, 如表 2所示.

1.4 扫描电子显微镜观察与能谱分析

用扫描电子显微镜(Quanta FEG 250, FEI, USA)观察污泥形态学特征.污泥样品先用10.00 mmol ·L^-1磷酸缓冲溶液清洗, 后加入2.50%戊二醛溶液(pH 7)于4℃冰箱里固定过夜, 最后依次用5.00%、10.00%、15.00%、20.00%、30.00%、50.00%、70.00%、90.00%和100.00%乙醇溶液梯度脱水, 且浓度梯度不可逆^[20].每个浓度梯度脱水10 min后真空干燥喷金, 最后利用能谱分析表面元素组成.

2 结果与分析 2.1 不同条件下硝酸盐去除效果及反应稳定性对比

反应器R1运行20 d中液相中氮素变化、硝酸盐去除率以及出水总铁浓度变化如图 2(a)所示.反应器运行的第1~2 d, 进水硝酸盐浓度为70.00 mg ·L^-1, 出水硝酸盐浓度约为42.11 mg ·L^-1, 硝酸盐去除率仅为40.24%.这一阶段为ANAMMOX菌对该体系的适应期.从第3 d开始, 出水硝酸盐浓度迅速下降, 硝酸盐去除率达到74.82%.在第3~9 d期间, 出水硝酸盐浓度稳定在(15.29±4.58)mg ·L^-1, 硝酸盐去除率保持在68.54%~87.04%, 平均总氮去除率为67.00%.这一阶段为R1的稳定期, 共持续7 d.从第10 d开始, 出水硝酸盐浓度呈上升趋势, 到了第20 d出水硝酸盐浓度达到60.97 mg ·L^-1, 此时硝酸盐去除率仅为13.16%, 反应器难以继续运行.在R1运行期间, 出水中检测到少量的氨氮和亚氮积累, 平均浓度分别为5.06 mg ·L^-1和2.65 mg ·L^-1.此外, 出水总铁浓度与硝酸盐去除率呈正相关的趋势.在3~9 d硝酸盐去除率较稳定的情况下, 出水总铁浓度为(148.78±10.09)mg ·L^-1.而在第10~20 d期间, 硝酸盐去除率持续降低, 同时出水中溶出的总铁浓度也越来越低.由此可见, 以直接投加Fe⁰的方式运行, 反应器运行至多20 d, 其中稳定运行天数为7 d, 难以持续稳定地进行.

有研究报道, 在Fe⁰还原硝酸盐体系内添加Fe²⁺可以促进Fe⁰与硝酸盐之间的电子传递^[21], 因此反应器R2的进水中外加0.75 mmol ·L^-1 Fe²⁺(其他条件与R1相同), 以考察这种方式是否有利于强化ANAMMOX菌利用Fe⁰去除硝酸盐体系稳定性与可持续性. R2运行过程中液相氮素变化、硝酸盐去除率以及出水总铁变化如图 2(b)所示.与R1类似, 在经过短暂的适应期后, 出水硝氮浓度快速下降.在反应器运行的第3 d, 出水硝酸盐浓度为12.64 mg ·L^-1, 硝酸盐去除率达到82.16%.第3~12 d为稳定期, 共持续10 d; 在此期间出水硝酸盐浓度在18.54 mg ·L^-1左右波动, 硝酸盐去除率保持在65.72%~82.16%, 平均总氮去除率为52.00%.第13 d, R2出水硝酸盐浓度升高至36.87 mg ·L^-1, 硝酸盐去除率为42.62%.此后出水硝酸盐浓度继续呈上升趋势.第20 d, 出水硝酸盐浓度达到42.86 mg ·L^-1, 硝酸盐去除率仅为33.17%, 反应器难以继续维持.在R2运行期间, 出水中检测到少量的氨氮和亚氮积累, 平均浓度分别为8.12 mg ·L^-1和3.90 mg ·L^-1.与R1相似, R2出水总铁浓度与硝酸盐去除率也呈正相关.在3~12 d稳定期内, 出水总铁浓度达到最高, 约(198.63±9.65)mg ·L^-1.而第13~20 d内, 硝酸盐去除率不断下降, 同时反应器内溶出的总铁浓度也越来越低.结果表明, 在R2中加入一定浓度的Fe²⁺在一定程度上提高了反应器的稳定性, 与R1相比, 反应器稳定期由7 d延长至10 d, 但仍然无法解决体系长期稳定运行的问题.

pH值也是影响Fe⁰表面钝化速率的主要因素之一. pH酸性条件有利于抑制Fe⁰表面形成铁氧化物、减缓钝化程度^[22].因此, 在反应器R3中通过降低进水pH, 以考察是否能达到强化反应稳定性的目的.按照进水pH为7、6、5和4将运行过程划分为4个阶段, 期间液相氮素变化、硝酸盐去除率以及出水总铁变化如图 2(c)所示.第一阶段pH为7, 经过短暂的适应期, 从第3 d开始硝酸盐去除率快速上升, 于第5天达到最大值71.63%, 并在第4~8 d内保持相对稳定.第9 d开始, 出水硝酸盐浓度不断升高.第二阶段, 降低进水pH为6.出水硝酸盐浓度经过先下降后上升的变化, 第23 d硝酸盐去除率仅为13.83%.第三阶段, 继续降低进水pH为5, 出水硝酸盐浓度依然呈现先降后升的趋势, 期间硝酸盐去除率最大值为66.78%, 但此后不断下降, 第35 d仅为8.57%.第四阶段pH为4, 出水硝酸盐浓度始终大于40.93 mg ·L^-1, 反应器无法继续运行.在反应器R3运行期内, 出水中始终检测到少量氨氮和亚氮积累, 平均浓度分别为3.40 mg ·L^-1和1.30 mg ·L^-1.同样地, 反应器R3出水总铁浓度与硝酸盐去除率呈正相关.对比各个阶段硝酸盐的去除效果, 当进水pH在5~7之内变化时, 对硝酸盐去除效果及反应稳定性的影响并无显著差异.而pH为4时, 显然ANAMMOX菌的生物活性受到抑制, 硝酸盐去除率也明显降低, 不利于该反应的发生.因此, pH在5~7之间变化对ANAMMOX菌利用Fe⁰去除硝酸盐这一生物过程的影响并不显著.换言之, 通过调节进水pH值的方式仍然无法使该体系长期稳定运行.

基于上述实验结果, 在反应器R4中, 保持进水pH为5, 采用每7 d更换新鲜铁粉的方式, 探讨这一措施是否能有效强化反应器的稳定性.运行期间液相氮素变化、硝酸盐去除率以及出水总铁变化如图 2(d)所示, 其中灰色条带代表更换铁粉.结果表明, 通过定期更换铁粉的方式, 反应器能实现稳定运行.在长达60 d的运行期间, 出水硝酸盐平均浓度为17.23 mg ·L^-1, 硝酸盐去除率为75.00%, 实现了硝酸盐的有效、稳定去除.运行期内, 出水中始终检测到氨氮和亚氮积累, 平均浓度分别为12.54 mg ·L^-1和2.55 mg ·L^-1.同样地, 反应器R4出水总铁浓度与硝酸盐去除率呈正相关, 运行期间平均出水总铁浓度为259.86 mg ·L^-1.

在上述4种不同运行条件下, ANAMMOX菌利用Fe⁰去除硝酸盐反应体系的稳定性存在明显差异, 如表 3所示. R1的稳定性最差, 稳定运行期只有7 d; 其次是R2和R3, 稳定运行天数分别10 d和15 d; 而R4可以长期稳定运行.另一方面, 对比各反应器硝酸盐去除效果, R1和R2的硝酸盐去除率平均值比较接近, 分别为52.77%和57.65%, R3硝酸盐平均去除率最低, 约为40.72%, 而R4硝酸盐平均去除率能够达到75.00%, 显著优于其他实验组.本实验结果表明, 在连续流、非严格厌氧的条件下, 保持体系内有足够的、有活性的Fe⁰是维持反应器长期稳定运行的关键因素, 通过定期更换新鲜铁粉的方式能够使该反应体系稳定运行.而通过投加一定浓度的Fe²⁺和适当降低进水pH值, 对于强化反应稳定性的作用并不显著.

2.2 ANAMMOX微生物的SEM与能谱分析

为了考察在Fe⁰长期作用下、ANAMMOX微生物形态学的变化, 选取反应器R4中的ANAMMOX微生物为代表, 对接种污泥以及第60 d的ANAMMOX微生物进行扫描电子显微镜(SEM)分析, 以观察在Fe⁰长期作用下微生物表面形态的变化.由图 3(a)和3(c)可以清楚地看出, 接种污泥以球状菌为主, 并且表面十分光滑.在反应器长期运行后, 微生物表面形态发生了明显变化.在图 3(b)和3(d)中, 很难看到球状外型的菌体, 大部分微生物呈不规则形状, 表面附着了大量片状、结晶状物质, 对比接种前变得粗糙.进一步对微生物表面的化学成分进行能谱分析, 结果如图 4所示, 接种污泥表面以C、O和S元素为主, 分别占65.50%、31.50%和2.10%, 而Fe含量较低仅为0.40%.而经长期培养后, 微生物表面元素成分发生了明显变化, 其中C含量大幅降低至20.60%, 而O和Fe元素含量明显提高, 分别达到40.00%和37.50%, 与反应器运行初始时的微生物相比, 分别提高了1.30倍和94.00倍.由于在运行期内, 反应器出水中检测到一定浓度的总铁, 可以推测Fe⁰溶出的Fe²⁺会形成铁氧化物并附着在微生物表面.类似的结果在其他学者的研究中也有报道, Oshiki等^[11]的研究发现, 当给ANAMMOX菌提供硝酸盐和Fe²⁺作为基质时, 24 h后SEM照片显示ANAMMOX菌表面被小颗粒物质覆盖.这些附着在微生物表面的铁氧化物对还原硝酸盐的影响以及对ANAMMOX微生物代谢活性的影响还有待深入研究.

3 讨论

在铁自养反硝化生物脱氮过程中, 低价态的Fe²⁺或Fe⁰均可作为电子供体还原硝酸盐. Fe²⁺虽然更易被微生物直接利用, 但在非严格厌氧的连续流反应器中, Fe²⁺极易被氧化生成铁氧化物的沉淀, 导致Fe²⁺的实际利用率降低.而Fe⁰因为水解作用会不断溶出Fe²⁺, 即在Fe⁰与溶液间的固液界面上维持一定的Fe²⁺浓度, 可以提高微生物对Fe²⁺的利用率、促进硝酸盐的还原.即使部分Fe²⁺被氧化生成Fe³⁺, 由于Fe⁰的存在, Fe³⁺会被还原成Fe²⁺.这种Fe⁰、Fe²⁺和Fe³⁺的相互转化作用, 促使体系中有更多的Fe⁰转化为离子态铁(Fe²⁺或Fe³⁺), 大大提高了铁元素的生物利用率.同时, Fe⁰可以NO₂^-为ANAMMOX菌提供更适宜的生长环境^[1].但基于Fe⁰生物脱氮工艺的开发也面临着困难和挑战, 其中最值得关注的就是Fe⁰表面钝化导致反应无法持续的问题.

如何缓解或避免Fe⁰钝化, 使反应体系能够连续稳定运行, 相关研究也给出了不同的运行策略：①调控进水pH值. pH是影响Fe⁰自养反硝化过程的关键因素之一, Fe⁰水解和化学还原硝酸盐均是酸驱动过程, pH值越低, 越有利于加速铁的表面腐蚀导致金属铁不断暴露于固液界面中, 从而保持Fe⁰的活性界面, 有利于反应体系稳定运行^{[21, 22]}.但是, pH过低对于微生物而言显然是不利的, 会抑制其代谢活性.反之, 当pH在近中性范围内, 微生物可以保持良好的活性, 但是Fe⁰的钝化会加剧, 对于反应进行依然不利.因此, 相关研究大多在pH为6~8范围内进行; ②添加Fe²⁺.研究表明在pH近中性条件下, Fe²⁺可以与Fe⁰表面形成的铁氧化物之间发生自发的电子传递, 加速Fe⁰与硝酸盐的反应, 同时缓解Fe⁰表面钝化^[23~25].因此, 补充Fe²⁺也被认为是可以缓解Fe⁰钝化、促进反应稳定进行的有效措施.

本研究也尝试通过补充一定浓度的Fe²⁺和在一定范围内降低进水pH值的方式缓解Fe⁰钝化, 实现反应器的稳定运行, 但结果表明这两种措施在非严格厌氧、连续流运行的反应器中, 对提高硝酸盐去除率以及强化反应器稳定性均无显著效果.在R2中添加一定浓度的Fe²⁺, 与对照组R1相比能够稳定运行10 d, 但还是无法达到持续运行的效果.其原因是采取连续流运行的方式使得反应器内并非处于严格的厌氧环境, Fe²⁺容易被氧化成Fe³⁺并生成铁氧化物, Fe²⁺实际利用率降低, 无法避免Fe⁰表面钝化的问题.在R3中, 进水pH在5~7范围内变化对强化反应器稳定性的作用也不显著, 推测是由于Fe⁰还原硝酸盐反应和ANAMMOX反应都需要消耗H⁺产生碱度, 因此在5~7范围内降低进水pH对反应器内pH的调节作用十分有限.在实验过程中, 对R3内pH的监测情况也证实反应器内始终是偏碱性环境.而当pH降低至4时, 明显会抑制ANAMMOX微生物的活性.因此, 虽然相关研究以批式实验的方式或借助厌氧箱在严格厌氧环境中进行短期实验, 通过补充Fe²⁺和维持较低的pH条件可以实现缓解Fe⁰钝化、延长反应时间的目的.但是, 在以连续流方式长期运行的反应器中, 上述措施并不能解决由于Fe⁰钝化导致反应器无法长期稳定运行的问题.因此, 在反应器R4中通过不断更换Fe⁰的方式实现了反应体系的长期稳定运行.作为开展微生物群落的变化、硝酸盐的代谢转化途径等相关基础研究的实验手段, 这一方式可以提供稳定的培养条件, 而且操作简便、成本较低.但同时, 作为相关工艺的运行策略, 更换铁粉这一方式的可操作性仍有待改进.

基于本研究的结果, 今后的研究可以考虑从两个方面开展：其一是开发可操作性强的方法, 保证反应器内的Fe⁰始终具有活性、避免钝化带来的负面影响.如结合材料学对Fe⁰改性、利用纳米铁技术或者开发含Fe⁰的双金属合金等, 也可通过对Fe⁰预磁化等方式缓解或避免由于Fe⁰的钝化带来的负面影响; 同时, 通过调节Fe⁰与硝酸盐、微生物的比例等措施进一步优化反应条件, 降低出水中氨氮残留浓度, 提高体系的总氮去除率; 其二, 利用本研究所提出的实验手段对ANAMMOX菌进行长期培养, 对Fe⁰和硝酸盐作用下的ANAMMOX菌群落变化、硝酸盐代谢途径、相关酶和功能基因表达等开展基础研究.

4 结论

(1) 基于ANAMMOX菌的铁自养反硝化工艺稳定性依赖于运行条件的控制, 缓解或避免Fe⁰钝化化是保证该反应体系稳定运行的关键因素.

(2) 在非严格厌氧条件下、以连续流运行的反应器中, 通过降低进水pH(5~7范围内)或投加一定浓度Fe²⁺的方式对强化该反应体系的稳定性有一定效果, 但并不显著.

(3) 通过定期换铁的方式, ANAMMOX菌利用Fe⁰去除硝酸盐反应体系能够实现长期稳定运行, 硝酸盐平均去除率为75.00%, 总氮平均去除率为54.02%.