2019, Vol. 40
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
近年来, 随着人口和经济的快速增长, 水环境污染日趋严重.大量未达标的生活污水、农业废水和工业尾水被排入自然水体中, 导致水体N、P、重金属以及其他有机质和有毒有害物质的污染越发严重.历史资料和调查结果显示, 近30年来, 水体富营养化程度明显上升[1], 大规模蓝藻水华在太湖[2]、滇池[3]等水体中频繁地暴发.目前, 控制蓝藻水华暴发的主要手段有物理清除、化学杀藻和生物控藻等方法[4].生物控藻中, 水生植物释放化感物质抑制藻类大规模繁殖, 是控制水华暴发的重要途径[5].
化感作用指植物(含微生物)向环境中释放化学物质以对其他的植物和微生物产生直接或者间接的促进、有害或者自毒作用[6, 7], 而其产生的化学物质则被命名为化感物质(allelochemic).根据化学结构与性质的不同, 可以分为酚类、酮类、醇类、醌类、类萜类、生物碱类以及酯类等近20个类别的物质[7].
水生植物化感抑藻的研究最早源于对植物根系与藻类之间数量消长关系的观察, 大量研究表明该类机制主要包括：化感物质影响藻类光合系统, 对藻类产生氧化胁迫以及影响其他生理生化过程等3个方面.化感物质可通过影响藻类放氧过程来抑制藻类生长, 例如壬酸可降低铜绿微囊藻的放氧速度[8]; 也可通过改变藻类的叶绿素含量[9]和光合系统电子传递速率来抑制藻类生长[10].另一方面, 一些植物分泌的化感物质可以影响藻类的抗氧化酶的活性[11~13], 甚至可以促使ROS大量堆积, 导致生物死亡[14].邻苯三酚和咖啡酸[15]能影响细胞膜的形态结构; 阿魏酸等酚酸类化感物质能抑制藻类吸收代谢氮、磷等元素[16, 17]; 还有一些化感物质能够影响细胞内呼吸作用[18], 抑制酯酶的活性[19].
不同水生植物能够抑制的浮游藻类的种类与起始浓度是不同的.例如：相比硅藻、绿藻等, 穗花狐尾藻对蓝藻的抑制效果最强, 其中包括铜绿微囊藻、湖丝藻等多种藻类, 且抑制效果和穗花狐尾藻的生物量相关[20, 21].穗花狐尾藻分泌的化感物质中对铜绿微囊藻起抑制作用的主要包括焦性没食子酸、鞣花酸、五倍子酸、儿茶酸、没食子单宁这5种酚酸类物质, 以及顺-6-十八碳烯酸、壬酸、反-9-十八碳烯酸这3种脂肪酸类[20, 21].轮叶狐尾藻对蓝藻门的湖丝藻与硅藻门的极小冠盘藻的抑制作用显著高于其他藻类[22]; 金鱼藻对蓝藻门的铜绿微囊藻、湖丝藻等以及绿藻门的小球藻、斜生栅藻和被甲栅藻及硅藻门的极小冠盘藻都有一定的抑制效果[21, 23, 24].
绿狐尾藻(Myriophyllum elatinoides)属于小二仙草科, 狐尾藻属, 原产地为南美洲, 为多年生沉水或浮水草本植物.目前, 有研究发现绿狐尾藻能通过促进水体的硝化和反硝化作用, 去除畜禽养殖废水中90%以上的总氮和84%的铵态氮[25].笔者推测绿狐尾藻通过分泌化感物质来影响nirS与nirK等关键基因的丰度, 促进硝化与反硝化作用, 但目前对于绿狐尾藻的化感抑藻作用以及化感物质的研究较少, 仅有绿狐尾藻对铜绿微囊藻和水华鱼腥藻这2种典型水华藻类的化感抑藻作用研究[26].本文以典型水华藻类铜绿微囊藻为对象, 进一步研究绿狐尾藻对不同起始浓度的铜绿微囊藻的化感抑制效果; 同时以常见淡水藻类羊角月牙藻[27]为对照, 了解绿狐尾藻对普通淡水藻类是否有抑制作用.在此基础上, 分离、分析并鉴定可能由绿狐尾藻分泌的化感物质类型, 以期为研究化感物质及控制水体富营养化提供思路与方法.
1 材料与方法 1.1 材料本研究用的绿狐尾藻, 取自中国科学院亚热带农业生态研究所长沙农业环境观测研究站. Hoagland营养液用于绿狐尾藻的无土扩大培养, 5 d更换一次培养液.在与绿狐尾藻共培养前, 用BG11培养液进行适应性培养7 d, 选取长势良好的备用.
本实验所用的藻种购自中国科学院水生生物研究所.铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB315)和羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum, FACHB271)均取7 mL藻种原液, 在BG11培养液中培养.使用钠灯在80 cm高度处照射(光周期为12 h :12 h)预培养7 d, 保持培养温度25℃[28].
1.2 实验方法 1.2.1 绿狐尾藻与铜绿微囊藻和羊角月牙藻共培养实验取66个500 mL的锥形瓶, 每个加入200 mL BG11培养液灭菌备用.绿狐尾藻分出33份各2.5 g左右, 超纯水冲洗浸泡.本实验藻类生长至对数期后, 用血球计数板法测定藻类密度, 按照起始藻密度的不同, 取不同体积藻液分别转接到已接种和未接种绿狐尾藻的锥形瓶中, 使各组培养液分别含105、106、107、108和109 ind.·L-1铜绿微囊藻或羊角月牙藻, 每组3个平行.另外, 分别设置3个不含以及3个含绿狐尾藻的空白对照[29].每天取样测定藻类培养液的光密度值, 连续检测10 d, 第0 d为培养3 h后取样.每次取5 mL混匀的培养液, 分别在680 nm和430 nm波长处测定铜绿微囊藻与羊角月牙藻的光密度值.
1.2.2 绿狐尾藻化感物质测定绿狐尾藻化感物质的提取方法参考文献[20, 30]：取足量的绿狐尾藻, 自来水洗净后用蒸馏水浸泡3次, 每次20 min.剪碎后用液氮研磨, 快速称取3份10 g重的绿狐尾藻粉末, 与甲醇(色谱纯)以1 :20(质量浓度)混合均匀, 常温下避光浸提48 h, 间歇搅拌, 浸提液用定性滤纸过滤.滤液用旋转蒸发仪(50℃, 300 mbar, 76 r·min-1)蒸干形成浸膏后, 用氮吹仪将其完全吹干形成粉末.粉末溶于10 mL甲醇(色谱纯), 并用0.1 mol·L-1 HCl将溶液pH调至3后, 4℃冷藏备用.
先用5 mL甲醇活化OASIS HLB固相萃取柱(Waters, 6cc), 再用5 mL 75%的乙醇进行平衡, 然后将备用的浸提液通过固相萃取柱, 之后用超纯水、甲醇(色谱纯)、丙酮(色谱纯)、石油醚(色谱纯)、正丁醇(色谱纯)各10 mL依次洗脱.固相萃取柱的流速为1~2 mL·min-1[31].
洗脱的各组分分别吹干后, 各加3 mL甲醇(色谱纯)溶解, 取1 mL用有机系滤膜过滤(0.22 μm), 滤液进行GC-MS检测. GC-MS的条件设置, 色谱柱：HP-5MS(长30 m, 内径0.25 mm, 膜厚0.25 μm); 载气：氦气(纯度≥99.99%, 1.3 mL·min-1); 升温程序：60℃保持2 min, 10 ℃·min-1升温至160℃, 保持1 min, 5 ℃·min-1升温至235℃, 保持1 min, 30 ℃·min-1升温至280℃, 保持5 min; 进样量：1 μL, 不分流进样; 进样口与检测口温度：260℃; 采用电子轰击源, 轰击电压70 eV, 扫描范围m/z 30~600 u, 以速度1.0 s进行全程扫描[32].
将绿狐尾藻以一定比例(50 g湿重: 2 L营养液)25℃室温培养一周后, 取200 mL营养液用滤纸过滤.过滤所得的绿狐尾藻生长液按前述步骤处理后进行GC-MS分析.
2 结果与讨论 2.1 绿狐尾藻对铜绿微囊藻及羊角月牙藻的化感抑制效果绿狐尾藻分别与铜绿微囊藻及羊角月牙藻进行共培养实验, 连续10 d检测对照组与相应实验组的藻类光密度值, 其动态变化如图所示(图 1和图 2).对不同起始浓度的藻类动态变化分别进行独立样本t检验(表 1), 结果显示, 在铜绿微囊藻起始浓度为105、107和108 ind.·L-1时, 对照组与实验组铜绿微囊藻的光密度值在实验期内(10 d)出现显著差异; 而羊角月牙藻对照组与实验组的光密度值在5个起始浓度中均没有显著差异.
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图 1 绿狐尾藻对不同起始浓度的铜绿微囊藻的光密度值变化影响 Fig. 1 Effects of Myriophyllum elatinoides on the optical density of Microcystis aeruginosa with different initial concentrations |
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图 2 绿狐尾藻对不同起始浓度的羊角月牙藻的光密度值变化影响 Fig. 2 Effects of Myriophyllum elatinoides on the optical density of Selenastrum capricornutum with different initial concentrations |
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表 1 不同起始浓度条件下绿狐尾藻对两种藻类生长影响的独立样本t检验1) Table 1 The t-test analysis of the effects of Myriophyllum elatinoides on the growth of two species of algae at different initial concentrations |
图 1(a)显示, 105 ind.·L-1起始浓度的铜绿微囊藻, 10 d内并没有明显生长, 光密度值在误差范围内基本约等于零, 尽管在该浓度下, 对照组与实验组的光密度值存在显著差异, 绿狐尾藻的抑藻作用并没有体现.同样, 绿狐尾藻对铜绿微囊藻在106 ind.·L-1起始浓度时的生长抑制作用也不显著[图 1(b)和表 1].当铜绿微囊藻起始浓度为107ind.·L-1及108ind.·L-1时[图 1(c)和1(d)], 对照组的光密度值有明显的上升, 但实验组的铜绿微囊藻的生长受到了显著的抑制, 显著性检验结果分别为P < 0.05及P < 0.01(表 1).铜绿微囊藻起始浓度为107 ind.·L-1时, 从第5 d开始, 对照组与实验组的光密度值差异就较为明显, 且此后差异越来越明显; 当起始浓度为108 ind.·L-1时, 光密度的差异从第4 d开始.但是如图 1(e)所示, 在109 ind.·L-1的起始浓度下, 实验组的光密度值一直高于对照组, 所以绿狐尾藻并未对铜绿微囊藻的生长起到抑制作用.而在羊角月牙藻的共培养实验中, 绿狐尾藻对5个起始浓度的羊角月牙藻(105、106、107、108及109 ind.·L-1)在培养时间内均无显著的抑制生长作用(图 2和表 1).
综上所述, 2.5 g·(200 mL)-1的绿狐尾藻能对起始浓度107ind.·L-1和108 ind.·L-1的铜绿微囊藻的生长起到很好的抑制效果; 但在105 ind.·L-1和106 ind.·L-1起始浓度时, 由于藻类浓度过低, 绿狐尾藻并未产生强烈的抑制作用; 而对于109 ind.·L-1的起始浓度的铜绿微囊藻, 由于起始浓度过高, 2.5 g·(200 mL)-1的绿狐尾藻未能抑制藻类的生长.
有研究指出, (15±5) g·(8 L)-1的黄丝草对初始浓度106 ind.·L-1和107 ind.·L-1的铜绿微囊藻有明显的抑制作用; (15±5) g·(8 L)-1的马来眼子菜对初始浓度108 ind.·L-1的铜绿微囊藻有明显的抑制作用; (15±5) g·(8 L)-1的菹草对初始浓度105 ind.·L-1和106 ind.·L-1的铜绿微囊藻有明显的抑制作用[29].所以, 相比本文的研究结果可知, 多种水生植物对铜绿微囊藻都有化感抑藻作用, 但是不同水生植物抑制铜绿微囊藻生长所对应的藻类起始浓度不同, 且对应的水生植物最小生物量也不同.但共同点是它们在铜绿微囊藻起始浓度过低时均无化感抑制作用, 浓度过高时化感作用无法抑制其生长.本实验中铜绿微囊藻浓度过高时, 与绿狐尾藻共培养时生长速度反而快于对照组, 该现象还需进一步实验分析.
另外, 对羊角月牙藻的化感抑制研究发现, 芦苇及菖蒲对其有明显的抑制作用[27, 33], 而加拿大一枝黄花则基本没有明显的抑制效果[34].不同水生植物对羊角月牙藻化感抑制效果不同, 有的水生植物对羊角月牙藻生长并没有抑制效果, 也说明了水生植物的抑藻作用是有选择性的, 不同的水生植物可抑制不同类型的藻类[35].本文中绿狐尾藻对羊角月牙藻生长无抑制作用, 可能是羊角月牙藻对绿狐尾藻和加拿大一枝黄花释放的化感物质耐受性高[26].
对比两种藻类生长情况可知, 铜绿微囊藻对绿狐尾藻化感物质的耐受性比羊角月牙藻低[26].据此推测, 绿狐尾藻可用于蓝藻水华泛滥水域的治理, 既能抑制铜绿微囊藻和水华鱼腥藻两种典型水华藻类的生长, 又不会抑制常规淡水藻类羊角月牙藻生长, 这就间接提高了其他非水华藻类的生长竞争力, 使水域向一个良性状态发展[26, 27].
2.2 绿狐尾藻化感物质分离鉴定结果与分析对绿狐尾藻的浸提液与生长液进行GC-MS检测(图 3和图 4), 选取两者当中皆有特征峰的物质与谱库进行比对, 结果显示, 出峰时间在6.579、7.660、20.469及21.241 min的物质分别为3-乙基-3-甲基庚烷、磷酸三乙酯、棕榈酸和酞酸二丁酯; 其中, 棕榈酸在之前的研究报道中已确定为水生植物分泌的化感物质之一.棕榈酸属饱和脂肪酸类化感物质, 在香蒲、芦苇、马来眼子菜、穗花狐尾藻等水生植物中都存在[35, 36].在绿狐尾藻的浸提液与生长液中均检测出棕榈酸, 这证明绿狐尾藻自身产生的棕榈酸能分泌到外界水环境中; 并且研究证明, 其同类穗花狐尾藻可抑制铜绿微囊藻生长, 而起主要作用的是酚酸类和脂肪酸类化感物质[20, 21], 所以棕榈酸作为一种脂肪酸类化感物质有较大可能是绿狐尾藻抑制铜绿微囊藻生长的一种关键化感物质.根据Li等[25]的研究, 笔者推测绿狐尾藻的化感物质可影响水体中反硝化作用关键基因(nirS与nirK)的丰度.所以, 在后期实验中可向富营养化水体中单独投加棕榈酸, 来验证其是否会影响nirS与nirK基因的丰度.另外3种物质中磷酸三乙酯和酞酸二丁酯都属于比较常见的酯类化感物质, 而3-乙基-3-甲基庚烷同类型的较为少见, 但是三者在已知有关化感物质的报道中并未提及, 所以需后续抑藻实验才能确定是否为化感物质.
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图中1、2、3及4分别代表: 3-乙基-3-甲基庚烷、磷酸三乙酯、棕榈酸及酞酸二丁酯, 下同 图 3 绿狐尾藻浸提液GC-MS出峰图谱 Fig. 3 GC-MS spectrum of Myriophyllum elatinoides' extract |
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图 4 绿狐尾藻生长液GC-MS出峰图谱 Fig. 4 GC-MS spectrum of Myriophyllum elatinoides' culture solution |
(1) 2.5 g·(200 mL)-1的绿狐尾藻对起始培养浓度为107 ind.·L-1和108 ind.·L-1的铜绿微囊藻, 具有显著的抑制生长作用, 在铜绿微囊藻起始浓度过高(109 ind.·L-1)或者过低时(105 ind.·L-1和106 ind.·L-1)抑藻作用均不明显.
(2) 在实验范围内, 绿狐尾藻对羊角月牙藻的生长均没有显著的抑制作用.
(3) 对绿狐尾藻的浸提液和生长液进行GC-MS检测分析, 证明棕榈酸是绿狐尾藻的化感物质之一, 与化感抑藻作用相关, 并发现3种疑似绿狐尾藻分泌的化感物质, 有待后续实验验证.
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