2019, Vol. 40
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
塑料及其制品在工业、农业等行业中被广泛使用, 日常生活中, 人类也离不开塑料的存在.据报道, 全球每年的塑料使用量不少于2.4亿t[1].微塑料(microplastics, MPs)是一种人工合成的尺度小于5 mm的有机聚合物, 自然降解速度缓慢[2], 并能够在环境中累积、迁移和扩散[3].环境中微塑料的来源分为初级微塑料的直接排放和环境中各种大块塑料的分化降解这两种主要途径[4].初级微塑料一般是指牙膏、护肤品等含有的细小的塑料微球; 而人类丢弃或排放的塑料, 在长期的物理、化学作用下会分解成更为微小的塑料碎片、塑料条带或塑料颗粒.有研究表明, 洗衣机每洗一次衣服就产生至少1 900个微塑料[1].城市污水中存在着大量的微塑料, 即使污水经过处理后, 污水中仍能检测出大量的微塑料[5, 6].我国微塑料的污染比较严重, 东南沿海的闽江、瓯江和椒江的微塑料污染程度是发达国家的30~50倍[7].
有研究表明[4, 8], 微塑料对环境健康的影响主要存在3种效应：塑料中的着色剂、增塑剂等添加剂缓慢释放并直接污染自然环境; 微塑料表面易吸附疏水性的污染物, 并随着微塑料的迁移传播而扩散; 水体和土壤环境中, 微塑料可能会被生物摄食, 进而影响生物的生长繁殖发育, 并且这种危害可能随着食物链而放大.
抗生素在医疗领域拯救了无数的生命, 有力地保障了人类健康, 有效地增进了人类福祉[9].此外, 抗生素具有疾病预防和促进禽畜生长的作用, 广泛应用于畜牧水产行业[10, 11].长期以来, 抗生素在医疗健康领域以及养殖行业中, 存在着抗生素滥用和不合理使用现象, 抗生素的效用不断下降, 抗生素抗性(耐药性)的现象不断加重和蔓延[12].人类活动的影响下, 城市河水[13], 水稻土[14], 城市污水和垃圾渗滤液[15], 乃至地下水[16], 都检测出了多种抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs), 表明抗生素和抗性基因潜在的生态环境风险亟待进一步研究.
微塑料的比表面积大, 能够吸附解析有机污染物, 重金属, 并释放着色剂和增塑剂等[4, 17], 而且某些种类的微塑料能够有效吸附抗生素[18].微塑料复杂的表面结构, 能够为微生物提供一个丰富和特异的生存环境, 并形成一些特有的微生物群落[19, 20].陆地环境中的微塑料随着径流雨水进入河流, 沿海河口沉积物也检测出多种类型的微塑料[21, 22], 同时多种类型的抗生素抗性基因也在河口沉积物中被人类发现[23].因此, 入海河口沉积物是微塑料和抗生素抗性基因的热点区域, 但是国内外关于微塑料对河口沉积物抗生素抗性基因的研究还很少.本文采用微宇宙模拟培养方法, 在河口沉积物中添加微塑料, 采用高通量定量PCR方法研究抗生素抗性基因的种类、丰度、多样性和变化特征, 探究微塑料对河口沉积物抗性基因的影响, 以期为治理河流海洋微塑料污染、遏制环境抗生素抗性基因传播和环境政策制定提供科学根据.
1 材料与方法 1.1 沉积物样品采集与实验室模拟培养采样点位于厦门市同安区的西溪入海口.西溪流域涵盖了同安区的老城区和新城区, 是同安区最主要的人口聚集区和工业聚集区, 受人类活动影响大. 2017年5月退潮时段在西溪入海口采集获得新鲜沉积物后, 置于低温采样箱保存并尽快运送回实验室, 立即测定沉积物中的含水率, 一部分沉积物放在-20℃冰箱长期冻存(用于DNA提取等), 另一部分在4℃冷藏(用于后续培养实验).
PVC (聚氯乙烯)和PE (聚乙烯)是世界上产量最大的两种塑料产品(前体), 由于都是热塑性树脂, 是具有多种优良性能的消费品, 常常用于制造饮用水管、塑料袋等. PVA是一种生物可降解高分子材料, 具有较好的水溶解性, 在食品、药品包装等方面具有独特优势. 3个处理实验按照2%干重的比例分别单独添加PVC、PE和PVA这3种微塑料(经100目筛网过滤前处理).培养体系净重为500 g.设置不添加微塑料的空白对照组S_BLK以及分别添加3种微塑料的处理组(S_PVC、S_PE和S_PVA), 添加超纯水使得液面刚好没过沉积物1 cm, 适时添加超纯水保持培养水位, 在大棚温室中进行培养, 时间为1 a(图 1).
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图 1 添加不同微塑料的沉积物培养实验示意 Fig. 1 Microcosm incubation sketch of sediments with the addition of different microplastics |
温室培养满1 a后, 采集空白和3种不同微塑料处理的沉积物培养样品, 选用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, 美国)进行沉积物总DNA的提取.选取原始冻存样品和沉积物培养样品约0.5 g新鲜样品并称重, 共计15个样品, 分别添加到试剂盒中的Lysing Matrix E tube, 根据说明书提供的标准方法, 提取沉积物总DNA, 统一用100 μL DES进行洗脱, 并用1%的琼脂糖凝胶进行DNA电泳验证.所获得的DNA样品用QuantiFluor® dsDNA (Promega Corporation, 美国)试剂盒进行DNA浓度测定, 所得到的沉积物DNA样品置于-20℃冰箱保存.
1.3 抗生素抗性基因超高通量定量PCRSmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc., 美国)实时PCR反应平台一次能够同时进行5184个PCR反应, 反应体积为常规PCR体系的1/200, 具有超高通量、节约试剂和自动化程度高的特点.研究中所采用的296对引物说明如下：1对16S rDNA引物、4对整合子引物、8对转座子引物和283对抗生素抗性基因引物[24, 25].这些抗性基因引物涵盖了大部分已知的抗生素抗性基因类型, 整合子和转座子基因引物则用于研究潜在的水平基因转移情况.
高通量PCR扩增反应体系为100 nL. PCR体系中各个试剂的最终浓度为：1×LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix(Roche, 美国), PCR-grade water, 1 μg ·μL-1的BSA, 3 ng ·μL-1的DNA模板, 1 μmol ·L-1的上下游引物.高通量定量PCR反应条件为：初始温度95℃预变性10 min; 95℃变性30 s, 60℃退火延伸30 s并收集荧光信号, 总共40个循环; 仪器自动进行熔解曲线分析.每个SmartChip芯片都有不添加DNA模板(用灭菌超纯水替代)的阴性对照. PCR反应得到的数据通过Cycler预先设定的筛选条件(PCR扩增效率在1.8~2.2之间)进行导出.根据该仪器的灵敏度和精确度, 确定循环次数CT值为31时作为检测限.每个样品需进行3次技术平行实验, 当3次技术平行都被扩增出来时认为目标基因是有效的阳性扩增; 3个独立培养平行样品都是阳性扩增时, 认为该沉积物样品的目标基因被最终有效检出.
1.4 数据分析与处理在对沉积物样品进行16S rDNA常规定量PCR基础上, 参照已有的抗生素抗性相关的研究[23, 25], 计算沉积物样品抗性基因和可移动遗传元件的绝对拷贝数.同时, 根据rRNA数据库, 每个细菌约有4.0个rDNA基因[26], 计算归一化的抗生素抗性基因和可移动遗传元件丰度.
高通量定量PCR的数据采用Excel 2010进行计算, OriginPro 9.0进行相关作图, 采用R 3.3.3(The R Project for Statistical Computing, Vienna, Austria)进行PCA分析以、OLS回归分析及Pheatmap热图分析.
2 结果与讨论 2.1 检出的抗生素抗性基因种类数沉积物样品总共检测出91种抗生素抗性基因, 具体结果见图 2.原样沉积物(S_ORI)和空白对照沉积物(S_BLK)分别检测出60和57种抗生素抗性基因, 两者抗性基因种类数和组成没有显著差异.而添加了PVC、PE和PVA这3种微塑料的沉积物则分别检测出53、58和28种抗生素抗性基因, 并且抗性基因的组成(抗性谱)差异显著, 表明微塑料改变了沉积物抗生素抗性基因的组成结构.
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图 2 抗生素抗性基因种类数 Fig. 2 Detected number of antibiotic resistance genes |
沉积物中检测出的抗生素抗性基因根据相对应的抗生素类型可以归纳为以下八大类：氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside)、β-内酰胺类抗生素(β-Lactam)、氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇抗生素类(FCA)、大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素(MLSB)、多重抗药类(Multidrug)、磺胺类抗生素(Sulfonamide)、四环素类抗生素(Tetracycline)和万古霉素类抗生素(Vancomycin).
添加PVC和PE两种不易降解微塑料的沉积物(S_PVC和S_PE)抗性基因检出种类数虽然与原样沉积物(S_ORI)、空白对照沉积物(S_BLK)种类数接近, 但是有着不同的抗性基因种类组成结构, S_PVC、S_PE和S_PVA中的万古霉素类抗性基因(Vancomycin)种类数显著高于S_ORI和S_BLK.多重抗药基因(Multidrug)在S_PVC和S_PE检出种类数都是10种, 高于S_ORI(4种)和S_BLK(7种).有研究表明, 微塑料可以作为多重耐药基因的vector或者vehicle(运载工具), 促进多重耐药基因在环境中的迁移、传播和扩散[27], 这与本研究的结果一致.添加了可溶解微塑料(PVA)的沉积物(S_PVA)抗生素抗性基因仅检测出28种, 这可能是溶解的PVA使得土壤溶液变得黏稠, 改变了土壤的理化环境, 影响微生物生长繁殖, 使得微生物群落结构也随之发生显著改变, 对此需要进一步深入开展相关研究工作.
2.2 微塑料对抗生素抗性基因丰度的影响沉积物中总的抗生素抗性基因丰度(总的绝对丰度和归一化的绝对丰度)结果如图 3所示, 各个种类的抗生素抗性基因绝对丰度如图 4所示.添加微塑料的S_PVC、S_PE和S_PVA的抗生素抗性基因丰度分别为4.1×109、8.1×109和2.0×109 copies ·g-1, 均显著高于未添加微塑料的S_ORI(1.2×109 copies ·g-1)和S_BLK(1.2×109 copies ·g-1).添加PE微塑料的沉积物抗生素抗性基因丰度增加了近一个数量级, 这可能与PE这种微塑料相对其它微塑料更容易吸附抗生素[18], 进而形成具有抗生素选择压力的微环境有关.特别是S_PVA的抗性基因种类数虽然显著低于前四者, 只有28种(图 2), 但是抗性基因丰度却高于S_ORI和S_BLK, 表明PVA干扰了沉积物微生物过程, 微塑料显著地影响了沉积物抗生素抗性丰度.此外, 可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)不论在绝对丰度水平下, 还是在归一化水平下, 总体虽呈略微下降的趋势, 但仍然保留在较高丰度水平.而从抗性基因种类角度分析, 沉积物中的多重抗药基因的绝对丰度在这5种不同处理的沉积物中都是最高的(图 4), 并且S_PVC、S_PE和S_PVA的Multidrug类抗性基因显著高于S_ORI和S_BLK, 结果表明多重抗药基因可能是沉积物抗性组比较活跃的组成部分.
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图 3 抗生素抗性基因的绝对丰度和归一化丰度 Fig. 3 Absolute and normalized abundance of ARGs and MGEs |
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图 4 各类抗生素抗性基因的绝对丰度 Fig. 4 Absolute abundance of ARGs |
微塑料复杂的表面结构, 对不同的环境污染物质有着不同的吸附解析能力, 深刻影响微生物群落结构组成, 容易形成微生物膜并促进基因交流传播[28], 因此, 本实验证实了微塑料显著增加了沉积物抗生素抗性基因的丰度.
2.3 抗生素抗性基因的分布格局特征通过聚类热图(Pheatmap)分析, 可以有效地分析微塑料对沉积物抗性基因的影响, 进而探究抗生素抗性基因的分布格局特征(图 5).从图 5可以看出：A簇区域代表的抗生素抗性基因在大部分样品中都有检出, 同时抗性基因丰度处于较高的水平, 表明这类抗生素抗性基因能够在沉积物环境中相对稳定存在(persistence), 微塑料对其影响不明显; B簇区域则表明在S_ORI和S_BLK很少检测出的抗性基因, 却在S_PVC和S_PE被大量检出, 并且抗性基因的丰度相对较高, 特别是fox 5、oprJ和cmx(A)等基因显著富集, 表明微塑料可能导致沉积物中一些抗生素抗性基因增加和富集; C簇区域则显示, 经微塑料添加培养后, 在S_ORI和S_BLK丰度较高且普遍被检出的基因, 而在S_PVC、S_PE和S_PVA却很少被检测到; D簇区域则代表在所有样品检出较少, 丰度也相对较低的抗性基因类型.
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图 5 沉积物抗生素抗性基因聚类分布热图 Fig. 5 Heatmap of ARGs in sediments |
综上, 从图 5可以看出, S_ORI和S_BLK分布格局比较接近, S_PVC和S_PE的分布格局特征也比较相似, 而S_PVA的抗生素抗性基因分布特征显著不同于前四者, 有着自己独特的分布特征.微塑料显著改变了沉积物抗生素抗性基因的分布格局.
2.4 抗生素抗性基因与可移动遗传元件的关系抗生素抗性基因与可移动遗传元件有着密切的关系[29].整合子和转座子都是重要的可移动遗传元件, 本研究统计了转座子(8种)、Ⅰ类整合子与沉积物抗生素抗性基因的关系(图 6), 最小二乘法回归分析(ordinary least squares regression, OLS regression)表明, 在95%置信区间下, 转座子和Ⅰ类整合子的基因丰度与抗生素抗性基因显著相关, 可移动遗传元件可能在沉积物抗生素抗性基因的复制和传播中扮演了重要角色, 促进了抗生素抗性基因在环境中的迁移、传播和扩散.
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图 6 抗性基因与可移动元件回归分析 Fig. 6 Regression analysis between ARGs and MGEs |
(1) 微塑料显著改变了沉积物中抗生素抗性基因结构组成, 两种难降解微塑料PVC和PE使得沉积物中万古霉素类抗性基因和多重耐药性基因种类数显著增加, 而可溶性微塑料PVA使得沉积物中总的抗性基因种类数显著减少.
(2) 添加PVC、PE和PVA微塑料的沉积物抗生素抗性基因的绝对丰度显著增加, 分别为4.1×109、8.1×109和2.×109 copies ·g-1.添加PE微塑料的沉积物抗生素抗性基因丰度增加了近一个数量级, 微塑料显著增加了沉积物抗生素抗性基因的绝对丰度.
(3) 沉积物抗生素抗性基因丰度与转座子、整合子基因显著正相关, 表明可移动遗传元件可能促进了抗生素抗性基因的迁移、传播和扩散.
| [1] | Browne M A, Crump P, Niven S J, et al. Accumulation of microplastic on shorelines woldwide:sources and sinks[J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(21): 9175-9179. |
| [2] | Barnes D K A, Galgani F, Thompson R C, et al. Accumulation and fragmentation of plastic debris in global environments[J]. Philosophical Transactionsof the Royal Society B:Biological Sciences, 2009, 364(1526): 1985-1998. DOI:10.1098/rstb.2008.0205 |
| [3] | Ivar do Sul J A, Costa M F. The present and future of microplastic pollution in the marine environment[J]. Environmental Pollution, 2014, 185: 352-364. DOI:10.1016/j.envpol.2013.10.036 |
| [4] | Wang T, Hu X G, Zhou Q X. The research progress in migration, distribution, biological effects and analytical methods of microplastics[J]. Chinese Science Bulletin, 2018, 63(4): 385-395. DOI:10.1360/N972017-00838 |
| [5] | Murphy F, Ewins C, Carbonnier F, et al. Wastewater treatment works (WwTW) as a source of microplastics in the aquatic environment[J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(11): 5800-5808. |
| [6] | Carr S A, Liu J, Tesoro A G. Transport and fate of microplastic particles in wastewater treatment plants[J]. Water Research, 2016, 91: 174-182. DOI:10.1016/j.watres.2016.01.002 |
| [7] |
朱晓桐, 衣俊, 强丽媛, 等. 长江口潮滩表层沉积物中微塑料的分布及沉降特点[J]. 环境科学, 2018, 39(5): 2067-2074. Zhu X T, Yi J, Qiang L Y, et al. Distribution and settlement of microplastics in the surface sediment of Yangtze Estuary[J]. Environmental Science, 2018, 39(5): 2067-2074. |
| [8] | Cole M, Lindeque P, Halsband C, et al. Microplastics as contaminants in the marine environment:a review[J]. Marine Pollution Bulletin, 2011, 62(12): 2588-2597. DOI:10.1016/j.marpolbul.2011.09.025 |
| [9] |
张丹丹, 郭亚平, 任红云, 等. 福建省敖江下游抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2018, 39(6): 2600-2606. Zhang D D, Guo Y P, Ren H Y, et al. Characteristics of antibiotic resistance genes in downstream areas of the aojiang river, Fujian province[J]. Environmental Science, 2018, 39(6): 2600-2606. |
| [10] | Zhu Y G, Johnson T A, Su J Q, et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(9): 3435-3440. DOI:10.1073/pnas.1222743110 |
| [11] | Zhu Y G, Gillings M, Simonet P, et al. Human dissemination of genes and microorganisms in Earth's Critical Zone[J]. Global Change Biology, 2018, 24(4): 1488-1499. DOI:10.1111/gcb.14003 |
| [12] |
苏建强, 黄福义, 朱永官. 环境抗生素抗性基因研究进展[J]. 生物多样性, 2013, 21(4): 481-487. Su J Q, Huang F Y, Zhu Y G. Antibiotic resistance genes in the environment[J]. Biodiversity Science, 2013, 21(4): 481-487. |
| [13] | Ouyang W Y, Huang F Y, Zhao Y, et al. Increased levels of antibiotic resistance in urban stream of Jiulongjiang River, China[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(13): 5697-5707. DOI:10.1007/s00253-015-6416-5 |
| [14] |
黄福义, 李虎, 韦蓓, 等. 长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究[J]. 环境科学, 2014, 35(10): 3869-3873. Huang F Y, Li H, Wei B, et al. Long-term manure application induced shift of diversity and abundance of antibiotic resistance genes in paddy soil[J]. Environmental Science, 2014, 35(10): 3869-3873. |
| [15] |
黄福义, 李虎, 安新丽, 等. 城市生活污水和生活垃圾渗滤液抗生素抗性基因污染的比较研究[J]. 环境科学, 2016, 37(10): 3949-3954. Huang F Y, Li H, An X L, et al. Comparative investigation of antibotic resistance genes between wastewater and landfill leachate[J]. Environmental Science, 2016, 37(10): 3949-3954. |
| [16] | Chen Q L, Li H, Zhou X Y, et al. An underappreciated hotspot of antibiotic resistance:The groundwater near the municipal solid waste landfill[J]. Science of the Total Environment, 2017, 609: 966-973. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.07.164 |
| [17] | Ashton K, Holmes L, Turner A. Association of metals with plastic production pellets in the marine environment[J]. Marine Pollution Bulletin, 2010, 60(11): 2050-2055. DOI:10.1016/j.marpolbul.2010.07.014 |
| [18] | Li J, Zhang K N, Zhang H. Adsorption of antibiotics on microplastics[J]. Environmental Pollution, 2018, 237: 460-467. DOI:10.1016/j.envpol.2018.02.050 |
| [19] | McCormick A, Hoellein T J, Mason S A, et al. Microplastic is an abundant and distinct microbial habitat in an urban river[J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(20): 11863-11871. |
| [20] | Zhu D, Chen Q L, An X L, et al. Exposure of soil collembolans to microplastics perturbs their gut microbiota and alters their isotopic composition[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2018, 116: 302-310. DOI:10.1016/j.soilbio.2017.10.027 |
| [21] | Claessens M, De Meester S, Van Landuyt L, et al. Occurrence and distribution of microplastics in marine sediments along the Belgian coast[J]. Marine Pollution Bulletin, 2011, 62(10): 2199-2204. DOI:10.1016/j.marpolbul.2011.06.030 |
| [22] | Nuelle M T, Dekiff J H, Remy D, et al. A new analytical approach for monitoring microplastics in marine sediments[J]. Environmental Pollution, 2014, 184: 161-169. DOI:10.1016/j.envpol.2013.07.027 |
| [23] | Zhu Y G, Zhao Y, Li B, et al. Continental-scale pollution of estuaries with antibiotic resistance genes[J]. Nature Microbiology, 2017, 2: 16270. DOI:10.1038/nmicrobiol.2016.270 |
| [24] |
黄福义, 安新丽, 李力, 等. 生活垃圾填埋场对河流抗生素抗性基因的影响[J]. 中国环境科学, 2017, 37(1): 203-209. Huang F Y, An X L, Li L, et al. High-throughput profiling of antibiotic resistance genes in river in the vicinity of a landfill[J]. China Environmental Science, 2017, 37(1): 203-209. |
| [25] | Chen Q L, An X L, Zhu Y G, et al. Application of Struvite Alters the Antibiotic Resistome in Soil, Rhizosphere, and Phyllosphere[J]. Environmental Science & Technology, 2017, 51(14): 8149-8157. |
| [26] | Klappenbach J A, Saxman P R, Cole J R, et al. rrndb:the Ribosomal RNA operon copy number database[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(1): 181-184. DOI:10.1093/nar/29.1.181 |
| [27] | Laganà P, Caruso G, Corsi I, et al. Do plastics serve as a possible vector for the spread of antibiotic resistance? First insights from bacteria associated to a polystyrene piece from King George Island (Antarctica)[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2019, 222(1): 89-100. DOI:10.1016/j.ijheh.2018.08.009 |
| [28] | Arias-Andres M, Klümper U, Rojas-Jimenez K, et al. Microplastic pollution increases gene exchange in aquatic ecosystems[J]. Environmental Pollution, 2018, 237: 253-261. DOI:10.1016/j.envpol.2018.02.058 |
| [29] | An X L, Chen Q L, Zhu D, et al. Impact of wastewater treatment on the prevalence of integrons and the genetic diversity of integron gene cassettes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2018, 84(9): e02766-17. |