2018, Vol. 39
2. 中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室, 青岛 266100;
3. 哈尔滨工业大学深圳研究生院土木与环境工程学院, 深圳 518055;
4. 青岛农业大学生命科学学院, 青岛 266109;
5. 中国海洋大学海洋生命学院, 青岛 266003
2. Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China;
3. School of Civil and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China;
4. College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
5. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)菌可以同时进行硝化和反硝化作用, 避免了传统工艺中好氧硝化和缺氧反硝化分离、投入大等缺点, 在城市污水处理应用中具有生长快速、耐有机负荷、脱氮效率高等特点[1].然而, 海水养殖业及海产品加工、石油生产等行业废水不同于传统的城市污水, 其产生的含氮废水的盐度偏高[2~4], 导致HN-AD菌的生长代谢受到抑制, 脱氢酶活性降低, 甚至会导致细菌细胞质壁分离和破裂死亡[5, 6], 显著影响脱氮效率.近年来, 国内外开展了大量针对特殊环境脱氮菌株的筛选研究, 为耐盐HN-AD菌的筛选奠定了重要基础.已有研究筛选出耐盐耐冷氨氧化细菌, 能够在高盐低温条件发挥较好的脱氮效能[7], 也陆续筛选出一些具有耐高氨氮和耐低温特性的HN-AD菌株[8, 9].然而, 目前所筛选出的HN-AD菌少具耐盐特性, 导致其在高盐废水中的应用中难以发挥优势, 因此筛选能够耐高盐的HN-AD菌具有十分重要的意义.
本研究从胶州湾沉积物中分离出1株HN-AD菌株B307, 对其16S rRNA序列进行了分析, 探讨了其耐盐特性和不同碳源类型、C/N、初始pH以及温度对其生长和脱氮能力的影响, 并分析了该菌株在单一和混合氮源条件下的脱氮效果, 以期为丰富生物脱氮理论和强化高盐废水生物脱氮效率提供理论依据和技术支持.
1 材料与方法 1.1 菌株来源和培养基本研究所用样品来自胶州湾海底沉积物, 采用LB培养基和HN-AD分离培养基对菌株进行富集和分离筛选.
LB培养基(g·L-1): NaCl 5;酵母膏5;胰蛋白胨10.
HN-AD分离培养基(g·L-1): NaCl 5, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.01, Na2HPO4 7.9, 柠檬酸钠5.96, NaNO3 0.4268, NH4Cl 0.2686;微量元素溶液2 mL; 去离子水1000 mL.
微量元素溶液(g·L-1): ZnSO42.2; CaCl25.5; Na2EDTA 63.70; MnCl2·4H2O 5.06; FeSO4·7H2O 5.0; CuSO4·5H2O 1.57; Na2MoO4·4H2O 1.1; CoCl2·6H2O 1.61.
1.2 菌体形态及菌落特征观察将分离纯化后的菌株接种至固体培养基上, 培养36 h后观察菌株的菌落特征.挑取单菌落, 通过扫描电子显微镜(JSM-7500F型)观察菌体形态.
1.3 16S rRNA序列测定及系统发育分析采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增, 上游引物(27F): 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 下游引物(1492R): 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′. PCR反应体系:基因组DNA 0.5 μL, 2×Pfu Mix 12.5 μL, 上游引物和下游引物各1 μL, 去离子水补足至25 μL. PCR反应条件: 94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 30个循环; 72℃延伸5 min, 4℃保温.将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一、大小正确后, 送至上海生工生物工程股份有限公司测序, 测序结果递交至NCBI数据库进行比对, 并将序列提交到GenBank数据库, 选取同源性较高的序列, 利用MEGA 5.0软件, 以Neighbor-joining法构建系统发育树.
1.4 菌株生长和脱氮能力影响因素研究以分离培养基为基础, 控制单一变量, 分别在不同碳源(乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸三钠)、C/N(1、5、8、12、15)、初始pH(6、7、8、9、10)和温度(25、30、35、40、45℃)条件下培养, 将对数增长期的菌液以5%接种量接入150 mL液体培养基中, 初始NH4+-N和NO3--N添加量均为70mg·L-1, 每隔2 h取样, 测定培养液中菌体的D600及NH4+-N、NO3--N、NO2--N的质量浓度, 选出脱氮性能最佳的碳源、C/N、初始pH和温度.
1.5 最适条件下的脱氮能力研究将处于对数增长期的菌液按5%的接种量接入以分离培养基为基础, 碳源为丁二酸钠, C/N为5, 初始pH值为9, 盐度为35, 氮源分别为NH4+-N、NO3--N、投加比为1:1的混合氮源的脱氮性能培养基中, 在35℃下培养, 定时取样, 测定培养液中D600、NH4+-N、NO3--N和NO2--N.
1.6 耐盐特性研究在盐度(以NaCl计)为5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 g·L-1, 初始NH4+-N和NO3--N添加量均为70mg·L-1, 其他条件与脱氮能力研究组一致的培养基中, 分别按5%的接种量接入对数增长期的菌液, 在35℃培养24 h时后, 测定菌体的D600及NH4+-N、NO3--N、NO2--N的质量浓度.
1.7 样品测定菌体生长量(D600)采用分光光度法; NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法; NO3--N采用紫外分光光度法; NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法.
2 结果与分析 2.1 菌株形态特征菌株B307在固体培养基上培养36 h后的菌落如图 1(a)所示, 菌落大小约为0.6~1.0 mm, 乳白色, 呈圆形或椭圆形, 表面光滑, 边缘整齐, 显黏稠状.扫描电镜下的菌体形态如图 1(b), 为无芽孢、无鞭毛杆菌, 菌体大小(0.4~0.6 μm)×(1.2~2.1 μm).
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图 1 菌株B307的形态特征 Fig. 1 Morphological characteristics of B307 strain |
对菌株B307测序获得长度为1460 bp的部分16S rRNA基因序列, 在GenBank中的登录号: MF407315.将所得的基因序列提交至GenBank中通过Blast检索, 应用MEGA5.0软件, 以Neighbor-joining法绘制的系统发育树如图 2所示, 与菌株Zobellella denitrificans ZD1T(DQ195675)的相似性达99%以上.
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图 2 基于16S rRNA基因序列同源性构建的菌株B307的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of strain B307 based on the complete sequences of 16Sr RNA gene |
含盐废水的盐度范围较广, 确定菌株可适应的盐度范围对其应用至关重要.菌株B307在不同盐度下24 h的生长及脱氮情况如图 3所示.当盐度(以NaCl计)低于75 g·L-1时, 菌株B307生长良好且NH4+-N和NO3--N去除率都在97%以上; 盐度为75 g·L-1时, 其D600值仍为1.325, NH4+-N和NO3--N去除率仍分别高达97.68%和94.39%, 只有少量NO2--N积累, 表明该菌株在盐度高达75时仍生长良好并保持高效脱氮; 当盐度高于75 g·L-1时, 高盐度培养基的渗透压升高导致细菌活性降低, 该菌的生长量和脱氮率开始呈现下降趋势, 菌株生长量和NO3--N去除率在盐度为85 g·L-1时只有微量的降低, 但NH4+-N去除率降低为56.22%;盐度升至95 g·L-1, 生长量和NO3--N去除率下降为0.594和56.1%, 对于NH4+-N的去除率基本为0.可见在盐度范围为5~75 g·L-1时, 菌株B307生长良好且脱氮效率较高, 表明该菌株具有较广的盐度适应范围.
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图 3 菌株B307在不同盐度下的生长量及脱氮效果 Fig. 3 Growth and denitrification ability of strain B307 under different salinities |
菌株B307在不同碳源条件下的生长情况和脱氮能力如图 4所示.培养10h, 该菌株分别以柠檬酸三钠、丁二酸钠、乙酸钠为碳源时, 其D600值为1.202、1.121和0.462, 表明其以柠檬酸三钠为碳源时生长效果最好; 其NH4+-N去除率在以丁二酸钠和柠檬酸三钠为碳源时都较高, 分别为89.24%和86.74%;其NO3--N去除率则在丁二酸钠为碳源时达最高, 为91.39%; NO2--N在反应过程中积累量均低于0.075 mg·L-1.有机碳源可以为菌株的HN-AD过程提供能量和电子, 但不同碳源结构及分子量的差异, 对不同菌株的生长和脱氮效果的影响也不同[10]. Duan等[6]的研究发现SF16的最佳碳源为乙酸钠, 王田野等[11]的研究发现SQ2的最佳碳源为丁二酸钠.本研究中, 菌株B307在几种碳源中均能生长和脱氮, 但以柠檬酸三钠为碳源时生长最好, 以丁二酸钠为碳源时脱氮效果最好.
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图 4 碳源对菌株B307生长、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、NO2--N积累量的影响 Fig. 4 Influence of carbon resource on the growth and NH4+-N removal rate, NO3--N removal rate, NO2--N cumulants of strain B307 |
如图 5所示, 菌株B307在C/N为5~12范围内均可快速生长且高效脱氮, 培养10 h后的D600可达1.2以上, NH4+-N和NO3--N去除率均高于90%, NO2--N积累量在0.01~0.16 mg·L-1之间.当C/N大于12或小于5, 菌株生长量及脱氮率均会出现一定程度的下降. C/N为5时, 该菌的生长量和NO3--N去除率达到最高, 分别为1.319和97.13%, NH4+-N去除率为98.98%, 接近最高效率, 基本没有NO2--N积累, 因此, 从脱氮能力考虑, 该菌培养的最佳C/N应为5.研究发现, 在一定的碳氮比范围内, 碳源浓度越高, 菌株的脱氮效率越高; 超过一定的范围, 碳源浓度继续增加对菌株的生长和脱氮率没有明显增加[11, 12].菌株B307在低碳氮比下具有高效脱氮效率, 应用过程中可节约碳源, 降低处理成本.
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图 5 C/N对菌株B307生长、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、NO2--N积累量的影响 Fig. 5 Influence of C/N ratio on the growth and NH4+-N removal rate, NO3--N removal rate, NO2--N cumulants of strain B307 |
如图 6所示, 在初始pH 6~10范围内, 菌株均能生长且具有一定的脱氮能力.初始pH值为7~9时, 生长速率和脱氮速率快, 脱氮效率高, 在10 h的D600值均在1.2以上, NH4+-N和NO3--N的去除率达到90%, 无NO2--N积累.当pH < 7时, 该菌生长速率变缓, 脱氮效果明显下降.初始pH为10, 菌株B307在10 h的NH4+-N去除率虽仍为95.72%, 但在2~8 h内的异养硝化和好氧反硝化速率均明显降低, NO3--N去除率降为38.75%, NO2--N在10 h的质量浓度积累达到21.27mg·L-1.菌株B307的最适初始pH为9, 在此初始pH条件下该菌的生长和脱氮速率最快, 在8 h的NH4+-N去除率以及10 h的NO3--N去除率分别可达97.25%和97.43%.该菌株在中性或弱碱性环境中同样具有高效脱氮效率, 与菌株L7[13]在初始pH=7脱氮效率较高和SF16[6]的最佳pH范围为7.5~9.5研究结果类似. pH值能够通过影响酶的活性和微生物细胞膜电位的变化来进一步影响微生物摄取营养物质的能力, 过低或过高都会影响菌株的生长效果和脱氮性能[12].
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图 6 初始pH对菌株B307生长、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、NO2--N积累量的影响 Fig. 6 Influence of initial pH on the growth and NH4+-N removal rate, NO3--N removal rate, NO2--N cumulants of strain B307 |
温度过高或过低均会影响菌体的生长和酶的活性[14], 进而影响菌株的脱氮功能.如图 7所示, 随着温度由25℃升高到45℃时, 菌株生长量和脱氮能力呈现先增加后降低的趋势.脱氮效率在培养温度为35℃和40℃达到最高, NH4+-N去除率分别为98.35%和98.76%, NO3--N去除率分别为88.68%和90.66%;当培养温度升至45℃, 该菌基本失去脱氮能力; 温度为25℃时, 菌株的NH4+-N和NO3--N去除率分别降至55.29%和4.09%.菌株B307最适培养温度为35~40℃, 在25~40℃范围内都能生长和具有较高的脱氮能力, 宽的温度适应范围有利于其在实际应用中脱氮潜力的发挥.
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图 7 温度对菌株B307生长、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、NO2--N积累量的影响 Fig. 7 Influence of temperature on the growth and NH4+-N removal rate, NO3--N removal rate, NO2--N cumulants of strain B307 |
以NH4+-N为唯一氮源的异养硝化反应过程如图 8所示, 菌株B307在培养2 h后开始增长, 14 h到达稳定期.在此异养硝化过程中, 菌株B307对NH4+-N的去除主要发生在对数生长期, NH4+-N在2 h时只有少量被去除, 2 h后NH4+-N迅速被去除; 经过12 h反应NH4+-N的质量浓度降为42.67mg·L-1, 达到最大去除率67.23%, 平均去除速率7.23 mg·(L·h)-1, 没有NO3--N和NO2--N的积累.
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图 8 菌株B307的生长和异养硝化曲线 Fig. 8 Curves of growth and heterotrophic nitrification of strain B307 |
以NO3--N为唯一氮源的好氧反硝化过程如图 9所示, 菌株B307在培养2 h后进入对数增长期, 12 h达到稳定期.好氧反硝化过程中, NO3--N的去除主要在对数增长期进行, 在4~10 h间的平均去除速率可达23.96 mg·(L·h)-1; 在8 h由163.69mg·L-1降为75.79mg·L-1, 因NO3--N快速去除, 有10.29mg·L-1的NO2--N积累, 但在随后的反硝化过程中被去除; 到10 h NO3--N质量浓度为0.34mg·L-1, 去除率达到99.82%, 平均去除速率为16.33 mg·(L·h)-1.
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图 9 菌株B307的生长和好氧反硝化曲线 Fig. 9 Curves of growth and aerobic denitrification of strain B307 |
混合氮源的同步异养硝化-好氧反硝化脱氮过程如图 10所示, 菌株B307同样在培养2 h进入对数增长期, 至12 h生物量达到最大值并进入稳定期. NH4+-N的质量浓度在培养10 h后, 由77.59mg·L-1降为1.45mg·L-1, 平均去除速率为7.61 mg·(L·h)-1, 去除率为98.35%. NO3--N的还原主要发生在培养4~6 h, 6 h时由76.42mg·L-1降为2.29mg·L-1, 平均去除速率为12.45 mg·(L·h)-1, 去除率为99.75%, 期间基本没有NO2--N积累.
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图 10 菌株B307的生长和异养硝化-好氧反硝化曲线 Fig. 10 Curves of growth and heterotrophic nitrification and aerobic denitrification of strain B307 |
目前海洋中或具耐盐特性的HN-AD菌株有:盐单胞菌属(Halomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp. )、气单胞菌属(Aeromonas sp.)[2, 6, 10, 15~17]等, 有关Zobellella sp.的HN-AD功能报道较少. Zobellella sp.由Lin和Shieh在2006年提出, 目前只有Zobellella taiwanensis、Zobellella aerophila、Zobellella denitrificans这3个种[18~20]. Lei等[18]在2016年对于Zobellella taiwanensis DN-7的研究是有关Zobellella sp.的HN-AD功能的首篇报道.一般耐盐HN-AD菌株的最适盐度(以NaCl计，下同)低于40 g·L-1[6, 17], 菌株SF16[6]在盐度为70 g·L-1时NH4+-N去除率降为74.68%.而本研究分离的菌株Zobellella sp. B307在盐度为75 g·L-1时, NH4+-N和NO3--N去除率分别可达97.68%和94.39%, 且盐度在5~75 g·L-1范围内经过24 h培养均可生长良好并保持相对稳定的高效脱氮效率, 表明该菌株不仅具有HN-AD功能, 同时具有耐高盐特性和较广的盐度适应范围, 该特性扩大了其应用范围, 使该菌株不论在低盐生活污水还是高盐工业废水及海水养殖废水的生物脱氮处理过程中都可能发挥其高效脱氮作用.
目前普遍认同NH4+-N的异养硝化途径主要分为2种, 第1种是NH3经AMO氧化为NH2OH, 再经HAO氧化为NO2--N、NO3--N[13, 21], 期间有NO2--N或NO3--N产生; 第2种是NH2OH直接转化为N2O、N2[22, 23], 没有NO2--N或NO3--N生成.肖继波等[24]发现Defluvibacter lusatiensis str.DN7在去除NH4+-N的过程中积累了大量的NO3--N, 符合第一种异养硝化途径; 孙庆花等[25]对菌株y3的研究发现NH4+-N去除的过程中几乎检测不到NO2--N和NO3--N, 认为菌株y3的异养硝化途径属于第2种.本文在对菌株B307的影响因素研究过程中发现NO3--N的去除率出现明显降低的现象, 是因其在硝化过程中有NO3--N的产生, 导致其硝态氮的去除率降低, 可以认为其在NH4+-N的异养硝化遵循了第1种途径.菌株B307在NaNO3为唯一氮源的好氧反硝化过程中有短暂的NO2--N积累, 说明有NO2--N的产生, 表明其反硝化途径可能为NO3--NNO2--NNON2ON2[26, 27].
本研究菌株B307在混合氮源体系中NH4+-N的去除率为98.35%, 显著高于以NH4+-N为唯一氮源体系的67.23%, 表明NO3--N的存在可有效提高异养硝化过程中NH4+-N的去除, 推测可能与NO3--N诱导反硝化酶的产生、进而加快了HN-AD过程中的电子传递速率、促进NH4+-N的代谢有关[10]. NO3--N的去除率在混合氮源和以NO3--N为唯一氮源体系中分别为99.75%和99.82%, 二者之间没有明显差异, 与王骁静[28]的结果一致, 表明NH4+-N的存在对好氧反硝化过程中NO3--N的代谢没有显著影响.
4 结论(1) 从胶州湾沉底物中分离出1株异养硝化-好氧反硝化菌株B307, 经16S rRNA序列分析, 初步鉴定为Zobellella sp., 其最佳碳源为丁二酸钠, 最佳C/N选为5, 最适初始pH为9, 最适培养温度范围为35℃~40℃.
(2) 菌株B307具有高效的异养硝化-好氧反硝化能力, 在NH4+-N和NO3--N混合氮源体系中, 该菌6h对NO3--N的去除率和平均去除速率分别为99.75%和12.45 mg·(L·h)-1; 10h对NH4+-N的去除率和平均去除速率分别为98.35%和7.61 mg·(L·h)-1.
(3) 该菌在盐度为75 g·L-1时, 其NH4+-N和NO3--N去除率分别可保持在97.67%和94.39%, 具有很强的耐盐特性.
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