2018, Vol. 39
2. 北京城市排水集团有限责任公司, 北京 100124
2. Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100124, China
含氮污、废水不仅造成水环境富营养化等水质恶化问题, 而且直接危害着人体健康[1].由于脱氮的多个生化过程所涉及的环境条件(碳氮比、温度、pH、溶解氧等)、基质成分、微生物组成等不尽相同, 因此目前污水厂采用的传统A2/O工艺的单泥系统难以高效完成脱氮[2~6].包埋固定化技术因具有脱氮效率高、微生物抗性强、固液分离效果好等优点而成为污、废水处理领域的研究热点[7~9].驯化后的反硝化污泥[10]和筛选过的特定菌株[9]是包埋固定化技术处理含硝氮废水的主要菌源.但是, 由于富集和筛选菌株耗时较长且操作复杂[11]或比反硝化速率较低[10], 固定化技术的工程化应用难以实现.曾金平等[10]利用乙酸钠为碳源富集的反硝化菌, 经过14 d驯化, 包埋颗粒的最大比反硝化速率(以NOx--N/MLVSS计, 下同)仅为2.9 mg·(g·h)-1, 无法满足脱氮要求.孟婷等[9]以筛选出高效反硝化菌为菌源制成的包埋填料, 经过12 d的培养, 比反硝化速率可达87.57 mg·(g·h)-1, 但是单一菌源在复杂的环境中适应性较差[6]且筛选过程相对繁琐.有研究表明, 碳源利用的难易程度会显著地影响比反硝化效率[12], 污泥发酵液做碳源的反硝化速率均高于乙酸和甲醇[13], 另有研究表明污泥的处置成本占到污水处理厂运行成本的30%~50%[14], 将剩余污泥作为反硝化碳源的处理方式可以在获得碳源的同时节约污水厂的运行成本.
基于此本实验以污泥发酵液为碳源, 以污水厂的反硝化池污泥为菌源直接包埋, 省去了污泥驯化过程, 并采用批次实验确定填料最优的培养条件, 通过缩短包埋填料的培养时间, 提高反硝化包埋填料的比反硝化速率, 实现“节能降耗”和包埋填料工程化应用的目的.本实验通过SEM观察不同阶段填料表面的结构变化, 利用分子生物学检测细菌种类和种群的变化, 以期为反硝化污泥包埋固定化技术在水处理领域中工程化应用提供理论依据和技术支撑.
1 材料与方法 1.1 反硝化池污泥的特征实验污泥取自北京某污水厂的反硝化池, 污泥特征如表 1, 量取12 L污泥混合液用于制作反硝化包埋填料的菌源.
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表 1 实验污泥的基本特征 Table 1 Characteristic of sludge used in this study |
1.2 污泥发酵液的制备及特征
采用北京某污水厂的浓缩污泥制备污泥发酵液, 浓缩污泥的特征如表 1所示.制备方法如下, ①取6个密闭的体积为1 L的锥形瓶, 分别加入800 mL的浓缩污泥, 并加入氢氧化钠溶液调节pH为9.0±0.5, 经密封后放入高压灭菌锅, 于121℃条件下水解30 min; ②待温度恢复至恒温后再加入200 mL浓缩污泥, 密封放入恒温箱, 于30℃条件下, 恒温发酵3 d, 期间控制pH为9.0±0.5; ③用离心机于8 000 r·min-1条件下离心5 min, 取其上清液, 再将上清液在121℃条件下灭菌30 min备用.表 2反映了制取的污泥发酵液的基本特征.
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表 2 污泥发酵液的基本特征 Table 2 Characteristics of the sludge fermentation liquid |
1.3 包埋方法
① 将25.275 g聚乙烯醇(PVA)絮状固体在97℃条件下溶于202.2 mL的超纯水中, 制成质量分数为16% PVA溶液[15], 待冷却至35℃备用; ②量取12 L活性污泥, 放入离心机, 在8 000 r·min-1下离心5 min所得浓缩污泥; ③将浓缩后的污泥放入已制备好的PVA溶液中, 再加入一定量的碳酸钙固体粉末, 用玻璃棒搅拌均匀, 最终制得活性污泥质量分数为24%包埋液[8]; ④用包埋液均匀涂装在实验室特有的填料载体上; ⑤将涂有包埋液的载体放入饱和硼酸溶液交联, 用水冲洗后包埋填料制作完成.
1.4 实验方法实验装置采用12个1 L的锥形瓶, 分别加入900 mL的人工培养液, 并置于摇床培养箱培养.人工培养液以KNO3为氮源, 污泥发酵液为碳源并为细菌提供少量的微量元素, KH2PO4为细菌提供所需要的磷, 并加入MgSO4、CaCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O、FeCl2·2H2O微量元素, 其主要水质指标如表 3所示.实验采用序批式运行, 包埋填料活性恢复和批次实验反应周期均为2 h, 后期填料快速培养反应周期1 h.
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表 3 人工培养液水质特征/mg·L-1 Table 3 Characteristics of the artificial medium/mg·L-1 |
整个实验分为3个阶段, S1阶段:将反硝化池污泥利用1.3节所述的包埋方法制成填料, 并以污泥发酵液为碳源, 在温度30℃, pH为7.5±0.3, 控制进水硝氮浓度为(40±1)mg·L-1, 加入54 mL的污泥发酵液, 以保证反应器中的碳氮比为10±0.5, 将反应器放置在转速为80 r·min-1的摇床上恢复活性.通过实验数据确定填料恢复到初始活性所需的时间, 将部分所制备好的填料分别做SEM和高通量测序的检测; S2阶段:等填料恢复到初始活性后, 通过批次实验考察碳氮比、温度、pH这3个因素对反硝化包埋填料活性的影响, 确定出包埋填料最优的活性恢复条件; S3阶段:根据S2阶段得出的结论, 选定效率最高的3组反应器, 在该条件下提高包埋填料活性至稳定运行, 并将效率最高组的样品填料分别做电镜扫描和高通量测序的检测.
1.5 微生物群落多样性分析 1.5.1 DNA提取由于包埋填料样品表面和内部富有菌群, 需要进行预处理.可取适量样品, 直接在样品管中加入适量的1×PBS溶液强烈振荡, 使样品表面菌体能够被洗到液体中, 取适量洗过之后的液体12 000 r·min-1离心2 min, 留取沉淀, 具体提取步骤参照OMEGA试剂盒E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒提取DNA, 提取完成后, 进行琼脂糖凝胶检测DNA完整性.
1.5.2 PCR扩增利用Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA的浓度进行测定, 以确定PCR反应加入的DNA量. PCR所用的引物已经融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物.
341F引物: CCCTACACGACGCTCTTCCGAT CTG (barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG.
805R引物: GACTGGAGTTCCTTGGCACCCG AGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC.
按照相应体系进行PCR扩增.利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量, 以方便按照1:1的比例等量混合后测序.等量混合时, 根据每个样品的DNA浓度计算移液枪所需吸取的体积, 使得每个样品吸取后DNA的量为10 ng, 最终测序浓度为20 pmol, 测序在生工生物工程(上海)股份有限公司进行.
1.6 检测方法实验过程中所有样品经过0.45 μm滤膜抽滤处理, 三氮的测定方法均为标准分析法[16]:氨氮采用纳氏试剂分光光度法(UV-754);亚硝氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定(UV-1600);硝氮采用紫外分光光度计法测定(UV-1600); SCOD采用COD快速测定仪测定(连华科技5B-1型); 污泥质量浓度采用滤纸重量法测定; pH采用pH计测定(上海三信PHS-3C型); 挥发性脂肪酸采用气相色谱法测定[17](安捷伦6890n气相色谱仪).
2 结果与讨论 2.1 反硝化包埋填料的活性恢复反硝化包埋填料制作完成后, 在温度为30℃条件下进行活性恢复, 为了保证反硝化反应足够的碳源[9], 控制反应器中的碳氮比为10, pH为7.5±0.3.经过7 d培养后, 反硝化包埋填料表现出良好的反硝化效果, 反应效果如图 1所示.
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图 1 反硝化包埋填料的反应效果 Fig. 1 Denitrifying performance of embedding filler |
由图 1可知, 经过90 min的生物作用, 反应器中的氨氮浓度由5.68 mg·L-1降至了0 mg·L-1, 反应器中可能存在异养硝化过程[18]导致氨氮浓度降低.硝氮在0~60 min内, 由初始40.31 mg·L-1亦降至0 mg·L-1.由于亚硝氮还原速率比硝氮还原速率低[19], 亚硝氮变化呈现先增加后减少的趋势, 在第40 min时积累量达到最大, 为18.54 mg·L-1, 90 min时, 反应过程中产生的亚硝氮完全去除, 总氮去除率达到了100%. SCOD在0~1 h内由初始的402.4 mg·L-1下降到248.30 mg·L-1, 但在1~2 h内仅有25.6 mg·L-1下降, 这可能是由于反应初期, 反硝化细菌过量吸附碳源[11]且优先利用易被降解的有机物进行反硝化脱氮, 所以SCOD的降幅达到154.10 mg·L-1, 但是, 由于反硝化细菌利用发酵液中难降解的有机物效率很低[19], 所以1~2 h内的SCOD降幅平缓.经过7 d的培养, 包埋填料的比反硝化速率达到了5.37 mg·(g·h)-1, 大于活性污泥的5.33 mg·(g·h)-1初始的比反硝化速率, 标志着包埋填料活性恢复成功.
2.2 碳氮比对反硝化包埋填料去除硝酸盐效果的影响为了探究不同碳氮比对包埋填料的影响, 设置碳氮比分别为6、8、10、12的4组平行实验[9, 20], 4个反应器均置于80 r·min-1的摇床上培养, 控制培养温度为30℃, pH为7.5.实验过程中, 反应器中的硝氮、亚硝氮、SCOD浓度变化分别如图 2和图 3所示.当碳氮比为6和8时, 0~40 min内, 由于可利用的有机物较多, 比反硝化速率较高, 分别为3.94 mg·(g·h)-1和7.35 mg·(g·h)-1, 硝氮浓度迅速下降, 后期由于反应系统中有机物浓度的限制, 造成了部分硝氮剩余和一定程度的亚硝氮积累, 亚硝氮积累率分别为43.48%和30.48%.虽然60~120 min时SCOD都有剩余, 但发酵液中剩余的有机物不易被细菌高效利用[20].当碳氮比为10和12时, 由于反硝化细菌可利用的碳源充足[9], 硝氮反应完全且无亚硝氮积累, 其比反硝化速率分别为9.57 mg·(g·h)-1和10.94 mg·(g·h)-1, 由此可见, 随着碳氮比增大, 比反硝化速率也随之增加.由于外加碳源的使用势必增加水厂的运行成本, 并且碳氮比过大也会造成出水COD浓度过大, 造成碳源浪费, 且当SCOD为10时, 即可保证反硝化填料所需碳源, 为避免碳源过度浪费[21], 反硝化包埋填料的适宜碳氮比采用10.
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图 2 不同碳氮比时硝氮、亚硝氮浓度变化 Fig. 2 Change of NO3--N and NO2--N concentration under different C/N ratios |
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图 3 不同碳氮比时SCOD浓度变化 Fig. 3 Change of SCOD concentration under different C/N ratios |
为了探究不同温度对包埋填料的影响, 设置温度分别为15、20、25、30℃[3, 9]的4组平行实验, 控制4个反应器中的污水的碳氮比为10, pH为7.5, 于80 r·min-1的摇床上进行培养.反应器中的硝氮、亚硝氮浓度变化如图 4所示.
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图 4 不同温度下硝氮、亚硝氮浓度变化 Fig. 4 Change of NO3--N and NO2--N concentration under different temperatures |
由图 4可知, 硝氮的去除率未受到温度降低的影响, 但亚硝氮还原反应受低温影响, 出现明显下降[22]. 15℃时亚硝氮积累率为15.96%, 此时填料的比反硝化速率仅为4.47 mg·(g·h)-1, 但仍高于活性污泥2.37 mg·(g·h)-1的比反硝化速率[23], 这可能是因为反硝化细菌对污泥发酵液中的碳源利用率要高于甲醇, 且通过固定化包埋技术可以增强细菌抵抗环境温度变化的能力[9].分析图 4可知, 在20、25、30℃条件下, 包埋填料的比反硝化速率分别为6.03、9.40、10.66 mg·(g·h)-1, 以实验所在水厂为例, 污水温度最高仅为26℃, 所以包埋填料的培养温度选定为25℃.
2.4 pH对反硝化包埋填料去除硝酸盐效果的影响设置4组平行实验以探究不同pH对包埋填料的影响, 4个反应器的pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0[24, 25], 控制4个反应器中的碳氮比为10, 温度为30℃, 将反应器置于80 r·min-1条件下摇床培养.反应器中硝氮、亚硝氮浓度变化如图 5所示.
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图 5 不同pH下硝氮、亚硝氮浓度变化 Fig. 5 Change of NO3--N and NO2--N concentration under different pH |
分析图 5可知, 在2 h反应周期内, 包埋填料在pH为6.5~8.0时, 硝氮和亚硝氮均可完全去除, 但是不同pH条件下比反硝化速率不同, 这是因为高pH会抑制亚硝酸盐还原酶的活性[26], 所以当反应器中的pH由6.5增大至8.0时, 亚硝氮的比反硝化速率呈现出逐渐降低的趋势, 分别6.79、5.56、4.58、3.92 mg·(g·h)-1.但是, 由于pH对硝酸盐还原酶的活性影响不大[27], 所以图 5中的硝氮的比反硝化速率变化较小.根据理论计算, 当反应器中的pH由6.5增大至8.0时, 包埋填料的比反硝化速率亦呈现出逐渐增加的趋势, 分别为7.23、8.00、8.39、8.87 mg·(g·h)-1.考虑到实验制取的污泥发酵液偏碱性(9.0±0.5), 且pH过高易造成亚硝氮积累[27], 所以控制包埋填料的最适宜培养pH为8.0.
2.5 包埋填料活性快速提升培养在25℃条件下, 将效率恢复至初始活性[比反硝化速率为5.37 mg·(g·h)-1]的3组反应器, 置于80 r·min-1的摇床上, 进行活性快速提升培养, 实验过程中控制反应器内的pH为8.0, 碳氮比为10.实验初始硝盐氮负荷为80 mg·L-1, 实验过程中根据出水硝氮和亚硝氮负荷, 梯级增加进水硝氮负荷.培养过程中的包埋填料活性如图 6所示, 2~15 d, 细菌处在对数增长期[28], 比反硝化速率由15.21 mg·(g·h)-1增大到80.15 mg·(g·h)-1.当进水硝酸盐氮负荷低于300 mg·L-1时, 反应器中的硝氮和亚硝氮均可完全去除, 但是当反应负荷达到340 mg·L-1时, 出水中亚硝氮和硝氮显著升高, 去除率由100%下降至88.2%, 此时的比反硝化速率达到最大, 为80.17 mg·(g·h)-1并趋于稳定, 此时包埋填料中的反硝化细菌进入了稳定期[29].
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图 6 包埋填料的活性提升 Fig. 6 Increasing efficiency of embedding filler |
图 7(a)为实验所用的包埋填料的实物图, 填料为外圆中空的圆柱状, 比表面积相对较大, 增加了填料与基质的基础面积, 保证了细菌与基质的完全反应[30].经历了100多天的实验, 生物膜没有脱落, 适宜工程应用.
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图 7 包埋填料实物及SEM表征结果 Fig. 7 Embedded filler material and SEM characterization results |
包埋填料在经过15 d快速培养后, 不同放大倍数下SEM结果如图 7(b)、7(d)所示.由图 7(b)可知, 包埋填料内存在大量的空隙, 即细菌传质代谢的通道, 保证了包埋填料与培养液的传质畅通[7], 由图 7(c)、7(d)可知, 细菌在填料内部呈团簇状形式生长良好, 与初始包埋后的填料相比, 活性提升后的网状结构更加致密, 这更加利于提高填料的比反硝化速率.
2.7 包埋填料的多样性指数分析表 4为两个样本的α多样性指数统计, 从中可知, 两个样本覆盖率为96%, XF(初始包埋后填料)有60 565条有效序列, XF2(活性提高后填料)有59 834条有效序列, 表明测序深度已经达到了标准, 基本覆盖了所有物种.填料经过一段时间的驯化后, ACE指数和Chao1指数分别从34 965.10、17 460.65增加到42 786.59、18 766.93, 表明活性快速提高后的包埋填料多样性增大.
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表 4 包埋填料的多样性指数统计 Table 4 The α diversity index of the embedding filler |
2.8 包埋填料的群落结构分布
包埋填料快速提升培养后菌种比例变化最多的细菌名称和比例如表 5所示, 包埋填料在属水平下的样本群落结构分布如图 8所示, 图 8显示, 经历活性快速提升培养阶段后, Thauera和Thermomonas成为包埋填料的优势菌种. Thauera所占比例由活性快速提升培养前的0.01%增长到了活性快速提升培养后的24.27%. Thauera是β-Proteobacteria纲下的一类具有反硝化能力的革兰氏阴性细菌, 且具有降解多种芳香族污染物能力[31~34]. Thermomonas菌由活性快速提升培养前的5.7%增长到了活性快速提升培养后的8.23%, Thermomonas是一类属于变形菌门的反硝化细菌[35~37].活性快速提高培养过程中, Thauera和Thermomonas表现出了很强的增殖能力, 反硝化包埋填料的培养周期比孟婷等[9]的实验明显缩短, 且比反硝化速率高达80.17 mg·(g·h)-1, 明显优于曾金平等[10]的研究. Thauera优势菌属的快速增值的能力和高比例保证了反硝化包埋填料的高效脱氮率.包埋填料的群落结构分布中还存在Alcaligenes异养硝化菌, 其所占比例为1.37%, 由此进一步证明图 1中存在异养硝化过程, 由此导致氨氮浓度有所降低.
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表 5 包埋填料内优势菌属 Table 5 Dominant genera of the embedding filler |
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图 8 genus水平XF和XF2样本群落结构分布 Fig. 8 Distribution barplots of XF and XF2 microbial communities at the genus level |
(1) 包埋后的水厂反硝化池污泥, 在温度为30℃, 碳氮比为10, pH为7.5条件下经过7 d的培养后, 比反硝化速率即可恢复至5.37 mg·(g·h)-1活性.
(2) 包埋填料的最优培养条件:碳氮比为10, 温度为25℃, pH为8.0, 在此条件下, 经过15 d的驯化, 其比反硝化速率可由最初的5.37 mg·(g·h)-1增大到80.17 mg·(g·h)-1, 并稳定运行.
(3) SEM显示在填料内部细菌呈团簇状生长良好, 并且存在大量细菌传质代谢通道.
(4) 高通量测序的结果显示填料在活性提高后, 反硝化菌种增多、比例增大, Thauera高比例的优势菌属保证了填料反硝化脱氮的高效性.
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