自然界天然磷矿石因开采而逐年减少, 促进了废水中回收磷技术的发展^[1~3].由于城市生活污水中磷酸盐的浓度较低, 不适合直接使用物理或化学等方法回收.现行的磷回收技术主要分为两种, 以Phostrip侧流磷回收为代表的悬浮生长系统磷回收法^[4]和以生物膜法为代表的附着生长系统磷回收法. Phostrip侧流磷回收存在污泥消解成本较高, 不易从固体物中分离出HAP等缺陷^[5].而以生物膜法为代表的附着生长系统因有以下优点而逐渐引起人们的关注：结构紧凑、占地小; 耐冲击负荷能力强; 反应器厌氧/好氧段时长可进行单独控制; 同时可以避免因丝状菌生长引起的污泥流失^[6~8].然而目前生物膜法磷回收研究仅限于曝气生物滤池. Tian等^[9]和Kodera等^[10]分别在生物滤池进行磷回收实验.但曝气生物滤池容易堵塞、需要定期反冲洗和对进水的悬浮固体浓度要求严格等局限, 工艺发展缓慢且受限.

本研究以常规填料挂式尼龙作为生物膜载体形成厌氧/好氧交替生物膜反应器, 面向未来城市污水处理厂进行磷回收实验, 填料廉价易得, 节能环保.采用人工配水模拟城市生活废水, 在驯化生物膜过程中, 通过MiSeq高通量测序技术探究生物膜驯化过程中微生物种群特性以及优势聚磷菌的变化.并通过改变进水负荷, 如进水磷浓度, COD浓度等因素, 探究富集高浓度磷酸盐的可能性.

实验是在一个2L的容器中进行.该系统由2串尼龙、一个30 L好氧进水容器和一个30 L的厌氧进水容器(富集罐)组成, 如图 1所示.在厌氧阶段, 综合废水经重力从厌氧进水罐流入反应器, 底部的聚磷菌消耗有机底物并释放磷酸盐, 废水通过重力排出.在厌氧阶段结束时, 反应器切换到好氧阶段, 好氧罐由重力进水, 空压机曝气以促进有氧环境.磷酸盐被反应器中PAOs吸收, 处理后的废水由重力排出.在进行磷回收时, 反应器的厌氧出水由泵1泵入厌氧进水罐(富集罐).在厌氧阶段, 反应器中充满了循环液和有机基质.通过重复交替操作, PAOs在反应器内被富集, 在富集罐中的磷酸盐浓度越来越高.本研究中出水和进水都是由泵泵入.

图 1

Fig. 1

a.好氧进水罐; b.回收罐(厌氧进水罐); c.尼龙填料; d.磁力搅拌器; e.转子; f.曝气装置; g.泵; h.控制阀; i.出水管 图 1 实验装置示意 Fig. 1 Experimental device signal

进水为合成废水, 采用乙酸钠作为碳源.驯化阶段合成废水的水质主要指标为:好氧进水, 200 mg·L^-1COD, 5 mg·L^-1 PO₄^3--P, 40mg·L^-1 NH₄⁺-N, 少量CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、EDTA·2Na和微量元素, 加入NaHCO₃调节进水pH至7.5;厌氧进水为：200mg·L^-1COD, 40mg·L^-1 NH₄⁺-N, 自然pH值, 少量CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、EDTA·2Na和微量元素^[10].富集阶段补充磷酸盐和COD浓度.

生物膜反应器厌氧和好氧交替运行, 时间分别为6 h^[11], 反应器进水流量119 mL·min^-1, 进水时间约15 min, 保持容器底部转子时刻转动使反应器中的溶液处于均匀混合状态.本工艺好氧阶段的曝气量控制在(3±0.5)mg·L^-1.通过水浴加热将温度控制在25℃.

水质监测指标有：COD采用重铬酸钾法测定; PO₄^3--P采用钼锑抗分光光度法测定; NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法测定; DO采用Inlab OXI7300溶氧仪测定; pH采用Inlab OXI73 00 pH计测定.

取0、40、50 d厌氧段泥样分别置于2.5%戊二醛溶液中, 4℃固定过夜, 经过梯度浓度的乙醇溶液(10%、20%、40%、60%、80%和100%这6种浓度)脱水处理后用丙酮处理, 分别用体积比为1:1和3:1的包埋剂与丙酮的混合液处理样品1 h和3 h, 最后用包埋剂处理样品过夜, 将渗透处理的样品包埋起来, 70℃加热过夜, 即得到包埋好的样品, 样品在Reichert超薄切片机中切片, 获得70~90 nm的切片, 用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min, 再用FEI2500型扫描电镜观察^[9].

本实验采用的标准品来源均为尼龙生物膜反应器.污泥取样点为系统运行的第0、40、50 d的厌氧段污泥.活性污泥泥样取出后, 14 000 g离心2 min, 去除上清液, 置于-80℃保存.采用试剂盒(Fast DNA Spin kit forsoil, MP, USA)对DNA进行提取.提取后的DNA通过Nanodrop Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scienti c, USA)测量核酸浓度及纯度, 结果通过1%的琼脂糖电泳检测.

采用细菌16S V4-V5区通用引物, 前端引物519F(5′-CAGCMGCCGCGGTAATW-3′), 后端引物907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′), PCR采用20μL的反应体系, 2 μL 10×Buffer、2 μL dNTP(浓度为100mmol·L^-1)、1 μL DNA模板(10 ng·μL^-1)、每种引物各1 μL(10 μmmol·L^-1)、0.2 μL Taq酶和12.2 μL无菌水.扩增程序是PCR扩增采用94℃预变性3 min; 94℃变性40 s, 56℃ 60 s, 72℃ 60 s, 共29个循环, 72℃延伸10 min.扩增产物通过2%琼脂糖电泳检测.

采用Illumina MiSeq测序仪进行PE 300测序.下机数据按照各样本的Barcode序列对原始数据进行拆分, 拆分过程中不允许Barcode错配; 对单个样本的双端测序结果采用FLASH进行拼接; 对拼接结果进行质控, 采用Uparse去除平均质量分数小于30%的序列并去除嵌合体序列; 采用Uparse对序列按照0.97的相似度聚类获得OUT, 采用Uclust方法将代表序列比对到Silva数据库进行物种注释.为避免采样效率对微生物群落分析的影响, 对各样本的序列数目按照各样本中最少的序列数进行随机抽样, 随机抽样结果用于下游的物种丰度比较、α多样性与β多样性计算以及其它生态统计分析.

采用活性污泥法进行挂膜^[12].驯化阶段进水COD为200 mg·L^-1, PO₄^3--P为5 mg·L^-1, 结果如图 2所示, 运行初期, 出水磷浓度, COD浓度较高, 反应器运行10 d后, 厌氧好氧出水COD均在50 mg·L^-1以下, 出水磷浓度低于0.5 mg·L^-1, 去除率95%以上, 随着反应器运行, 出水磷浓度接近于零, 在该处理水平连续稳定运行了40 d.出水条件能达到排水一级A标准的要求且稳定性好.在反应器进水水质有波动的情况下依旧保持较好的出水情况, 证明反应器有一定的抗冲击负荷能力. Tian等^[9]在厌氧/好氧交替生物滤池生物膜驯化运行实验中, 进水磷浓度为10~15 mg·L^-1, COD浓度为100~150 mg·L^-1, 运行稳定后出水磷浓度在1 mg·L^-1左右. Kodera等^[10]以好氧/厌氧交替的生物滤池进行生物膜驯化磷回收实验, 进水PO₄^3--P浓度5 mg·L^-1, COD为100~200 mg·L^-1, 运行90 d, 反应器稳定, 磷去除率50%左右.从除磷效率和驯化时间上看, 以挂式尼龙作为生物膜载体形成厌氧/好氧交替生物膜反应器除磷效率高, 驯化时间短.

图 2

Fig. 2

图 2 驯化阶段常规数据监测曲线 Fig. 2 Conventional data monitoring curve during the acclimation phase

在反应器运行50 d后, 以磷去除为前提, 进行磷回收实验探究.厌氧出水泵进回收罐, 并作为下一阶段厌氧进水.在0~24 d, 进水COD为200 mg·L^-1, PO₄^3--P为5 mg·L^-1, 如图 3(a)所示.在0~10 d, 富集溶液中正磷酸盐浓度在0~10 mg·L^-1, 呈逐渐上升状态, 由于回收液浓度初始值较低因此上升快.在11~18 d, 磷酸盐浓度区间在10~18 mg·L^-1时, 呈阶梯上升状态, 此时的回收液浓度相对较高, 对磷的释放开始有一定的抑制作用; 在19~24 d, 浓度区间在18~40 mg·L^-1的阶段, 呈现波动上升状态, 较高的磷浓度已经开始影响磷溶液的磷吸收方向, 此时回收液浓度已经达到瓶颈.

图 3

Fig. 3

图 3 磷回收阶段常规数据监测曲线 Fig. 3 Phosphorus recovery stage conventional data monitoring curve

在反应器运行25 d后, 如图 3(b)所示, 提高进水磷浓度在12~16 mg·L^-1, COD仍为200mg·L^-1, 富磷溶液的正磷酸盐浓度提高了80%, 稳定在45 mg·L^-1以上, 实现了富磷溶液浓度在原有状态下的第一次变化, 且以后较长一段时间回收液的浓度在55mg·L^-1左右波动, 认为此时回收液浓度可能再次达到阶段瓶颈.

在第48 d时, 如图 3(c)所示, 降低进水磷浓度至5mg·L^-1, 连续两天通过向富磷溶液中投加1 200 mg·L^-1的COD浓度, 富磷溶液的正磷酸盐浓度提高了77.78%, 最高达到82 mg·L^-1, 实现了富磷溶液浓度的第二次变化, 随着COD的不断消耗最后浓度保持在200 mg·L^-1不再下降.富磷回收液的浓度降低到了58 mg·L^-1左右, 后续浓度稳定在该值, 回收液浓度达到鸟粪石法回收磷的标准(50~58 mg·L^-1).

张顺等^[13]在研究生物膜吸收并蓄积废水中的磷时发现, 采用定期补充碳源方式诱导生物滤池内聚磷菌群(PAOs)充分释磷, 可刺激形成高浓度的磷回收液. Wang等^[14]通过数学模型计算证实高的碳源补给更有利于厌氧磷的释放. Tian等^[9]在研究好氧/厌氧交替生物滤池强化生物除磷时表明, 碳源刺激和较高浓度的磷酸盐进水有利于获取高浓度的磷酸盐回收液, 结果与本实验相符, 为获取高浓度磷溶液提供研究方向.但以提高进水磷酸盐浓度促进磷溶液回收导致出水磷浓度过高, 无法达到同步去除的目的.

为了分析生物膜驯化过程中微生物群落结构变化情况, 对0、40、50 d厌氧段活性污泥进行扫描电子显微镜分析(SEM), 如图 4所示.在接种污泥中, 存在少量球菌, 在运行40 d后, 污泥中出现大量椭圆形菌落结构菌体, 出水磷浓度已低于0.5 mg·L^-1, 反应器处于高效除磷状态.在运行第50 d时, 聚落结构成熟, 均匀饱满, 外形规则, 轮廓清晰, 成球状.文献指出潜在的PAOs主要为球菌、短杆菌、四联球菌^{[15, 16]}.结合反应器运行效率推测在驯化过程中聚磷菌得到很大程度的富集.

图 4

Fig. 4

图 4 泥样SEM图片 Fig. 4 SEM images at different sampling times

在对0、40、50 d的16S rDNA测序后, 有效序列分别为51953、60324和61379, 通过与数据库的比对划分, 共得到1 400个OTUs, 各样品OTUs数目分别为样品0 d为1 127, 40 d为1 200, 50 d为1 235.样品Venn数据分析后发现, 3个样品共有OTUs占总样品的63.8%, 反应器在运行过程中对微生物进行了筛选, 一部分细菌得到保留, 不能适应环境的微生物被淘汰.

样品多样性指数如表 1所示, Chao1、Shannon、Simpson指数表明各隔室细菌群落和物种的丰富度. Shannon指数反映了基于物种数量的群落种类多样性, 指数越大表明群落的复杂程度越高. Simpson指数体现了优势物种占群落生物总量的比重, 该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越大, 反之则优势菌群生物量占总生物量比重越小^[17].在本实验中, 0~40 d, Shannon指数由7.66下降至7.33, Simpson指数保持不变, Chao1指数与Shannon趋势相反, 由1 164.69增长致1 292.01. 40 d后, Shannon指数下降0.4%, Chao1指数上升1.2%, 各种指数基本维持不变.所以反应器中微生物种群多样性随着反应的进行逐渐减小, 运行40 d时, 反应器中的微生物种群结构基本进入稳定状态.

表 1 (Table 1)

表 1 微生物多样性指标 Table 1 The α-diversity indices of the bacterial community 样本 OTU数目 Shannon指数 Simpson指数 Chao1指数 覆盖率/% 0 d 51953 7.66 0.98 1 164.69 100 40 d 60324 7.33 0.98 1 292.01 100 50 d 61379 7.30 0.98 1 308.28 100

表 1 微生物多样性指标 Table 1 The α-diversity indices of the bacterial community

对样品OTUs代表序列进行物种注释, 并将样品的有效序列划分到不同的分类水平.对于不同污泥样品的主导菌群, 主要分析了各污泥样品在“门(Phylum) ”与“科(family) ”, 结果如图 5、6所示.

图 5

Fig. 5

图 5 门级别的微生物分布 Fig. 5 Distribution of the bacterial community at the phylum level

图 6

Fig. 6

图 6 科级别的微生物分布 Fig. 6 Distribution of the bacterial community at the family level

本实验总共测到29个门, 相对丰度>3%, 含量由大到小的门如图 5所示, 为变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、Ignavibacteriae门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae). 0~40 d, Proteobacteria占比由起始的47%增长至57%, 是各污泥样品中最丰富的门. Proteobacteria类细菌细胞壁成分主要是脂多糖, 属于革兰氏阴性菌, 包含多种代谢种类, 在降解有机物的同时完成脱氮除磷的功能, 是潜在的聚磷菌^[18], 在运行过程中得到富集.前期研究证明Proteobacteria在除磷活性污泥系统中是主要的菌门^[19]. Chloroflexi由12.8%增长致15.1%, Chloroflexi大都在污泥的胶团絮状体内以絮体的形式存在, 并为污泥的结构提供骨架支撑, 该门类细菌是一类严格的厌氧微生物, 能利用一系列短链脂肪酸产生氢气/二氧化碳/乙酸, 具有良好的降解有机化合物的作用, 可以为聚磷菌生长提供附着骨架.而拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、Ignavibacteriae门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)分别下降了30%、76%、43%、45.4%.由于其不能适应反应器运行环境, 数量逐渐减少.在40~50d, Proteobacteria、Ignavibacteriae、Nitrospirae分别增长2.4%、0.98%、2.5%, 而Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria分别下降3.4%、0.7%、1.9%. 40d后反应器种微生物虽然出现轻微的波动, 但已基本稳定.

为进一步阐明反应器在运行过程中优势功能菌以及细菌群落的演化, 在科的水平上对相对丰度大于3%的微生物进行分析, 如图 6所示.本实验总共检测到182个科, 由大到小排序为红环菌科(Rhodocyclaceae)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、未纯培养的β-变形菌目(unclassified_β-Proteobacteria)、Ignavibacteriaceae、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae).在0~40 d, 厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)由9.8%增长至12.9%, 增长31.6%.而未纯培养的β-变形菌目(unclassified_β-Proteobacteria)、Ignavibacteriaceae、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)分别减少20.25%、50.33%、54.69%, 由于其不能适应环境, 所以在聚磷生物膜驯化过程中被淘汰.红环菌科(Rhodocyclaceae)含量最高, 由17.9%增长至28.34%, 增长58.32%. Bond等发现^[20], 红环菌在高效除磷系统中含量较高, 而在低效除磷系统中含量较少, 推测红环菌可能是造成两系统除磷功能差异的主要原因. Zilles等也指出^[21], 红环菌是生物强化除磷系统中的优势聚磷菌, 发挥着主要除磷作用.根据该菌所占比例的变化以及系统的除磷效果推测, Rhodocyclaceae是系统中的优势聚磷菌.在40~50 d, 红环菌科增长3.2%, 厌氧绳菌科增长6%, 其他菌科均出现不同程度的下降, 在反应器运行过程中聚磷菌一直被筛选富集.

在EBPR (enhanced biological P removal)工艺中, 除磷微生物的丰度影响系统的运行效果.公认的PAOs包括Acinetobacter^{[22, 23]}、Pseudomonas^{[24, 25]}、Rhodocyclaceae^{[24, 25]}, 它们能在厌氧条件下将挥发性脂肪酸(VFA)等碳源储存为聚羟基脂肪酸(PHAs)的同时释放磷, 而在好氧条件下以PHAs为能量来源实现微生物生长、糖原合成以及磷的吸收^[26].在本实验中, 通过好氧/厌氧交替运行, 进水条件为COD 200 mg·L^-1, PO₄^3--P 5 mg·L^-1, 温度30℃, pH为7.5, 聚磷菌Pseudomonas由0.04%增长至0.34%, Acinetobacter由0.06%下降至0.03%, 而Rhodocyclaceae由17.9%上升至28.9%.在生物膜法回收磷工艺中, Tian等^[9]在厌氧/好氧交替生物滤池以高磷溶液进水, 在周期性碳源扩增进行磷回收, 测序发现Pseudomonas是反应器中的优势聚磷菌, 占98.03%. Kodera等^[10]在好氧/厌氧交替的生物滤池进行磷回收实验, 以低磷废水进水, FISH研究证明聚磷菌(主要为假单胞菌和红环菌)占30%.本实验聚磷菌含量与Kodera等^[10]的实验结果相近, 但与Tian等^[9]的实验结果相差较大.生物膜系统中微生物的群落组成结构与进水水质有关^[27], 不同的碳源浓度和磷浓度会影响聚磷菌的筛选, 较高的碳源浓度刺激会促进某种聚磷菌的高效富集^[9], 推测本实验以模拟生活废水为进水是导致富集聚磷菌浓度低于Tian等^[9]的实验结果的原因.

(1) 挂膜成功后, COD出水50 mg·L^-1以下, 出水磷浓度接近于零, 并在该水平上稳定运行40 d.随后进行磷溶液富集, 提高进水磷浓度和进行碳源刺激都可以提高回收液的磷浓度, 提高进水磷浓度, 磷酸盐浓度增长至55 mg·L^-1; 进行碳源刺激时, 磷浓度提高至82 mg·L^-1, 随着进水碳源的降低, 最终得到磷浓度为58 mg·L^-1的富磷溶液.

(2) 生物膜驯化过程中, 物种丰度增高, 细菌多样性略微下降.不同碳源污泥样品的“门”与“科”级别上分别以Proteobacteria、Rhodocyclaceae占主导. Proteobacteria由47%增长至58%, Rhodocyclaceae由17.9%上升至28.9%, Rhodocyclaceae是反应器的优势聚磷菌.