2018, Vol. 39
抗生素自20世纪被人类发现以来, 拯救了无数的生命, 为传染病的防治和人类社会的可持续发展做出了重要贡献.抗生素不仅在医疗卫生领域被广泛使用, 而且由于具有预防疾病和促进禽畜生长的作用, 可当作亚治疗剂和促生长剂添加在饲料中而被广泛应用于畜牧水产养殖行业[1~3]. 2000~2010年, 全球的抗生素使用量增加了36%, 其中巴西、俄罗斯、印度、中国和南非这个5个新兴经济体贡献了增长量的76%[4], 表明发展中国家的抗生素使用增长率大大超过了发达国家.我国抗生素管制相比发达国家而言相对松散, 特别是在医疗系统和养殖行业存在长期滥用和不当使用的情况, 在生活污水[5]、城市污泥[6]、垃圾渗滤液[7]以及城市郊区的施用猪粪水稻土[8]、施用污泥的土壤[9]等都检测出抗生素抗性基因.抗生素已经被公认为环境污染物[10], 随着近年来相关研究不断深入, 抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)也被当作一种新型的环境污染物[11].抗生素抗性基因可能对生态环境和人类健康造成不利的影响, 特别是一旦进入致病微生物, 将直接影响抗生素对疾病的治疗效果, 可能使得人类面临无药可用的境地[3, 12].世界卫生组织(WHO)于2016年11月14~20日第二次举办了“世界提高抗生素认识周”活动, 活动主题是“慎重对待抗生素”, 活动是为了提高全球对抗生素耐药性问题的认识, 避免抗生素耐药性现象的继续发生和扩大.
受人类活动的影响, 特别是快速城市化过程, 高密度的物质流和人口, 大大加快了抗生素及其抗性基因在环境中的迁移、传播和扩散, 抗生素抗性基因甚至在一些环境中显著富集[13, 14].水环境极其容易受到人类活动的干扰, 同时微生物种类多而且含量丰富, 成为内在抗生素抗性基因和外来抗性基因的基因反应器(genetic reactor)[15], 因此水环境被认为是抗生素抗性基因的一个重要的库(reservior)[16].本研究针对快速城市化地区, 结合独立小流域的地理环境特征, 采用高通量定量PCR(high-throughput qPCR, HT-qPCR)技术, 选取福建省连江县县城所在的敖江(岱江)下游及入海口区域, 研究河流抗生素抗性基因的抗性机制类型、多样性和丰度, 并进一步综合分析敖江下游抗生素抗性基因的污染特征, 以期为城市河流生态健康评估和抗生素抗性基因削减提供基础科学研究支撑.
1 材料与方法 1.1 河流水样品采集敖江是福建省“八大水系之一”, 也是福建省东部地区三条独流入海的主要河流之一[17].福建省敖江下游的河流段穿过连江县的城区并随后入海.本研究的样品采样区域位于敖江下游区域(图 1), 3个采样点分别是位于连江县城区上游的对照点AJ0, 城区下游的AJ1以及入海口AJ2, 采样点的经纬度信息见表 1.采样时间为2016年7月27号上午07:00的退潮时刻(确保所采集的样品都是入海方向的河水, 没有受到海水涨潮的影响).前期的实地调研表明3个采样点周围没有排污口分布. AJ0和AJ1两个点位的样品是在跨河桥梁的中间段, 用采水器对表层河流水样品进行随机采集, AJ2的样品则是租用渔船在入海口的河流中间进行表层河水的采样.每个采样点采集3个随机的平行样品, 每个样品采集水样3 L, 采集的样品放在含有冰袋的采样箱.采集到的河流水样迅速送回实验室-20℃冰箱存放.
|
图 1 敖江下游采样点空间位置示意 Fig. 1 Sketch of sampling sites in the downstream area of the Aojiang River |
|
表 1 采样点经纬度 Table 1 Longitude and latitude of sampling sites |
1.2 河流水样品的抽滤及DNA提取
所采集的河水样品用六联抽滤设备JTFA0215(天津津腾实验设备有限公司, 中国)进行抽滤, 滤膜为0.22 μm已灭菌的过滤膜(ADVANTEC, 日本). AJ0、AJ1和AJ2的样品在过滤膜上抽滤的水样体积分别为0.5、0.3和0.3 L, 每个样品独立抽滤2次, 得到2份相同的样品.抽滤结束后, 稍微晾干滤膜样品并将其对折, 并用铝箔纸包好(避光), 于-20℃冰箱中保存.提取DNA时, 滤膜用干净并且消毒过的手术剪剪成约2 mm×2 mm的小纸块, 将这些含有河水微生物的小纸块放入FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, 美国)中配套的Lysing Matrix E tube离心管, 然后加入978 μL配套的PBS缓冲液.根据FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒中说明书的方法, 提取河水总DNA, 最终得到的DNA样品体积为100 μL, -20℃冰箱中保存.提取得到的样品用NanoDrop 1000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc., 美国)测定DNA浓度.最后, 将每个样品的部分DNA样品配置成体积为40 μL, 浓度为50 ng·μL-1的样品, 用于后续的高通量荧光定量PCR实验.
1.3 核糖体16S rDNA荧光定量PCR采用Roche 480Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche Diagnostics, 德国)测定河流水样品的16S rRNA基因, 采用标准质粒外标法对所采集的样品16S rDNA基因丰度进行定量[18].所制备的标准质粒浓度为1.68×1010 copies·L-1, 标准曲线(10倍梯度稀释)的浓度变化范围为1.68×103~1.68×109 copies·L-1.
PCR扩增的总反应体系为20 μL, 其中包括10 μL的2×LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix, 上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1), 1 μL DNA模板, 7 μL灭菌超纯水. PCR反应的程序设置为：95℃下预变性5 min; 95℃变性时间15 s, 60℃退火时间1 min, 72℃延伸时间15 s, 总计40个循环; 仪器附带的程序会自动添加熔解曲线程序进行分析.阴性对照有利于PCR质量监控, 因此实验中采用灭菌的超纯水进行阴性PCR.此外, 所有DNA样品均做3次技术重复.
1.4 抗生素抗性基因高通量荧光定量PCR高通量荧光定量PCR采用SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Bio-systems, Inc., 美国)反应平台.本研究中所采用的296种目标基因引物在文献[7, 14, 19]被有效验证过, 其中包含285种抗生素抗性基因, 10种可移动元件(mobile genetic elements, MGEs), 1对16S rDNA引物.
高通量荧光定量PCR扩增反应的体积为100 nL.反应体系中各试剂的最终浓度为：1×的LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix试剂, 1 ng·μL-1的BSA溶液, 1 μmol·L-1的上下游引物, 5 ng·μL-1的DNA模板. PCR反应条件为：95℃预变性时间10 min; 95℃变性时间30 s, 60℃退火延伸30 s, 总共40个循环; 热循环仪Cycler的程序自动升温进行熔解曲线分析.每个qPCR芯片都有不添加样品DNA(灭菌的超纯水替代)的阴性实验对照. qPCR反应得到的数据通过Cycler预设定的筛选条件(扩增效率介于1.8~2.2)进行筛选和读取.根据SmartChip Real-Time PCR Systems的仪器性能, 确定热循环次数CT值为31时作为仪器的检测限.同时, 每个样品进行3次技术重复实验, 当3次技术重复PCR的CT值都被有效检出, 进而认定样品是阳性的有效扩增, 同一个采样点的3个采样平行样品都是阳性扩增时, 认为该采样点的目的基因被有效检出.
1.5 数据分析处理高通量定量PCR基因的相对拷贝数(relative copy number)计算方法参照已有的抗生素抗性相关的研究[20, 21], 采用公式(1)进行计算并得到结果(其中CT代表首次检测出有效信号的循环数).高通量定量PCR得到的核糖体16S rRNA基因的相对拷贝数和荧光定量PCR得到的16S rRNA基因绝对拷贝数(absolute copy number)的Pearson线性拟合结果表明, 两者呈极显著相关关系(P＜0.01), 线性关系明显.采用公式(2)计算, 进而可以得到各种抗生素抗性基因的绝对拷贝数.
|
(1) |
|
(2) |
高通量定量PCR的数据采用Excel 2010进行计算, OriginPro 9.0进行相关作图, 采用R 3.3.3(The R Project for Statistical Computing, Vienna, Austria)的vegan数据包进行PCA分析以及pheatmap数据包进行热图综合分析.
2 结果与讨论 2.1 河水中抗生素抗性基因的种类检测出的抗生素抗性基因根据相对应的抗生素类型可以分为八大类：氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside)、β-内酰胺类抗生素(β-Lactamase)、氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇抗生素类(FCA)、大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素(MLSB)、磺胺类抗生素(Sulfonamide)、四环素类抗生素(Tetracycline)、其它类型或者发挥外排泵作用(other/efflux)抗生素和万古霉素类抗生素(Vancomycin). 图 2显示了敖江下游3个采样点抗生素抗性基因的种类数目及类型. 3个采样点的河流水中总共检测出了151种抗生素抗性基因, 其中城区上游AJ0、城区下游AJ1和入海口AJ2分别检测出79、129和118种抗生素抗性基因[图 2(a)], 结果显示河流环境的抗生素抗性基因种类分布比较多样.尤其是城区下游AJ1的抗生素抗性基因种类数显著高于城区上游AJ0(P＜0.05).河流中每个采样点的抗性基因类型均涵盖了以上八大类抗生素抗性基因, 表明3个采样点在大的抗性基因类型分类水平上有一定相似度.
|
（a）抗生素抗性基因的检出数量；（b）抗生素抗性机制 图 2 检测到的抗生素抗性基因种类及类型 Fig. 2 Detected antibiotic resistant genes |
检测出的抗性基因按照抗性机制还可以分为抗生素效力失活(deactivation)、外排泵作用机制(efflux)、核糖体保护机制(protection)这3类.分类结果显示, 抗生素失活(deactivation)和外排泵作用机制(efflux)是敖江河水环境中抗生素抗性两种最主要机制, 比例分别是44.79%和30.67%[图 2(b)].
图 3显示了3个采样点抗性基因种类之间存在的关系.韦恩图结果表明, 城区下游AJ1检测出的抗性基因种类最多, 为129种.城区上游AJ0检测出的抗性基因类型在下游AJ1采样点也可以全部检测出来, 表明城区下游AJ1受河流流水的影响“接收”了上游AJ0的全部抗性基因类型.有研究表明, 城市生活污水处理厂达标排放的出水仍然会增加城市河流中的抗生素浓度和抗生素耐药菌种类[22, 23].敖江流经连江县城区, 沿途接纳了各种不合规排放的生产生活污水和城区雨水, 抗性基因种类增加了50种, 表明城区人类活动可能显著增加了敖江河水中的抗性基因种类.在敖江入海口AJ2检测到了118种抗性基因, 其中22种抗性基因不同于城区下游AJ1, 77种与城区上游AJ0相同, 表明AJ0中的抗性基因种类在本研究中3个采样点相对稳定, 并且入海口AJ2河水中有自己独特的抗生素抗性基因种类(图 3), 比如检测出了tetPA、aadA1、acrA等.
|
图 3 抗生素抗性基因相互关系韦恩图 Fig. 3 Venn diagram of ARGs at the sampling sites |
敖江下游3个采样点的各类抗生素抗性基因丰度见图 4, 其中分类除了上文提到的八大类抗性基因外, 还包含了可移动元件(mobile genetic elements, MGEs)和总抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs).各类抗生素抗性基因的绝对丰度介于7.7×107~1.5×1010 copies·L-1之间.氨基糖苷类抗生素和四环素类抗生素均为广谱抗菌药, 广泛用于防治动物和水产品的疾病感染和促进生长[24], 是使用量比较大的两类抗生素.本研究中氨基糖苷类抗性基因和四环素类抗性基因丰度比较大, 可能与水环境中的抗生素残留有关, 需要进一步开展相关溯源研究.
|
图 4 抗生素抗性基因的绝对丰度 Fig. 4 Absolute abundance of ARGs at the sampling sites |
除了万古霉素类抗性基因(Vancomycin)以外, 城区下游AJ1采样点的各类抗性基因的检出丰度都是最高的, 同时城区下游AJ1总的抗生素抗性基因丰度达到了3.9×1010 copies·L-1, 大于城区上游AJ0的6.8×109 copies·L-1, 结果表明城市不仅仅增加了抗生素抗性的种类数[图 2(a)], 也可能导致了河流中抗生素抗性的丰度增加(图 4).采样点AJ0与AJ1之间是城区段, 人类活动影响明显. AJ1至AJ2是相对自然的河段, 人类活动干扰比较小, 而且河段有一定长度, 河流环境有一定的环境承载力[25], 入海口AJ2的抗生素抗性丰度显著小于AJ1的丰度, 为7.2×109 copies·L-1, 与城区上游AJ0的抗性基因丰度接近, 但是入海口AJ2的抗性基因种类仍然有118种[图 2(a)], 高于城区上游AJ0, 表明抗性基因在河水环境中具有传播性, 一旦获得就很难自然消减[26].
此外, 敖江下游3个采样点的抗性基因丰度低于龙岩市河流中的丰度[13], 但是连江县的城市规模和城市功能均不如龙岩市, 因此城市的人口规模和城市功能特征可能与城市河水抗生素抗性的种类和丰度有一定的相关关系, 需要结合社会经济发展情况进一步开展相关研究工作.
有研究表明[27], 基于rRNA数据库的统计, 每个细菌平均含有4.0个16S rRNA基因, 因此归一化的丰度可以更好地评估单个细菌中抗生素抗性基因的存在情况(图 5).归一化的结果表明城区下游AJ1的各类抗生素抗性基因丰度比较高, 这个结果与抗性基因的绝对丰度一致. MGEs的归一化丰度比较高, 表明转座子、整合子等可移动元件在河流中抗生素抗性基因的传播、扩散和富集过程中可能发挥着比较重要作用.
|
图 5 归一化的抗生素抗性基因丰度 Fig. 5 Normalized copy number of ARGs at the sampling sites |
根据抗生素抗性基因在敖江下游3个采样点的分布情况, 采用主成分分析法进行分析, 结果显示, 城市下游AJ1的样品与城区上游AJ0和入海口AJ2样品显著分开, 在第一轴的解释量达到了54.2%(图 6), 表明城市对河流中的抗性基因分布格局产生了显著影响, 而城区上游AJ0和入海口AJ2由于人类活动干扰小, 分布格局相对比较接近.
|
图 6 采样点抗生素抗性基因主成份分析 Fig. 6 Principle component analysis of ARGs at the sampling sites |
通过聚类热图可以进一步分析城市对抗生素抗性基因分布格局的影响(图 7).聚类热图显示, 热图可以分为四大簇. A簇是在3个采样点中抗性基因丰度比较高的种类, 主要包括四环素类抗性基因tetG、转座子tnpA-04、和整合子intI, 这3类基因丰度的总体趋势：城区下游AJ1>城区上游AJ0＞入海口AJ2, 可能与我国总体上四环素类使用量比较大有关[28]. B簇的分布趋势与A簇相似, 但是整体的抗性丰度小于A簇, 主要的抗性基因是氨基糖苷类的抗性基因, 如aadA、aadA1、aadA2、aac(6′)-Ib(aka aacA4)、aadA9和转座子基因tnpA-02, 有研究表明敖江流域COD排放量主要来自畜禽养殖[29], 因此这些基因在河水中的普遍出现, 可能与区域养殖行业结构有关. C簇的抗性基因丰度比较接近, 而且在3个采样点抗生素抗性基因丰度相对比较低, 这一类抗生素抗性基因类型可能是河流水环境中固有抗性基因类型, 反映了抗性基因在环境中有一定本底值. D簇的抗性基因类型是在城区上游AJ0没有检出或者抗性基因丰度很低, 但是在城区下游AJ1和入海口AJ2则能够检出, 并且抗性基因一旦出现就能够稳定存在, 并且丰度维持在一定水平, 表明抗生素抗性基因是一种相对稳定存在的环境污染物.
|
图 7 抗生素抗性基因分布格局热图 Fig. 7 Distribution pheatmap of ARGs at the sampling sites |
有研究表明, 抗生素抗性基因与可移动元件存在着密切关系[30~32].本研究统计了3个采样点各类抗生素抗性基因丰度和可移动元件丰度之间的关系, 结果表明, β-内酰胺类抗生素抗性基因、大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素抗性基因、万古霉素类抗生素抗性基因与可移动元件存在极显著的相关关系(表 2), 可移动元件可能促进了河水这3类抗性基因的迁移、传播和扩散.
|
|
表 2 抗性基因丰度与可移动元件的相关系数 Table 2 Pearson correlation of abundance between ARGs and MGEs |
3 结论
(1) 敖江下游城市河流抗生素抗性基因丰度达到了3.9×1010 copies·L-1, 显著高于城区上游(6.8×109 copies·L-1)和河流入海口(7.2×109 copies·L-1)的丰度.
(2) 城区下游AJ1检测出了129种抗生素抗性基因, 河流入海口AJ2的抗性基因种类仍然高达118种, 均显著高于城区上游的79种, 表明河流抗生素抗性基因一旦出现, 可以在河水环境中相对稳定存在, 种类上很难自然消减.
(3) 城市河流环境是抗生素抗性基因的一个重要存储库.
(4) 由于不同的城市河流环境差异较大, 需要结合城市规模与功能、水质指标、微生物多样性等因素, 进一步评估抗生素抗性基因在城市河水中的传播机制及其影响因子.
| [1] | Dibner J J, Richards J D. Antibiotic growth promoters in agriculture:history and mode of action[J]. Poultry Science, 2005, 84(4): 634-643. DOI:10.1093/ps/84.4.634 |
| [2] | Chee-Sanford J C, Mackie R I, Koike S, et al. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste[J]. Journal of Environmental Quality, 2009, 38(3): 1086-1108. DOI:10.2134/jeq2008.0128 |
| [3] |
苏建强, 黄福义, 朱永官. 环境抗生素抗性基因研究进展[J]. 生物多样性, 2013, 21(4): 481-487. Su J Q, Huang F Y, Zhu Y G. Antibiotic resistance genes in the environment[J]. Biodiversity Science, 2013, 21(4): 481-487. |
| [4] | Van Boeckel T P, Gandra S, Ashok A, et al. Global antibiotic consumption 2000 to 2010:an analysis of national pharmaceutical sales data[J]. The Lancet Infectious Diseases, 2014, 14(8): 742-750. DOI:10.1016/S1473-3099(14)70780-7 |
| [5] | Rizzo L, Manaia C, Merlin C, et al. Urban wastewater treatment plants as hotspots for antibiotic resistant bacteria and genes spread into the environment:a review[J]. Science of the Total Environment, 2013, 447: 345-360. DOI:10.1016/j.scitotenv.2013.01.032 |
| [6] | Reinthaler F F, Posch J, Feierl G, et al. Antibiotic resistance of E. coli in sewage and sludge[J]. Water Research, 2003, 37(8): 1685-1690. DOI:10.1016/S0043-1354(02)00569-9 |
| [7] |
黄福义, 李虎, 安新丽, 等. 城市生活污水和生活垃圾渗滤液抗生素抗性基因污染的比较研究[J]. 环境科学, 2016, 37(10): 3949-3954. Huang F Y, Li H, An X L, et al. Comparative investigation of antibotic resistance genes between wastewater and landfill leachate[J]. Environmental Science, 2016, 37(10): 3949-3954. |
| [8] |
黄福义, 李虎, 韦蓓, 等. 长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究[J]. 环境科学, 2014, 35(10): 3869-3873. Huang F Y, Li H, Wei B, et al. Long-term manure application induced shift of diversity and abundance of antibiotic resistance genes in paddy soil[J]. Environmental Science, 2014, 35(10): 3869-3873. |
| [9] | Chen Q L, An X L, Li H, et al. Long-term field application of sewage sludge increases the abundance of antibiotic resistance genes in soil[J]. Environment International, 2016, 92-93: 1-10. DOI:10.1016/j.envint.2016.03.026 |
| [10] | Giger W, Alder A C, Golet E M, et al. Occurrence and fate of antibiotics as trace contaminants in wastewaters, sewage sludges, and surface waters[J]. CHIMIA International Journal for Chemistry, 2003, 57(9): 485-491. DOI:10.2533/000942903777679064 |
| [11] | Pruden A, Pei R T, Storteboom H, et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants:studies in northern Colorado[J]. Environmental Science & Technology, 2006, 40(23): 7445-7450. |
| [12] | Neu H C. The crisis in antibiotic resistance[J]. Science, 1992, 257(5073): 1064-1073. DOI:10.1126/science.257.5073.1064 |
| [13] | Ouyang W Y, Huang F Y, Zhao Y, et al. Increased levels of antibiotic resistance in urban stream of Jiulongjiang River, China[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(13): 5697-5707. DOI:10.1007/s00253-015-6416-5 |
| [14] | Zhu Y G, Johnson T A, Su J Q, et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(9): 3435-3440. DOI:10.1073/pnas.1222743110 |
| [15] | Baquero F, Martínez J L, Cantón R. Antibiotics and antibiotic resistance in water environments[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2008, 19(3): 260-265. DOI:10.1016/j.copbio.2008.05.006 |
| [16] | Biyela P, Lin J, Bezuidenhout C C. The role of aquatic ecosystems as reservoirs of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes[J]. Water Science and Technology, 2004, 50(1): 45-50. DOI:10.2166/wst.2004.0014 |
| [17] |
张玉珍, 黄文丹, 王智苑, 等. 福建敖江流域水域生态系统健康评估[J]. 湖泊科学, 2015, 27(6): 1079-1086. Zhang Y Z, Huang W D, Wang Z Y, et al. Evaluation of aquatic ecosystem health in Aojiang Basin, Fujian Province[J]. Journal of Lake Sciences, 2015, 27(6): 1079-1086. |
| [18] |
李丽, 赵成萍, 李宏, 等. 质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立[J]. 农业生物技术学报, 2011, 19(6): 1157-1162. Li L, Zhao C P, Li H, et al. Establishment of the plasmid standard curve generation method for absolute quantification PCR[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2011, 19(6): 1157-1162. |
| [19] | Chen Q L, An X L, Zhu Y G, et al. Application of struvite alters the antibiotic resistome in soil, rhizosphere, and phyllosphere[J]. Environmental Science & Technology, 2017, 51(14): 8149-8157. |
| [20] | Looft T, Johnson T A, Allen H K, et al. In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(5): 1691-1696. DOI:10.1073/pnas.1120238109 |
| [21] |
黄福义, 安新丽, 陈青林, 等. 梅花鹿养殖场抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2016, 37(11): 4402-4409. Huang F Y, An X L, Chen Q L, et al. Distribution characteristics of antibiotic resistance genes in sika deer farm[J]. Environmental Science, 2016, 37(11): 4402-4409. |
| [22] | Yang S, Carlson K. Evolution of antibiotic occurrence in a river through pristine, urban and agricultural landscapes[J]. Water Research, 2003, 37(19): 4645-4656. DOI:10.1016/S0043-1354(03)00399-3 |
| [23] | Bessa L J, Barbosa-Vasconcelos A, Mendes Â, et al. High prevalence of multidrug-resistant Escherichia coli and Enterococcus spp. in river water, upstream and downstream of a wastewater treatment plant[J]. Journal of Water and Health, 2014, 12(3): 426-435. DOI:10.2166/wh.2014.160 |
| [24] |
苏晶, 汤立忠, 陈长毅, 等. 高效液相色谱串联质谱法同时测定9种龙虾中氨基糖苷类和四环素类抗生素残留[J]. 食品工业科技, 2016, 37(2): 60-63, 67. Su J, Tang L Z, Chen C Y, et al. Simultaneous determination of nine aminoglycosides and tetracyclines antibiotics residues in crayfish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(2): 60-63, 67. |
| [25] | Meng L H, Chen Y N, Li W H, et al. Fuzzy comprehensive evaluation model for water resources carrying capacity in Tarim River Basin, Xinjiang, China[J]. Chinese Geographical Science, 2009, 19(1): 89-95. DOI:10.1007/s11769-009-0089-x |
| [26] | Salyers A A, Amabile-Cuevas C F. Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination?[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1997, 41(11): 2321-2325. |
| [27] | Klappenbach J A, Saxman P R, Cole J R, et al. rrndb:the ribosomal RNA operon copy number database[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(1): 181-184. DOI:10.1093/nar/29.1.181 |
| [28] | Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China:source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. |
| [29] |
鲍秋萍. 敖江流域生态系统健康评价[D]. 福州: 福建师范大学, 2014. Bao Q P. Assessment on ecosystem health of AoJiang basin[D]. Fuzhou: Fujian Normal University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10394-1015521093.htm |
| [30] | Stokes H W, Gillings M R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2011, 35(5): 790-819. DOI:10.1111/j.1574-6976.2011.00273.x |
| [31] | Ciric L, Mullany P, Roberts A P. Antibiotic and antiseptic resistance genes are linked on a novel mobile genetic element:Tn6087[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2011, 66(10): 2235-2239. DOI:10.1093/jac/dkr311 |
| [32] |
黄福义, 安新丽, 李力, 等. 生活垃圾填埋场对河流抗生素抗性基因的影响[J]. 中国环境科学, 2017, 37(1): 203-209. Huang F Y, An X L, Li L, et al. High-throughput profiling of antibiotic resistance genes in river in the vicinity of a landfill[J]. China Environmental Science, 2017, 37(1): 203-209. |