2018, Vol. 39
2. 广东省污染控制与修复材料工程技术中心, 广州 510630
2. Guangdong Engineering Center for Environment Contamination Control and Restorative Materials, Guangzhou 510630, China
在好氧条件下能够进行硝化和反硝化的一类微生物称作异养硝化-好氧反硝化菌, 从Robertson[1]1988年首次分离出异养硝化-好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha以来, 已发现了Bacillus[2]、Pseudomonas[3]、Alcaligenes[4]、Acinetobacter[5]等具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌属.传统的生物脱氮技术须经好氧硝化和厌氧反硝化两个单独过程, 但异养硝化-好氧反硝化细菌则可以在好氧条件下在同一生物反应器内实现同步硝化反硝化, 这一脱氮特性能够有效缩短反应路径, 提高脱氮效率, 因此在含氮废水的生物处理中成为一个研究热点.
目前对于异养硝化-好氧反硝化菌的研究主要集中在其脱氮特性上, 且大多为摇瓶实验[2~5].文献[6~8]以氨氮为底物分别研究了单菌株Ochrobactrum anthropi XH02、Bacillus sp. K5和Acinetobacter junii YB的强化脱氮特性, 取得了较好的效果.然而, 目前利用异养硝化-好氧反硝化菌强化去除硝态氮的研究则鲜有报道.此外, 由于复合菌株较单菌株而言, 具有适应性好[9, 10], 负荷性高的特点[11], 对于生物反应器脱氮强化有较强的潜力, 应更适合作为强化菌株, 但是目前几乎没有利用复合菌株进行生物脱氮强化的报道.而目前生物脱氮强化的研究更多关注在脱氮特性上, 对强化脱氮过程中菌群结构变化演替规律的研究则关注较少, 菌群结构组成会直接影响到生物反应器处理效率[12], 探究复合菌株强化过程中的菌群结构对生物反应器有重要的意义.
本文以好氧SBR反硝化反应器为研究对象, 利用实验室筛选出来的异养硝化-好氧反硝化复合菌株YH01+YH02进行好氧反硝化强化, 探究其对硝态氮的强化去除潜力.同时利用高通量测序技术分析反应器中的菌群丰度和多样性的动态变化, 并对菌群结构进行PCA主成分析和UPGMA聚类分析, 通过阐明菌群结构的变化与工艺运行效率之间的联系, 以期为生物处理硝态氮废水提供一定的理论参考.
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验菌株和接种污泥实验菌株来自本实验室筛选到的两株高效的异养硝化-好氧反硝化菌株Delftia sp.YH01和Acidovorax sp.YH02. YH01、YH02分别接入500 mL LB培养基的摇瓶中, 于30℃、120 r·min-1摇床中培养24 h, 然后离心收集菌体.最后按照1:1的比例把菌株混合, 再用无菌水重悬菌体至D600为2.0左右而得复合菌株培养液.
实验活性污泥来自于广州市大坦沙污水处理厂的生化好氧池, 其MLSS为2 500~3 000 mg·L-1, SVI为90~120 mL·g-1.
1.1.2 实验进水实验进水采用人工合成水质, 以柠檬酸三钠为碳源, KNO3为氮源, 具体水质如下：COD 950~1050 mg·L-1; NO3--N 190~210 mg·L-1; pH 7.4~7.6.每1 L进水加入50 mL微量元素溶液, 微量元素配方如下：K2HPO4, 5.0 g·L-1; MgSO4·7H2O, 2.5 g·L-1; NaCl, 2.5 g·L-1; FeSO4·7H2O, 0.05 g·L-1; MnSO4·4H2O, 0.05 g·L-1.
1.2 好氧SBR反硝化工艺好氧SBR反应器由有机玻璃制成, 有效容积3 L.采用向上流进水, 利用鼓风曝气, 使气水同向.将新鲜的活性污泥接种于SBR反应器中, 运行周期设为12 h, 进水2 h, 曝气9 h 25 min, 沉淀30 min, 出水5 min, 实验期间不进行排泥处理.空气经底部曝气头扩散到反应器内, 用空气流量计调节进气量为3.5 L·min-1, 温度控制在30℃左右.好氧SBR反硝化工艺分为两个阶段：第一阶段(启动阶段)：未投加复合菌株培养液, 每3 d测定出水水质指标, 直到出水稳定.第二阶段(强化阶段)：出水水质稳定后, 按进水量的30%投加复合菌株培养液, 每3 d测定出水水质指标.出水水质指标包括TN、NH4+-N、NO2--N和COD.
1.3 菌株的鉴定利用细菌的特异性引物27F(5′-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3′)和1492F(5′-TTGGYTACCTTG TTACGACT-3′)对菌株进行DNA提取和PCR扩增.其扩增产物交由上海美吉科技公司进行测序.
1.4 微生物群落结构分析为研究反应器内生物群落结构的变化趋势, 取其污泥样品来测定生物群落组成.反应器在投加YH01+YH02前的稳定期, 取污泥样品一份. YH01+YH02培养液投加到反应器后取样一次, 而后每隔2 d进行污泥样品取样, 共取9份样品用于DNA提取.
使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit试剂盒对细菌DNA进行提取, 其提取方法均按照标准步骤.提取出来的DNA用细菌的16S rDNA引物338F5′-ACTCCTACGGGAGGCAGGAC-3′和806R5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′进行PCR扩增. PCR(10 ng)反应体系为20 μL：缓冲液4 μL; dNTPs(25 mmol·mL-1)2 μL; DNA模板100 ng; 上下游引物(50 mmol·mL-1)0.8 μL; 其余用双蒸水补充. PCR扩增步骤：95℃ 3 min; 30个循环(95℃ 30 s, 45℃ 30 s, 72℃ 42 s); 72℃延伸10 min.然后再将PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测条带, 用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物.用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega)对标记的PCR产物检测定量.再利用PCR扩增建立测序文库, 在Illumina MiSeq测序仪进行测序, 由上海美吉生物科技公司完成.
微生物群落多样性分析前对原始数据进行质量控制, 去除低质量序列.采用QIIME在97%相似水平上对高质量序列进行OTU划分, OTU丰度小于0.001%会被去除[13].并通过Greengenes数据库对比, 对OTU进行分类注释.用Ace和Chao指数分析群落丰度[14], Shannon和Simpson指数分析群落多样性[15], 并用Canoco和Mothur软件分别进行主成分析和聚类分析.
2 结果与讨论 2.1 16S rDNA基因序列和系统发育分析为确定YH01、YH02种属, 对菌株进行DNA提取和PCR扩增, 扩增后产物进行DNA测序, 获得的基因序列在GenBank中登录号为KY419588、KY419589, 通过Blast同源性检索, 构建系统进化发育树.如图 1所示, 可初步确定YH01为戴尔福特菌属(Delftia), YH02为食酸菌属(Acidovorax), 均属于变形菌门(Proteobacteria).
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图 1 基于16S rDNA基因序列同源性构建YH01、YH02系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree of the strains YH01 and YH02 based on the complete sequence of the 16S rDNA gene |
为测定菌株YH01、YH02和YH01+YH02的好氧反硝化特性, 分别以NO3--N 220 mg·L-1、NO2--N 220 mg·L-1为单一氮源来测定它们的反硝化效率.如图 2(a)~2(c)所示, 在以NO3--N为单一氮源的摇瓶实验中, 可以发现24 h后单菌株和复合菌株对NO3--N、TN、COD的去除率基本保持稳定.从图 2(a)和图 2(b)可以看出, YH01、YH02、YH01+YH02在24 h对NO3--N的去除率分别为88.7%、85.1%、95.3%, 对TN去除率分别为67.2%、70.3%、87.2%, 明显地复合菌株YH01+YH02反硝化效率比单菌高, 复合菌株更有益于提高脱氮效率. 图 2(c)所示, 24 h后YH01、YH02、YH01+YH02对COD的去除率较为接近, 分别为88.2%、89.4%、90.1%.
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图 2 YH01、YH02、YH01+YH02反硝化特性 Fig. 2 Characteristics of denitrification by YH01, YH02, and YH01+YH02 |
而当NO2--N为单一氮源时的反硝化效率如图 2(d)~2(f)所示, 在24 h后, YH01、YH02和YH01+YH02对NO2--N、TN、COD的去除率基本保持稳定.在24 h时, YH01、YH02和YH01+YH02对NO2--N的去除率分别为88.2%, 89.0%和90.1%, 对TN的去除率分别为85.3%、88.9%和88.9%, COD的去除率为89.0%、90.1%和91.2%.可以看出, 当以NO2--N为单一氮源时, YH01、YH02和YH01+YH02的反硝化的效率与以NO3--N为单一氮源时差异不大.
在关于复合菌株脱氮研究中, Ochrobactrum sp.XH02+Pseudomonas sp.XH03[10]和Pseudomonas sp.B2+Streptromyces sp.A9+Fusarium sp.F3[9], 这些复合菌株均有较高的脱氮效率.此外, 复合菌株较单菌株对环境耐受性更强[16], 原因可能是复合菌株之间的协同效应使其对环境有更强的适应性, 因此复合菌株更适合进行生物脱氮强化.复合菌株YH01+YH02具有高效的好氧反硝化能力, 比单菌株YH01、YH02更有益于提高脱氮效率, 这对于实际的含氮废水处理有重要的意义, 因此YH01+YH02复合菌株适合进行生物脱氮强化.
2.3 SBR反应器反应器启动过程见图 3(a).启动初期的脱氮效率较差, 这一阶段为活性污泥的适应期.在10~31 d, 脱氮效率稳定上升, 此阶段中能适应环境的微生物被保留下来, 不能适应的被淘汰.在启动末期NO3--N、TN和COD去除率基本稳定, 平均去除率分别为73.4%、64.5%和80.7%.反应器经过31 d的运行, 启动成功.
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图 3 反应器的启动和强化阶段各指标的浓度变化 Fig. 3 Changes in N and COD concentrations in the period of start-up and enhancement |
反应器运行稳定后, 在31 d投加复合菌株进行强化.强化阶段中的反硝化效率如图 3(b)所示, 在31~34 d内, 脱氮效率较强化前出现下降的趋势, 而后在34~52 d, NO3--N、TN和COD去除率回升并趋向稳定, 其平均去除率较强化前分别增加12.1%、9.2%和9.4%.在强化阶段中, 脱氮效率出现波动的原因可能是因为复合菌株YH01+YH02的加入, 与原系统的微生物菌群在生存空间和营养上进行竞争, 使得原系统的生物菌群结构发生变化, 反应器运行效率故此受到影响.此外, 根据研究发现, 在废水处理上成功的生物强化需要强化菌株在强化系统中能够存活下来并保持活性, 且不对体系内的原有菌群的降解能力产生消极影响[17].所以为确保强化菌株存活下来并保持活性, 有研究人员通过重复投加强化菌株[18]或者包埋菌株[19]的方式进行强化脱氮, 但这些方法会额外增加运行成本且操作繁复.而在本实验中, 复合菌株YH01+YH02仅通过一次投加就成功引入到原活性污泥反应体系中, 并在反应器脱氮过程中产生积极的影响, 说明YH01+YH02在实际强化处理上具有灵活性强、适应性好的优势.
2.4 生物群落丰度和多样性分析SBR反应器运行中各阶段的污泥样品经过高通量测序得到的丰度指数(Ace和Chao指数)和多样性指数(Shannon和Simpson指数)见图 4. Chao和Ace指数总体呈上升趋势, 这表明反应器中生物群落丰度变化整体为上升趋势, 其中第40 d的样品丰度(Ace：417, Chao：420)最高. Shannon和Simpson指数从初始的3.71和0.06, 到52 d时下降到3.60和0.05, 表明反应器内生物多样性总体呈下降趋势.相似的现象, 也发生在一些生物脱氮研究中, 对反应器内的生物群落分析中也观察到生物多样性出现下降的现象[6, 20, 21], 这与有的学者认为生物强化并不会引起反应器多样性产生变化的观点不同[8].随着复合菌株YH01+YH02投加到反应器后, 活性污泥体系中生物群落的相对丰度和多样性都出现了较大的波动现象, 主要原因可能是YH01+YH02加入到反应器后, 与某些异养细菌之间存在协同效应, 能够促进相互之间的生长繁殖, 而且有机碳更容易被异养细菌所利用[22], 这样使得它们在竞争空间和营养中处于优势地位, 从而淘汰了一些与它们存在竞争关系的菌株.因此生物群落相对丰度整体呈上升趋势, 而多样性则略有下降.
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图 4 丰度指数和多样性指数 Fig. 4 Abundance and diversity indexes |
如图 5所示, 9个污泥样品共检测到27个菌门, 共有的菌门为19个, 其中Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)和Chloroflexi(绿弯菌门)在反应器内丰度靠前, 分别为62.1%±4.1%、22.2%±8.0%、7%±3%和3.3%±2.0%. Proteobacteria是反应器内最优势种群, 同样地在Ochrobactrum anthropi XH02[6]强化反应器脱氮过程中, 也发现Proteobacteria是反应器内最优势菌门. Proteobacteria、Chloroflexi和Planctomycetes在投加YH01+YH02后, 其相对丰度增加了7.0%、3.4%和3.1%. Proteobacteria、Chloroflexi和Planctomycetes都包含许多脱氮菌, 且这些细菌广泛存在于好氧脱氮系统中[23~25]. Bacteroidetes的相对丰度从强化前的31.0%下降到14.6%, 表明了YH01+YH02与其存在竞争关系, 并且Bacteroidetes处于劣势地位, 其生长受阻, 相对丰度一直降低到15.0%左右.
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图 5 门水平上微生物相对丰度的变化 Fig. 5 Changes in the relative abundance of microorganisms at the phylum level |
为清楚阐明SBR反应器在运行过程中生物群落的演替过程, 在菌属水平上选取相对丰度排名前30的来制作群落结构Heatmap图, 如图 6所示, 列表示样品, 行表示菌属, 色块深浅表示相对丰度的大小, 颜色越红其相对丰度越高, 越绿其相对丰度越低.通过色块深浅变化可以观察生物群落结构变化过程. Uncultured Saprospiraceae、Thauera(陶厄氏菌属)、Luteimonas(藤黄单胞菌属)在运行期占主导地位, 相对丰度均在3%以上, 并且均属于Proteobacteria菌门. Uncultured Saprospiraceae、Thauera和Luteimonas在YH01+YH02投加后相对丰度都出现了先升后降的现象, 到了52 d时跟强化前比较分别下降了7.1%、0.5%和7.5%, 这可能是因为YH01+YH02虽然能够促进它们的生长, 但是反应器运行后期形成了新的菌群, 与它们形成了竞争关系, 其生长繁殖受到抑制.其中Uncultured Saprospiraceae在反应器运行期间一直是最优势菌属, 但几乎没有关于其在脱氮方面相关的文献报道, 而其在反应器内相对丰度较高, 这意味着Uncultured Saprospiraceae属下的菌种具有较强的环境适应能力, 值得进一步研究.
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图 6 菌属的丰度热图 Fig. 6 Heatmap of the bacterial community at the genus level |
Delftia和Acidovorax在反应器运行各阶段的相对丰度的变化见图 7. Delftia和Acidovorax在投加到反应器时丰度分别为0.09%和0.1%, 随着反应器的运行, 它们的丰度呈上升趋势, 52 d时相对丰度增加到2.2%和3.5%.虽然Delftia和Acidovorax在运行结束时没有成为最优菌属, 但是它们相对丰度排名在前10名以内, 而且可以观察到随着Delftia sp.YH01+Acidovorax sp.YH02的加入, SBR反硝化效率提高了10%左右, 这可能是YH01+YH02与其它菌属具有协同效应, 对反应器的脱氮起到重要作用.此外, 因Delftia具有氨化、硝化和反硝化的能力, 这保证了它能较好适应新的环境[26], 而Acidovorax在酸性环境下仍能进行好氧反硝化[27], 表明了Delftia+Acidovorax在与其它菌属竞争中仍有较强竞争力, 并且对恶劣的环境有良好的适应能力.
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图 7 Delftia和Acidovorax的相对丰度变化 Fig. 7 Relative abundances of Delftia and Acidovorax |
PCA分析指通过分析样本的不同组成可以反映样本间菌群结构的差异程度, 样本的菌群结构差异程度越大, 表现出在PCA图中距离越分散, 反之则越接近, 通过PCA分析可以揭示出反应器在运行过程中的不同阶段的生物菌群结构的变化规律[28, 29].本实验对9个污泥样品的OTU组成进行PCA分析, 如图 8所示, 可以明显看出31~34 d内的样品和第37 d的样品距离较远, 说明31~34 d与第37 d的微生物种类相似程度较低, 这可能是由于YH01+YH02的加入后, 与其它菌种存在协同或竞争关系, 打破了原有的菌群平衡, 使得菌群结构发生了巨大的变化.在40~46 d内的3个样品距离较近, 表明各样品中微生物种类相似程度较高, 反应器菌群结构在此阶段处于相对平衡状态.而40~46 d与49~52 d的样品间有一定的距离, 这表明了SBR在运行末期菌群结构有一定的变化, 可能是出现了新的菌群.因此, 可以将SBR运行过程分成4个不同的阶段, 表明复合菌株YH01+YH02加入到反应器后, 菌群结构随着强化过程的不同阶段而变化, 更直观地反映了SBR反应器中生物菌群的演替过程.
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图 8 菌群的PCA主成分析 Fig. 8 Principal component analysis of the bacterial community |
微生物菌群变化分析通常会由于统计模型的不同而导致不同的分析结果[30, 31].而UPGMA聚类分析能较好反映出微生物菌落结构变化与反应器运行之间联系[20].对9个样品的功能基因进行聚类分析, 结果如图 9所示, 31~34 d样品作为运行初期, 样品的菌群结构较为相似, 而到了37 d时样品菌群结构与运行初期相比发生较大变化, 这可能由于菌群竞争激烈而致.而到了40~46 d的样品的菌群结构较为相似, 说明了反应器内菌群结构趋向稳定.而到运行末期, 49~51 d样品的相似度较高, 与40~46 d菌群结构有差异, 说明末期菌群又发生了改变.这样可大致将强化过程分为31~34、37、40~46和49~52 d这4个阶段, 说明体系内菌群结构呈现规律演替, 这与张斌等[32]的研究结论类似.这表明了强化的不同阶段微生物群落存在一定的演变关系, 经过规律演替过程最终会形成稳定的菌群结构.
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图 9 菌群的UPGMA聚类分析 Fig. 9 Cluster analysis of the bacterial community by UPGMA |
(1) 复合菌株YH01+YH02可明显提高SBR好氧反硝化效率, NO3--N、TN和COD去除率较强化前分别提高了12.1%、9.2%和9.4%.
(2) 在强化SBR好氧反硝化过程中, 菌群在门水平以Proteobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes为主, 丰度均在5%以上.在属水平上以Uncultured Saprospiraceae、Thauera和Luteimonas为主, 丰度均在3%以上.
(3) Delftia和Acidovorax菌相对丰度在强化过程中呈现上升趋势, 复合菌株YH01+YH02在反应器内具有良好的适应能力, 对好氧反硝化起着非常重要的作用.
(4) PCA分析和UPGMA聚类分析大致把SBR强化脱氮运行过程分为4个阶段, 分别对应31~34、37、40~46和49~52 d.
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