2017, Vol. 38
2. 城市雨水系统与水环境省部共建教育部重点实验室, 北京 100044;
3. 甘肃农业大学资源与环境学院, 兰州 730070
, ZHANG Guo-zhen1
, YANG Xiao-ni3 , WU Fu-ping1 , ZHAO Wei1 , ZHANG Hong-wei1 , ZHANG Xiang1
2. Key Laboratory of Urban Stormwater System and Water Environment, Ministry of Education, Beijing 100044, China;
3. College of Natural Resources and Environment, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
我国西北地区水资源极度匮乏, 是典型的集雨饮水地区.随着我国水资源短缺形势日趋严峻, 集雨窖水在保障地区人畜饮水安全领域日益发挥着重要的作用, 具有不可替代性.目前, 由于受地形、社会经济发展状况等的限制, 典型集雨饮水地区的雨水集流面主要有屋面(机瓦、混凝土)、水泥地面和土地面这3种, 水窖类型有水泥窖和红黏土水窖两种, 以农户庭院为组织单元的不同类型的集流面和水窖共同组成了集雨水源地.然而, 农户庭院集流面同时也是农户生产生活的主要场所, 不可避免地存在着雨水洗滤大气粉尘、禽畜粪便、生活与生产垃圾无序处置等所造成的污染问题, 致使入窖雨水受到大量的有机污染物、微生物、氮、磷等的污染.其次, 集流雨水从雨季首次降水形成汇流入窖至蓄满水窖的时间段内, 经历了雨季雨水冲刷集流面形成汇流并间歇汇流入窖、旱季集流面污染物日日累积与每日取用窖水的较为复杂过程.窖水与湖泊、河流、水库等地表水不同, 是一种相对封闭的水体, 集雨环境中大量的污染物被冲刷流入水窖, 造成污染物的累积.
目前, 对窖水水质评价主要以理化指标、细菌总数及总大肠菌群数为主, 并以此探讨了饮用窖水对健康的影响, 甚少考虑病原微生物指标[1~12].微生物对外界环境变化敏感, 因此常被作为指示生物用于监测和反映水质情况, 同时微生物还能通过同化、异化作用来对污染物进行降解, 有助于减少污染物的积累, 对维持水生态系统的稳定性具有重要作用[13, 14].因此, 全面、系统地探讨窖水中微生物群落结构特征和功能特征, 是揭示窖水水质变化机制、评价以水为媒介的微生物病原体污染状况、开展集雨窖水水源地优选、改善集雨水源地集雨环境及窖水水质的有效切入点.
近年来, 16S rRNA基因-Illumina MiSeq高通量测序技术在海洋、湖泊、水库、污水处理系统等水体微生物多样性、群落结构及功能研究领域应用日益广泛, 并体现出其独特的优势性[15, 16].本文应用16S rRNA基因-Illumina MiSeq高通量测序技术, 分析研究了不同类型的集雨水源地水体中微生物群落结构与功能特征之间的差异, 以期为揭示窖水水质变化的机制、开展集雨窖水水源地优选及改善窖水水质提供借鉴.
1 材料与方法 1.1 水样采集根据我国干旱半干旱典型集雨地区集雨现状, 针对不同集流面和水窖类型组合现场取样, 并以数字编号. 1、2、3号为黄土地集流面+红黏土水窖组(A), 4、5、6号为黄土地集流面+混凝土水窖组(B), 7、8、9号为混凝土集流面+混凝土水窖组(C), 10、11、12号为混凝土集流面+红黏土水窖组(D). 4组水样取自同一个自然村的4户农村庭院, 各庭院集流面与汇流水窖一一对应, 集流雨水不存在交叉汇流入窖现象.
4种水窖的构造及取样点位置如图 1所示.取400 mL的窖水经0.22 μm聚碳酸酯膜负压过滤, 收集滤膜, 用事先灭菌且经过75%的酒精消毒的医用剪刀剪碎后, 置于2 mL的无菌离心管中, 于-80℃的超低温冰箱中保存至DNA提取.
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图 1 水窖结构示意 Fig. 1 Schematic of cellar water structure |
窖水水样的细菌基因组DNA采用Water DNA Isolation Kit试剂盒提取.待DNA完全溶解后, 将TE缓冲液设为空白对照, 移取2 μL, 使用超微量紫外可见分光光度计(美国Quawell Q5000) 检测其浓度, 并根据D260/D280的值检测其纯度.移取3 μL DNA, 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 在凝胶成像系统上拍照观察分析DNA样品的完整性, 电压为120 V, 电泳时间约为20 min.
1.3 高通量测序及数据分析 1.3.1 MiSeq高通量测序以12个DNA原液作为PCR模板, 利用细菌16S rDNA通用引物进行V4区扩增.引物序列为F:520F:(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′), R:802R:(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′). PCR反应条件为：98℃预变性3 min; 98℃变性30 s; 50℃退火30 s; 72℃延伸30 s; 27个循环; 72℃后保温5 min, 于4℃保存.反应结束后配制2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
PCR扩增图谱条带清晰明显, 且条带位置一致, 背景干净, 符合后续分析要求.委托上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序.
1.3.2 测序数据优化处理运用Qiime进行序列过滤, 去除5′端引物错配碱基数＞1的序列; 去除含有模糊碱基的序列; 去除含有连续相同碱基数＞8的序列; 去除长度≤150 bp的序列; 运用Mothur软件中Uchime的方法去除嵌合体序列, 得到优质序列.
1.3.3 OTU聚类分析及注释在Qiime中调用Uclust的方法对优质序列按序列相似度0.97进行聚类, 选取每个类中最长的序列为代表序列.在Qiime中调用Blast的方法用序列数据库进行比对, 获得每个OTU代表序列的分类学信息.注释数据库为：Greengene.之后对OTU进行精简处理, 去掉丰度值小于总序列条数0.001%的OTU, 得到精简后的OTU列表.
1.3.4 多样性及群落结构分析根据水样物种丰度情况, 应用软件Mothur中的summary.single命令, 计算菌群Chao、ACE、Shannon、Simpson多样性指数. 12个样品数据批量导入Qiime软件, 进行组间差异性分析, 生成不同分类水平上的物种丰度表和多样品物种分布, 通过Galaxy在线平台进行LEfSe分析, 并使用PICRUSt软件, 根据KEGG数据库中微生物代谢功能的类别对群落样本进行功能基因预测.
2 结果与分析 2.1 窖水水体理化性质不同类型水窖各取样点水质指标略有不同, 窖水水质总体上呈弱碱性, 浊度明显超标, 尤其是TN、TP指标超标严重(表 1).
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表 1 不同类型水窖水体物理化学指标 Table 1 Physiochemical parameters of cellar water |
2.2 微生物群落多样性分析 2.2.1 α多样性分析
12个窖水样品的OTU聚类与物种分类、丰富度与多样性在组间和组内都具有差异性(表 2).这种差异性, 可进一步通过OTU稀释曲线、OTU分布维恩图、OTU等级丰度分布曲线得到阐释.
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表 2 窖水水体细菌16S rRNA序列、丰富度及多样性 Table 2 Pearson's correlation coefficient of biodiversity and physiochemical parameters of cellar water |
OTU稀释性曲线(图 2), 趋于平坦, 但仍未达到饱和.但香农指数稀释曲线(图 3)平坦, 各样品覆盖率较高(表 2), 说明测序获取了绝大多数样本信息, 能够反映窖水的微生物群落组成.除此之外, 从OTU稀释曲线可以直观地看出样品间微生物群落组成存在的差异, OTU丰富度从大到小的排序为8号＞7号＞10号＞11号＞4号＞5号＞9号＞6号＞12号＞3号＞1号＞2号.
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图 2 OTU稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curve of OTUs |
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图 3 香农指数稀释曲线 Fig. 3 Rarefaction curve of Shannon-Wiener index |
OTU分布维恩图反映了窖水样品间及组间微生物群落结构的差异状况.分析样品间OTU分布的聚类注释可知[图 4(a)~4(c)]：1、2、3号样品有共同的OTU数目为153条, 4、5、6号样品共有的OTU数目为463条, 7、9号样品共同的OTU数目为420条, 10、12号样品共同的OTU数目为424条, 1~12号样品共有的OTU数目为65条, 特有OTU数目各不相同. OTU分布的组间聚类注释分析见图 4(d), 4组样品共有的OTU数目为245个, A、B、C、D特有的OTU数目分别为109、91、175、111条, 其余OTU为样本两两共有, 其中样本C中特有的OTU数目最多, 预示着较多的特有微生物种类. B与D共有的OTU数目较多, 为564条.可以看出, 无论是组内各平行样的OTU进行聚类分析结果, 还是组间OTU聚类注释分析结果, 都显示了D组具有较高的微生物多样性.
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图 4 OTU分布维恩图 Fig. 4 Venn diagrams showing the distribution of OTUs |
Rank-Abundance曲线, 可直观反映样品中包含的物种分类丰富度和均匀度(图 5).各样品曲线斜率较大, 表明有优势菌.从水平方向上看, 12个样品在横轴上跨度即丰富度从大到小的排序为8号＞7号＞10号＞11号＞4号＞5号＞9号＞6号＞12号＞3号＞1号＞2号, 这与12个样品OTUs统计结果相吻合.
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图 5 样品的OTU等级丰度分布曲线 Fig. 5 OTU Rank-Abundance distribution curves of samples diagrams showing the distribution of OTUs |
根据样品之间微生物的进化信息以及微生物丰度信息进行Unifrac分析, 得到样品差异的距离矩阵, 并对4组12个样品之间的距离矩阵信息进行PCoA分析.通过对数据的第1(PC1) 与第2(PC2) 主成分分析绘制基于Unifrac加权主坐标分析图(图 6)与基于Unifrac非加权主坐标分析图(图 7).
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图 6 样品细菌群落结构Unifrac加权主坐标分析 Fig. 6 Weighted Unifrac analysis of the samples |
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图 7 样品细菌群落结构Unifrac非加权主坐标分析 Fig. 7 Unweighted Unifrac analysis of the samples |
基于Unifrac加权主坐标分析其第一主成分、第二主成分的贡献率分别为63.98%、15.00%.在以PC1和PC2为坐标作图时, 除了B组和C组区分度不太理想, 4、6、9号样品存在交叠现象外, 其余样品之间均得到较好的区分, 各样品距离较远, 不存在交叠现象, 显示4组样品在群落构成上存在明显的差异.基于Unifrac非加权主坐标分析其第一主成分、第二主成分的贡献率分别为26.41%、20.91%.在以PC1和PC2为坐标作图时, 4组样品之间的距离较远, 不存在交叠现象, 显示4组样品在群落构成上存在显著的差异.
2.3 窖水微生物群落组成分析 2.3.1 门水平的微生物群落分布特征窖水水样细菌群落在门分类水平上多样性丰富, 达到25个门(图 8).主要微生物类群包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线细菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、OD1、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、TM7.
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图 8 样品中门水平细菌群落结构及分布 Fig. 8 Bacterial communities and distribution of the samples at the phylum level |
分析窖水水样中微生物在门水平上的群落结构差异主要有如下特征：拟杆菌门、变形菌门、放线细菌门、疣微菌门、OD1、浮霉菌门、芽单胞菌门是占总菌群的比例较大的优势菌属, 平均相对丰度分别为39.10%、29.20%、15.30%、7.00%、4.70%、1.00%、1.00%, 它们构成了窖水在门层次上的基本群落结构; 4组12个样品中微生物群落在组间和组内存在差异, 即少数绝对优势菌拟杆菌门、变形菌门、放线细菌门、疣微菌门、OD1的相对丰度有显著的差异, 各绝对优势菌的优势地位有所变化:A组、B组、9号样品中相对比例最多的拟杆菌门在D组、7、8号样品中被变形菌门代替.
除此之外, 拟杆菌门与变形菌门、放线细菌门、疣微菌门相对丰度之间存在一定的相关性, 分别对拟杆菌门与变形菌门、放线细菌门、疣微菌门相对丰度进行曲线拟合(图 9), 它们之间的相对丰度存在较好的指数函数关系(R2为0.902、0.800、0.6272).而相对丰度≤1.00%的微生物群落浮霉菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、TM7相对丰度在各样品中差别不大; 个别微生物群落出现在特定的窖水样品中, 如古生菌门(Euryarchaeota)、Armatimonadetes、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、衣原体门(Chlamydiae)、绿菌门(Chlorobi)、GN02、TM6、螺旋体门(Spirochaetes)、[Thermi].
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图 9 窖水中拟杆菌门与变形菌门、放线细菌门、疣微菌门相对丰度的相关性分析 Fig. 9 Correlation between Bacteroidetes and Proteobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia based analyses of relative abundance in cellar water |
12个水样中属水平的细菌共184个, 其中黄杆菌属(Flavobacterium, 5.80%)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium, 5.40%)、噬酸菌属(Acidovorax, 3.80%)、多核杆菌属(Polynucleobacter, 3.80%)等相对丰度大于1.00%菌群达21属, 构成了窖水在属层次上的基本群落结构.
各水样39种共有细菌菌属的差异主要体现在优势菌群(相对丰度≥1.00%)地位及其相对丰度的变化(图 10)：1、2、3号水样中显著差异菌属为黄杆菌属(Flavobacterium)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、噬酸菌属(Acidovorax)及隶属于下列分类水平的未知属：噬纤维菌科(Cytophagaceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae); 4、5、6号水样中相对丰度占优势的菌群有13种, 其中显著差异的菌属为噬酸菌属(Acidovorax)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、铁细菌属(Crenothrix)、丰收神菌属(Opitutus)及隶属于下列分类水平的未知属：C111、放线菌目(Actinomycetales)、ACK-M1、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、ZB2; 7、8、9号水样中相对丰度占优势的菌群有16种, 其中显著差异菌属为黄杆菌属(Flavobacterium)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、弓形菌属(Arcobacter)及隶属于下列分类水平的未知属：放线菌目(Actinomycetales)、ACK-M1、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、R4-41B; 10、11、12号水样中相对丰度占优势的菌群有17种, 其中显著差异的菌属为Aquirestis、红细菌属(Rhodobacter)、噬酸菌属(Acidovorax)、多核杆菌属(Polynucleobacter)及隶属于下列分类水平的未知属：ACK-M1、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、ZB2.
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图 10 水样中属水平细菌群落(共有菌)结构及分布 Fig. 10 Bacterial communities and distribution(common bacteria)of the samples at the genus level |
窖水各水样属水平的细菌群落分布特征及差异, 更多地体现在139种非共有菌属的组成及相对丰度(图 11)：其中非共有优势菌属(相对丰度≥1.00%)有伊金氏菌属(Elizabethkingia)、菌保所杆菌属(Emticicia)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、嗜氢菌属(Hydrogenophaga)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)及隶属于下列分类水平的未知属：Saprospiraceae、[Pedosphaerales]、OPB56、258ds10、[Cerasicoccaceae]、Pelagibacteraceae; 而相对丰度＜1.00%的非优势菌属数量众多, 在各水样中的分布差异较大, 其相对丰度介于0.10%~0.70%.
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图 11 水样中属水平细菌群落(非共有菌)结构及分布 Fig. 11 Bacterial communities and distribution(non-common bacteria) of the samples at the genus level |
进一步综合分析窖水各水样属水平的细菌群落分布特征可知, C、D组样品细菌群落分布较A、B组样品均匀, 多样性较高.
2.4 组间显著性差异及微生物群落标志物为进一步确定菌群的丰富度差异, 采用基于LEfSe的分析方法, 来确定窖水12个样品在4个分组水平上的差异微生物群落状况, 筛选关键的生物标记物(图 12).分类等级树展示了由从内圈到外圈依次排列的样本群落中从门到属的所有分类单元的等级关系, 节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度, 黄色节点代表未体现出显著的组间差异的分类单元, 而其它色(如绿色和红色)则表明这些分类单元体现出显著的组间差异, 且在该色所代表分组样本中丰度较高.
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图 12 基于分类等级树的组间差异分析 Fig. 12 Cladogram based LEfSe analyses of microbiomes in cellar water |
分析结果表明：A组样品中的酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉状菌(从门到属)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)、Adhaeribacter(黏结杆菌属)、军团菌(从目到属)等19个菌群, 丰富度较高; B组样品中的噬纤维菌(从纲到科)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、疣微菌(从门到科)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)、甲基球菌目(Methylococcales)、铁细菌属(Crenothrix)、节螺藻属(Arthrospira)、苯基杆菌科(Phenylobacterium)、腐败螺旋菌属(Saprospira)、苍黄杆菌属(Luteolibacter)等23个菌群丰富度较高; C组样品的装甲菌门(Armatimonadetes)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、红球菌属(Rhodococcus)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、盐地杆菌属(Salinibacterium)、全噬菌(从纲到科)、丰收神菌(从纲到属)、螺旋体属(Spirochaeta)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)、氧化硫单孢菌属(Sulfurimonas)、弓形菌属(Arcobacter)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)、共养菌属(Syntrophus)、脱硫杆菌(从目到属)、脱氯单孢菌属(Dechloromonas)、出芽单孢菌(从门到属)、梭菌(从纲到属)、鞘脂杆菌(从纲到属)密螺旋体属(Treponema)等58种菌群丰度较高; D组样品中的古字状菌属(Runella)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽殖球菌属(Blastococcus)、螺旋体(从门到科)、甲基嗜热菌属(Methylocaldum)、塔特洛克氏菌属(Tatlockia)、脱硝酸弯杆菌属(Denitratisoma)、嗜氢菌属(Hydrogenophaga)、嘉利翁氏菌(从目到属)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、红环菌目(Rhodocyclales)、红细菌属(Rhodobacter)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、腐败螺旋菌科(Saprospiraceae)、黄色土源菌属(Flavisolibacter)、放线菌(从门到目)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)等48个菌群丰度较高.
2.5 功能基因KEGG统计与分析通过KEGG对窖水12个样品基因序列进行微生物代谢功能分析(图 13). KO level 1层次上, 12个样品所有功能基因序列可分为7类, 其中, 新陈代谢功能模块中编码相应功能的基因呈现出在功能上的多样性和数量上的显著的优势性, 其次是遗传信息加工、环境信息加工、未分类的功能、细胞过程编码相应功能的基因丰度较高, 生物体系统和人类疾病相关基因编码相应功能的基因丰度较低.
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图 13 功能基因KEGG统计 Fig. 13 KEGG statistics of functional genes |
在KO level 2层次上, 新陈代谢功能模块中的氨基酸代谢、碳水化物代谢是基因组中最大的类群; 第二和第三大类群是能量代谢和脂类代谢、维生素等辅助因子代谢、核苷酸代谢、外源性化学物质的生物降解与代谢; 随后是萜类化合物与聚酮化合物的代谢、多聚糖的生物合成与代谢、次生代谢产物的生物合成、与酶相关的代谢、以及参与其他次生代谢产物合成的代谢.遗传信息加工功能模块中与遗传信息复制和修复机制相关的功能具有显著优势, 其次是与遗传信息翻译相关的功能, 与转录和折叠、分拣和降解相关的功能是该模块中的第三类群.环境信息加工模块中参与膜运转的功能有明显优势, 其次是参与信号传导的功能.细胞过程模块中占优势的为与细胞运动相关的功能, 其次是与运输和代谢、细胞生长和死亡相关的功能.
通过KEGG基因表达统计分析, 表明各样品编码相应功能的基因序列多样性与丰度, 无论是KO level 1层次上的7大类, 还是细分至KO level 2层次上的41类都具有显著差异.这种差异, 在编码新陈代谢的基因序列模块上尤为突出, 表明在窖水中存在大量的具有相对特定生态功能的微生物, 并进行着诸多活跃的与新陈代谢相关活动.
3 讨论 3.1 窖水微生物群落复杂度分析多样性是衡量群落稳定性的一个重要尺度, 常用于反映群落结构的复杂程度和稳定性[17].
α多样性分析也称为生境内多样性, 是单个样本复杂度分析常用的方法.丰富度指数Chao和ACE可以估算群落中含OTU数目的指数, 在生态学中常用来估计物种的总数, 值越大代表物种总数越多[18].从这两个指数来看, 5、7、8、10、11号水样微生物多样性较高, 1、2号微生物多样性较低, 这与OTU聚类与物种分类信息、OTU稀释曲线、Rank-Abundance曲线所得到结果基本一致; 多样性指数Shannon和Simpson指数反映了群落种类多样性及均匀性, 指数越大表明群落的多样性越高、分布越均匀[19].分析可知, C、D组样品细菌群落分布较A、B组样品均匀, 多样性高.此外, Simpson指数还可反映优势物种生物量占群落生物量的比重, 指数越大表明优势菌群生物量占总生物量的比重越大, 反之则优势菌群生物量占总生物量比重越小[20].考察各样品在门水平上优势菌数与优势菌所占比重(≥1.00%), 分别为1号(6, 98.7%)、2号(9, 98.1%)、3号(7, 98.4%)、4号(8, 87.7%)、5号(8, 98.9%)、6号(7, 98.7%)、7号(5, 96.6%)、8号(5, 95.1%)、9号(5, 98.2%)、10号(5, 97.2%)、11号(5, 97.1%)、12号(6, 98.0%), 这与各样品间Simpson指数、Rank-Abundance曲线斜率的差别可得到印证.而OTU韦恩图分析很好地反映了组间与组内共有以及特有的OTU数目, 展示了样品间的相似性及差异性.
β多样性也称为生境间多样性, 可进行样本间复杂度的比较分析, 反映了不同样本在物种多样性方面存在的差异大小.由于微生物极其多样, 不同微生物之间具有特定的系统发育关系, 在比较不同群落样本间的差异时, 需要考虑群落成员之间是否存在系统发育亲缘关系. Unifrac距离通过比较群落各自独有OTU之间系统发育关系的远近, 从而更全面反映群落样本之间的相似度[21]. Unifrac距离有Unweighted和weighted之分, 前者仅仅考虑OTU在样本中存在与否, 而不考虑丰富度高低[21]; 后者则兼顾群落成员之间的系统发育关系以及它们在各样本中的丰度高低[22].因此, Unweighted Unifrac距离侧重于描述由群落成员的截然不同导致的样本差异, weighted Unifrac距离则侧重于描述群落成员丰度梯度的改变导致的样本差异.通过Unifrac非加权及Unifrac加权主坐标分析, 组内各样品分布较集中, 组间B组和C组区分度不太理想, 4、6、9号样品存在交叠现象外, 其余样品之间均得到较好的区分, 说明各样品在组间与组内的主成分有显著差异, 这在窖水微生物群落组成分析中得到了较好的反映.
3.2 窖水微生物群落结构及功能多样性差异与水质因子相关性分析水体中微生物是水域生态系统的重要组成部分, 按照meta-群落假说, 内部环境因子(由物种遗传基因信息决定的生物间相互作用及物种的随机动态等物种本身之间的影响因子)和外部环境因子(环境温度、主要污染物浓度等外在因素)是影响细菌群落组成的两个因子[23, 24].借助于相关研究者基于纯培养菌株的生理学及基因组学研究, 对窖水样品的30种优势功能菌群的生态功能进行统计分析表明, 绝大多数优势菌群具备脱氮、除磷、降解有机物的相对特定生态功能, 其中15种是具有脱氮、除磷功能的异养硝化-好氧反硝化菌群[25].各样品KEGG统计分析中, 编码不同新陈代谢功能的基因序列模块的多样性与丰度差异, 是窖水各样品中这些具备相应特定生态功能的菌群分布特征在基因层面上的阐释.这诸多具有特定功能的菌群, 根据微生物群落结构和环境因子的RDA分析(图 14), 可聚类为3簇(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)：第Ⅱ簇内的菌群主要与反映窖水有机物含量的指标UV254、高锰酸盐指数、BOD5及浊度之间呈显著正相关关系; 第Ⅲ簇内的菌群主要与反映窖水氮、磷水平的指标TN、NO2--N、NO3--N 、TP、NH4+-N显著正相关; 而第Ⅰ簇内的菌群主要与pH、TN、NO2--N、NO3--N 、TP、NH4+-N、BOD5、温度、浊度呈负相关; 第Ⅱ、Ⅲ簇内的菌属之间呈正相关关系, 而第Ⅰ簇内的菌属与第Ⅱ、Ⅲ簇内的菌属之间呈负相关关系.窖水各样品微生物群落及功能多样性差异正是内部环境因子和外部环境因子共同作用的结果.
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图 14 微生物群落结构和环境因子的RDA分析 Fig. 14 RDA analysis of environmental factors and microbial community structure |
虽然相关的研究表明细菌及真菌在近地面大气中普遍存在, 微生物的浓度、丰度及多样性因时间和地理位置的不同而存在时空差异[26~30], 由于4组样品取自典型集雨人饮地区, 同一个自然村的4户农村庭院内的水窖, 雨水集流入窖过程对初期10~15 min雨水进行了弃流, 诸多集雨水源地优选研究成果同时表明[1, 5, 31, 32], 经过0~15 min的初期降水, 雨水中的各种污染物浓度譬如SS、高锰酸盐指数、BOD5、NH4+-N、TN、TP及细菌总数与总大肠菌群数变化都趋于稳定, 可忽略由于降水洗淋大气所造成的窖水微生物类群差异, 造成4组样品微生物群落组间显著性差异的主要为农村庭院集流面环境卫生条件、集流面材质、水窖类型等因素.此外, Shannon多样性指数作为一种生物监测指标, 常用来反应水体受污染的状况, 其值越高多样性也越高, 稳定性越好, 水质越好, 其值大于3为轻或无污染, 2~3为β-中污染, 1~2为α-中污染, 0~1为重污染[33, 34].各样品Shannon多样性指数(表 2)表明, C、D组明显高于A、B组.据此分析, 可认为与其他模式相比, 混凝土集流面与混凝土水窖组合模式用于收集和贮存雨水, 窖水水质更好、更安全.
4 结论(1) 应用16S rRNA基因-Illumina MiSeq高通量测序技术, 对不同类型的集雨水源地水体中微生物群落结构与功能基因特征进行了研究, 表明不同类型的集雨水源地水体中微生物群落结构与功能存在显著的差异, 造成这种差异的主要因素是窖水内部环境因子、外部环境因子等的异质性.
(2) 研究认为4种以农户庭院为组织单元的、不同类型的集流面和水窖组合模式中, 混凝土集流面与混凝土水窖组合模式用于收集和贮存雨水, 较其他3种模式而言, 窖水水质更好、更安全.
(3) 通过改善农村庭院集流面环境卫生条件、积极开展集流面混凝土硬化、改造旧有土质集雨水窖为混凝土水窖、协调并优化集流面与水窖建设位置等可有效提高窖水水质, 改善窖水人饮安全现状.
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