2017, Vol. 38
2. 北京城市排水集团有限责任公司科技研发中心, 北京 100124
, WANG Shi-jie1 , FAN Xiao-yan1 , PAN Kai-ling1 , ZHANG Li-fang1 , ZHANG Shu-jun2 , GAO Yong-qing2 , ZHANG Shuai2
2. Research and Development Center of Beijing Drainage Group Co., Ltd., Beijing 100124, China
颗粒污泥相较于传统的絮状活性污泥, 具有生物量高、密度大等特点, 在生物反应器内可维持更高的微生物浓度与更短的沉淀时间[1].颗粒污泥工艺首先应用于厌氧系统中, 如上流式厌氧污泥床反应器(up-flow anaerobic sludge bed, UASB)[2].之后, 好氧颗粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)工艺也在研究中被提出[3], 并得到广泛应用, 例如荷兰代尔伏特理工大学与DHV公司推出Nereda®工艺, 目前, 全球已有30多座运行或在建污水厂使用了该工艺.
深度脱氮除磷一直是污水处理工艺的研究重点, 由于AGS的结构特点造成的溶解氧传递限制, 可以在颗粒内部形成缺氧、厌氧区, 为反硝化菌及聚磷菌提供了良好条件, 有利于在单污泥系统中实现同步脱氮除磷(simultaneous nitrogen and phosphorus removal, SNPR)[4].目前已有许多研究利用AGS实现SNPR, 例如Cassidy等[5]利用屠宰废水培养出具有SNPR效果的AGS, 高景峰等[6]对AGS如何实现SNPR及其反应机制进行了研究.与此同时, 分子生物学方法也被运用于相关研究中, 例如荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)[6]、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)[7]以及末端限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism, TRFLP)[8].这些方法可以用来研究AGS培养过程中微生物的群落变化, 但其存在着PCR差异和通量低等限制因素, 对于研究结果有一定的限制性.高通量测序作为新兴的第二代测序技术, 具有通量高、周期短、高自动化等特点, 其在环境微生物研究领域的应用逐渐兴起[9, 10].同时, 高通量测序技术也开始运用于AGS中微生物的研究, 例如Lv等[11]利用其对AGS培养过程中微生物群落变化进行了研究.但是, 利用高通量测序技术对SNPR功能的AGS培养过程中微生物群落变化的研究鲜见报道.
因此, 本研究使用生活污水培养具有SNPR功能的AGS, 研究了AGS培养过程中活性污泥胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)的组分变化, 并利用Illumina MiSeq高通量测序和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)对AGS培养过程中细菌群落以及硝化与除磷微生物丰度的变化进行了研究, 以期为AGS的颗粒化机理提供理论支持.
1 材料与方法 1.1 接种污泥与实验用水实验所用污泥取自北京市某再生水厂曝气池, 混合液污泥浓度(mixed liquid suspended solids, MLSS)为3 600 mg·L-1.实验用水为生活污水, 水质指标如表 1所示, 由于所用生活污水COD浓度较低, 因此混合投加乙酸钠与丙酸钠作为碳源, 反应器进水COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TP平均浓度分别为300、52.4、0.1、1.2和7.8 mg·L-1.
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表 1 污水水质/mg·L-1 Table 1 Wastewater characteristics/mg·L-1 |
1.2 实验装置与运行条件
实验所用SBR反应器如图 1所示, 反应器采用有机玻璃制成, 高150 cm, 直径40 cm, 总容积188 L, 有效容积150 L, 设定排水比为1/2.采用空气压缩机供气, 用转子流量计控制曝气量.反应器内设置有加热控温装置, 使运行温度维持在25℃左右.反应器运行分为进水(15 min)、厌氧搅拌(120 min)、曝气(150 min)、沉淀(10~5 min)、排水(5 min)和闲置这6个阶段, 采用时控开关控制各阶段运行时间.
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1.时控开关; 2.外加碳源水箱; 3.原水箱; 4.外加碳源泵; 5.进水泵; 6.空气压缩机; 7.止回阀; 8.气体流量计; 9.液位计; 10.SBR反应器; 11.曝气盘; 12.加热装置; 13.电动搅拌器; 14.排水阀 图 1 SBR反应系统示意 Fig. 1 Schematic diagram of the SBR reactor |
COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、PO43--P、MLSS、SV等常规分析项目均采用国家标准方法测定[12]; DO、pH采用WTW Multi 3400(WTW Laborprodukte, Germany)便携分析仪测定; 采用Olympus BX51/52(OLYMPUS, Japan)光学显微镜观察污泥外形; AGS表面微观形态采用Hitachi S-3400N(HITACHI, Japan)扫描电子显微镜(scanning electronic microscopy, SEM)表征; 采用Microtrac S3500(Microtrac Inc, USA)激光粒度分析仪测定污泥样品的粒径分布.采用阳离子树脂交换法[13]提取活性污泥样品中的EPS; 胞外蛋白质采用考马斯亮蓝法[14]测定, 使用牛血清蛋白配置标准溶液; 胞外多糖采用苯酚-硫酸法[15]测定, 使用葡萄糖配置标准溶液.
1.4 实验样品本实验共分为两个阶段, 第一阶段为AGS的快速培养, 用时40 d, 取种泥(R0)、初步形成AGS(第20 d, R1) 以及阶段末期完全形成AGS(第40 d, R2) 作为样品点.第二阶段用时60 d, 为SNPR培养阶段, 选取第50 d(R3)、第65 d(R4)、第75 d(R5) 和第85 d(R6) 这些粒径明显增长与处理效果增强的点, 以及第100 d时形成SNPR功能的点, 取污泥样品, 真空冻干后于-20℃储存, 用于后续实验.
1.5 微生物多样性分析 1.5.1 DNA提取与Illumina MiSeq高通量测序分析样品经冻干碾碎后, 使用Fast DNA®Spin kit for soil(Qiagen, CA, USA)DNA提取试剂盒提取样品DNA, 并采用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)测定提取DNA浓度和质量. DNA样品送往美吉生物(上海)医药科技有限公司进行高通量测序, 测序平台为Illumina MiSeq PE300(Illumina, USA), 测序区域为细菌16S rRNA V3-V4区, 所用引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).测序产生的原始数据经筛选去除低质量序列以及嵌合体后, 得到有效序列, 并对各样品序列进行均一化处理, 以保证在相同的测序深度下进行分析比较.使用QIIME[16]进行后续分析, 利用Usearch算法划分操作分类单元(OTUs), 相似度设置为97%.采用Silva数据库对OTUs进行物种注释, 之后对所得细菌分类信息进行多样性与群落组成分析.
1.5.2 PCR与qPCRDNA样品经过PCR扩增、克隆、摇菌后, 从携带有目的菌基因片段的菌液中提取质粒作为qPCR的标准品.对提取的质粒进行10倍梯度稀释制作成一系列标准样品.标准品和未知样品, 均做3个平行, 并设置阴性对照(无菌水作为模板).分别采用特异性引物GenAOAF(5′-ATAGAGCCTC AAGTAGGAAAGTTCTA-3′)和GenAOAR(5′-CCAAGCGGCCATCCAGCTGTATGTCC-3′)[17]对氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)的amoA基因进行定量; 特异性引物CTO189f[该引物是由CTO189fA/B(5′-GGAGRAAAGCAGGGGATCG-3′)与CTO189fC(5′-GGAGGAAAGTAGGGGATCG-3′)以2:1的比例混合而成]和CTO654r(5′-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3′)[18]对氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)的16S rRNA基因进行定量; 特异性引物Nsr 1113f(5′-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3′)和Nsr 1264r(5′-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3′)[19]对亚硝酸盐氧化菌Nitrospira(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)的16S rRNA基因进行定量; 以及特异性引物518f(5′-CCAGCAGCCGCGGTAAT-3′)和PAOs 846r(5′-GTTAGCTACGGCACTAAAAGG-3′)[20]对活性污泥中优势聚磷菌Candidatus accumulibacter (polyphosphate accumulating organisms, PAOs)的16S rRNA基因进行定量.定量PCR反应体系为20 μL, 其组成为：7.2 μL无菌水、10 μL GoTaq® qPCR Master Mix、0.4 μL上、下游引物和2 μL DNA模板、质粒标准品或无菌水.使用仪器Stratagene MX3005p(Agilent Technologies, USA)运行反应体系.
2 结果与讨论 2.1 AGS的培养本实验共分为两个阶段, 第一阶段通过逐渐缩短沉淀时间培养AGS, 第二阶段通过改变运行条件实现SNPR.在第一阶, 根据反应器内污泥沉淀性能及MLSS的变化, 将沉淀时间由最初的9 min逐步缩减至6 min.期间, 活性污泥逐渐团聚形成颗粒, 污泥粒径(中位径, D50) 由R0的124.7 μm[图 2(a)]增长到R2的279.4 μm[图 2(b)], 已基本形成AGS.在第二阶段, 根据反应器出水效果, 调整各阶段运行时间, 同时将沉淀时间缩短并维持在5 min, AGS粒径出现持续增长, 由R4的346.3 μm[图 2(c)]增长到了R5的567.5 μm[图 2(d)], 到R7时达到了781.8 μm.如图 2(e)所示, 成熟AGS呈棕黄色, 均匀饱满. SEM照片如图 2(f)所示, AGS外形规则, 轮廓清晰, 进一步放大后可观察到[图 2(g)和2(h)]表面存在明显的凸起与凹陷, 并且分布有大量的杆菌与球菌. 表 2为各取样点的出水水质和污染物去除率, 系统在运行85 d后具有了较好的SNPR效果, 出水NH4+-N＜1.0 mg·L-1、TP＜0.5 mg·L-1, TN和TP去除率分别达到了76.3%和95.7%, 出水水质符合GB 18918-2002一级标准中A标准.
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(a)R0、(b)R2、(c)R4和(d)R5的显微镜照片; (e)R7的相机照片; (f)~(h)R7的SEM照片 图 2 AGS培养过程中活性污泥的外观形态 Fig. 2 Morphoglogy of activated sludge during the formation of AGS |
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表 2 出水水质与去除率 Table 2 Effluent water quality and removal efficiency |
2.2 AGS培养过程中EPS的变化
EPS是AGS中主要的组成部分, 其可以促进微生物的团聚, 对于AGS的形成具有重要作用[21].提取各样品的EPS, 研究其在培养的第一及第二阶段的浓度变化, 结果如图 3所示.在AGS培养的第一阶段, 活性污泥由絮状凝聚为颗粒, EPS含量也随之增加, 其中多糖含量增加明显, 由R0的15.46 mg·g-1增加到R2中的64.62 mg·g-1.在第二阶段, 虽然AGS粒度继续增长, 但EPS中多糖含量增长减缓, 成熟AGS(R7) 中浓度为80.83 mg·g-1.蛋白质含量在AGS形成初期由R0的12.42 mg·g-1增加到R1的27.72 mg·g-1, AGS形成后, 其含量在13.81~26.11 mg·g-1之间浮动.可以看出, 样品EPS中多糖含量要远高于蛋白质, 并且其在AGS形成阶段的增幅也要比蛋白质的明显, 因此, EPS中多糖含量的增加可能会促进AGS的形成, 而蛋白质对AGS的形成影响较小.
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图 3 AGS培养过程中EPS变化 Fig. 3 Variations of EPS during the formation of AGS |
AGS培养过程中硝化微生物和除磷微生物的qPCR定量结果如图 4所示.从图 4(a)中可以看出, 在第一阶段(R0~R2), AOB的16S rRNA基因丰度保持不变, 范围(以dry sludge计, 下同)在3.35×109~9.00×109 copies·g-1, 第二阶段(R3~R7), 随着粒径增长, AOB丰度发生小幅下降, R7中丰度为4.75×108 copies·g-1. AOA的amoA基因丰度在整个培养过程中大幅下降[图 4(b)], 由R0中的2.18×106 copies·g-1减少至R7中的7.54×103 copies·g-1, 说明在AGS培养过程中, 逐步缩减沉淀时间造成的洗脱作用, 可能不利于AOA这种世代时间较长的微生物的生长与富集, 对于AOB来说这种影响可能较小.因此, 在SNPR系统中, AOB可能是主要的氨氧化作用执行者. NOB的16S rRNA基因丰度在培养过程中无明显变化[图 4(c)], 范围在2.09×109~1.12×1010 copies·g-1, 说明污泥颗粒化过程对其影响较小. PAOs的16S rRNA基因丰度在第一阶段由R0的3.53×109 copies·g-1增长到R2的1.10×1011 copies·g-1, 在第二阶段AGS形成后其丰度保持稳定, R7中的丰度为1.83×1010 copies·g-1, 说明AGS的形成有利于PAOs的生长.
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图 4 AOB、AOA、NOB和PAOs的定量结果 Fig. 4 Abundance of AOB, AOA, NOB and PAOs |
8个样品经高通量测序后共产生496 597条原始序列, 经过去除嵌合体以及均一化等处理后, 各样品有效序列数均为51 226条.通过与数据库的比对划分, 共得到1 614个OTUs, 各样品OTUs数分别为1 197(R0)、1 324(R1)、1 293(R2)、1 317(R3)、1 259(R4)、1 208(R5)、1 111(R6) 和1 045(R7). 图 5(a)为各样品的稀缺性曲线, 其中各条曲线都趋于平坦, 说明测序深度可以覆盖样品中绝大多数细菌信息.从各样品OTUs数可以看出, 在AGS培养的第一阶段(R0~R2), 细菌种类产生了小幅上升, 之后的第二阶段(R3~R7), 随着AGS粒径的增长, 并产生SNPR效果, 细菌种类又产生了下降.
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(a)各样品点细菌稀缺性曲线; (b)特定样品点OTUs的Venn图 图 5 细菌稀缺性曲线与Venn图 Fig. 5 Rarefaction curves and Venn diagrams of the bacterial communities |
选取R0和第一阶段末期培养出AGS的点R2, 第二阶段污泥粒径明显增长的点R4和R6, 以及具有SNPR功能的点R7做Venn图, 结果如图 5(b)所示. 5个样品共有OTUs占总数的40.95%, R0与样品R2、R4、R6和R7所共有的OTUs逐渐减少, 分别为64.44%、59.11%、51.86%和49.00%.说明在污泥颗粒化过程中, 细菌群落组成产生了明显的变化, 但也有部分细菌得到了保留.从各样品独有的OTUs来看, R0(4.46%)远多于其它样品R2(1.43%)、R4(1.43%)、R6(0.56%)和R7(0.43%), 但占总OTUs的比例较少.
各样品的α多样性指数如表 2所示.可以看出, Chao1指数在培养初期第一阶段发生小幅上升, 由R0的1 398增加到R2的1 408, 之后第二阶段出现下降, 最终降为R7的1 218.香农指数也表现出同样的规律, 由R0的5.69上升到R1的5.85之后逐渐下降到R7的4.34, 表明在AGS形成初期, 活性污泥中细菌的丰富度的和多样性都产生了增长, 而在之后颗粒污泥粒径增长和SNPR形成阶段, 丰富度和多样性反而产生了下降.
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表 2 细菌群落α多样性 Table 2 The α-diversity indices of bacterial community |
8个样品点OTUs组成的PCA分析如图 6所示.主成分1(PC1) 与主成分2(PC2) 是造成样品差异的两个最大差异特征, 贡献率分别为86.69%与6.00%.从图 6中可看出, R0与R1相距甚远, 可能是由于反应器在启动后, 随着沉淀时间的减少, 某些细菌在短时间内被排出, 而易絮凝、团聚的细菌得到了保留, 导致活性污泥中细菌群落组成产生了明显变化, 此时反应器内污泥也由最初的絮状变为小颗粒, 从而造成图 6中R0~R1的明显变化.之后, 随着AGS的形成, 以及运行条件的稳定, 其它几个样品点间的差距在逐渐的缩小, 例如R2与R3, 以及R4~R7.从图 6中可看出, R4~R7这4个样品点聚集在一起, 而R4~R7之间AGS的粒径仍然存在较大增长, 说明相较于AGS形成过程, AGS在粒径增长过程中细菌群落组成变化较小.
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图 6 基于样品OTUs的PCA分析排序 Fig. 6 Ordination plots generated by PCA analysis based on the OTUs |
在AGS培养过程中, 某些微生物种属持续存在且相对丰度较高, 其可能为系统的核心微生物[22].而某些微生物种属存在时间较短且相对丰度较低, 也可能会对系统产生一定影响.通过分析不同OTUs在8个样品点的出现频率, 将1 614个OTUs划分为3个类型, 分别为瞬时型(只出现在1个样品中, 即出现频率为12.5%)、间歇型(在2~6个样品中均出现, 即出现频率为25.0%~75.0%)以及持久型(在7或8个样品中均出现, 即出现频率为87.5%、100.0%).不同出现频率下的OTUs数如图 7(a)所示, 随着出现频率升高, OTUs数也随之增多. 图 7(b)为3种类型的OTUs数分布, 持久型所占百分比为53.1%, 略高于间歇型的43.4%, 而瞬时型所占百分比较小, 仅为3.5%.不同类型OTUs对应的序列数百分比如图 7(c)所示, 持久型OTUs对应的序列占总序列数的92.7%, 远高于间歇型的7.1%与瞬时型的0.2%, 说明在利用生活污水培养AGS时, 持久型OTUs所对应的微生物种属可能与AGS及SNPR功能形成有关.间歇型与瞬时型的OTUs数总和虽然占到了46.9%, 但对应的序列数占比较低(7.3%), 说明其对应的微生物种属可能与污泥颗粒化及SNPR的关系较小.
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图 7 样品OTUs组成分析 Fig. 7 Composition analysis of the sample OTUs |
针对以上结果, 对持久型OTUs对应的细菌群落组成, 以及在各个样品中所占的相对丰度进行进一步分析, 结果如图 8所示.属于持久型OTUs的细菌在各样品中的相对丰度为78.04%~90.08%, 占比较高.持久性OTUs属于29个门, 其中, 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)为各样品中的优势门.前人研究也发现变形菌门为活性污泥中最主要的细菌门[9].从图中可以看出在AGS培养过程中, 变形菌门的相对丰度产生了较大增长, 由R0的31.07%增长为R7中的53.67%, 拟杆菌门和绿弯菌门的相对丰度变化较小, 在各样中为6.70%~16.50%和7.84%~13.36%.而其它一些相对丰度较小的门, 例如放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes), 在培养过程中均出现了下降, 放线菌门与污泥的丝状膨胀相关[23], 在AGS培养的第一阶段, 其相对丰度由R0的8.03%下降到R2的3.00%, 说明减少沉淀时间对其产生了较大影响.
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图 8 持久型OTUs在各样品中的细菌群落组成分析 Fig. 8 Bacterial communities of persistent OTUs for the different samples |
在属水平, 挑选各样品中相对丰度大于1%的属, 对持久型OTUs对应的细菌进行分析, 结果如图 8(b)所示.从中可看出, Candidatus competibacter、Candidatus accumulibacter、Defluviicoccus、Anaerolineaceae以及MVP-88属在R0中相对丰度较低, 分别为0.11%、0.27%、0.21%、0.18%以及0.10%, 而在第一阶段末期, 其相对丰度发生了明显增加, 在R2中的相对丰度为8.35%、7.27%、2.55%、1.88%以及2.32%.在第二阶段, C. competibacter、Anaerolineaceae和MVP-88属的相对丰度持续增长, C. competibacter属增长尤为明显, 在R7中达到了35.33%, 其它两个属分别为5.50%和5.46%. Chloroflexi、四球虫属(Tetrasphaera)、Haliangium、Romboutsia、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)以及硝化螺旋菌属(Nitrospira), 在各样品中相对丰度均较低, 而后两者属于活性污泥中典型的AOB与NOB.
Lemaire等[24]的研究发现, 采用厌氧/好氧交替运行方式培养具有脱氮除磷功能的AGS时, AGS中富集了大量的C. competibacter. Cai等[25]研究发现, 在以丙酸盐作为碳源时, 也有利于C. competibacter的生长富集. C. competibacter作为一种聚糖菌, 可以在厌氧条件下吸收乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸, 合成聚-β-羟基烷酸, 但在好氧条件下却不吸收磷也不合成聚磷, 对除磷没有贡献, 因此与PAOs存在竞争关系[26]. C. accumulibacter作为实际污水处理系统中已知的优势聚磷菌, 在本研究中, 其相对丰度在培养过程中也产生较明显增加, 并且C. competibacter在AGS中的富集并未影响到系统的除磷能力.
Seviour等[27]的研究发现, AGS中富集的C. competibacter可能会分泌某种胶状胞外多糖, 使其EPS具有胶状特性并有别于普通絮状污泥中的EPS. Lin等[28]的研究结果也表明, 这种胶状的胞外多糖有助于微生物团聚形成AGS. De Kreuk等[29]的研究发现, C. competibacter以及C. accumulibacter等增长缓慢的微生物, 有利于形成紧实稳定的AGS.本文在培养具有SNPR的AGS时, 采用厌氧/好氧交替的运行方式, 并且使用丙酸钠与乙酸钠作为碳源, 使得C. competibacter在培养过程中快速富集, 其可能分泌大量的胶状胞外多糖, 对样品EPS测定结果也表明, 在第一阶段, EPS中多糖的含量产生明显增加(图 3), 这些胶状多糖可能形成了更具黏性的EPS, 将絮状活性污泥粘连成较大的菌胶团, 最终形成AGS, 并且在第二阶段, 促进了AGS粒径增加且变得更加紧实.
Meyer等[30]利用透射光成像对C. competibacter富集的AGS研究发现, C. competibacter集中分布于AGS表层, 限制了氧和底物向核心部位的扩散, 使得AGS内部活性微生物较少.本次研究中, 成熟AGS中富集的C. competibacter可能分布于颗粒表层, 其分泌的大量黏性EPS也可能会阻碍底物与氧的传递, 一方面会在AGS内部形成缺/厌氧区, 有利于反硝化菌及聚磷菌在好氧条件下SNPR.另一方面, 可能会使AGS中微生物与底物和氧的接触不如种泥时的絮状污泥充分, 造成其在形成颗粒后微生物多样性产生降低.
3 结论(1) 利用生活污水, 经100 d培养出具有SNPR功能的AGS, 其EPS中多糖含量在培养初期(前40 d)增幅明显, 之后趋于稳定, 蛋白质的含量与增幅均低于多糖.
(2) AOB在AGS培养过程中丰度略有降低; AOA的丰度大幅下降; NOB在培养过程中丰度维持稳定; PAOs在AGS形成初期丰度上升, 之后趋于稳定.
(3) 在AGS培养过程中, 细菌多样性先升高后降低, 细菌群落组成变化明显.变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)为AGS培养过程中的优势门. C. competibacter属在AGS培养过程中大量富集, 其可能促进了絮状污泥团聚成AGS.
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