2017, Vol. 38
2. 环境生物与控制教育部重点实验室(湖南大学), 长沙 410082;
3. 湖南城市学院市政与测绘工程学院, 益阳 413000;
4. 湖南省林业科学院生物环境工程研究所, 长沙 410004
, WANG Yuan-nan1,2 , LI Yuan-ping3 , LI Hui4 , CHEN Yan-rong1,2 , WU Yan-xin1,2 , GOU Yu1,2 , ZHU Fu-zao1,2 , ZHANG Dao-li1,2 , LIU Yao1,2 , ZENG Guang-ming1,2
2. Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control(Hunan University), Changsha 410082, China;
3. College of Municipal and Mapping Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China;
4. Institute of Biological and Environmental Engineering, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China
随着经济的快速发展, 城市化和工业化进程的深入, 重金属正在通过一些工矿企业排放的“三废”、农药的施用及矿物燃料的燃烧等途径进入土壤[1], 使得土壤受到重金属严重污染.重金属污染尤其是土壤重金属污染已成为危害人类生存和发展及全球环境的主要问题之一, 其修复研究已成为国内外研究的重点和热点[2].土壤环境中的重金属污染是一个不可逆的过程, 进入土壤的重金属不能被微生物降解, 积累到一定程度就会对土壤-植物系统产生毒害, 导致土壤质量退化[3]、作物产量和品质降低[4, 5], 污染地下水[6], 不利于生物体的正常代谢[7].镉是常见的重金属污染物之一, 浓度较低时即有较大毒性, 与其它重金属相比具有较强的化学活性, 更易被植物吸收, 能通过食物链富集于人体内, 危害人体健康[8, 9].
一般来说, 重金属污染土壤修复原理主要有两种思路：一是改变重金属在土壤中的存在形态, 降低其生物有效性和迁移性; 二是将重金属从土壤中去除, 使其浓度逐渐减少至无害的程度[10].其修复方法主要是物理化学修复和生物修复.物理化学修复主要包括土壤淋滤[11]、电动修复[12]和化学固化[13, 14]等, 这些方法虽然在一定程度上减少了重金属对土壤及生态环境的危害, 但是能耗大、费用高和存在二次污染等问题限制了它们的广泛应用[15].生物修复方法主要有植物修复[16, 17], 动物修复[18]和微生物修复[19]等技术.微生物修复技术中常用的微生物有细菌[20]、藻类[21]和真菌[22]三大类, 其中真菌对重金属耐性最强.烟曲霉是一种大型丝状真菌, 对重金属具有较大的耐受性和吸附容积[23], 其胞外聚合物对水体中重金属吸附[24, 25]和产酸对土壤重金属淋滤[26]的研究已有一些报道, 但是将其直接用于土壤重金属的去除还未见报道.液态静置培养中烟曲霉依靠较长的菌丝从培养基内获取养分, 但菌落多浮于培养基表面, 容易直接挑取.如果添加营养液将Cd污染土壤制成半固态培养体系, 则有望在培养烟曲霉的同时实现从体系内吸附和富集重金属, 进而通过剥离菌落较易实现部分去除Cd, 从而达到利用真菌去除土壤中重金属目标, 不过利用这种思路进行土壤重金属污染修复的研究还鲜见报道.
本文拟选用1株具有高耐镉的烟曲霉, 通过添加营养液将Cd污染土壤制成半固态培养体系并用于烟曲霉的培养, 研究了半固态培养条件下烟曲霉对含不同Cd污染土样中Cd的去除效果, 通过测定烟曲霉胞外和胞内Cd的含量及土壤中剩余Cd的含量, 分析了烟曲霉对土壤中Cd的去除效率, 验证了烟曲霉去除土壤中重金属的可能性，同时还探讨了处理前后土样中Cd的形态变化, 以期为微生物去除土壤重金属污染提供了新的思路.
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种烟曲霉(Aspergillus fumigatus), 购于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC 3.7795).将菌种于土豆琼脂葡萄糖培养基30℃培养5 d, 刮取少量孢子于无菌水中充分振荡, 调节体积制备孢子浓度约为1.0×107 CFU·mL-1的菌悬液.
1.1.2 培养基土豆琼脂葡萄糖培养基(PDA)配方：新鲜土豆200 g, 葡萄糖20 g, 琼脂15 g, 蒸馏水1 000 mL, 自然pH.
马丁培养基：葡萄糖10 g, 蛋白胨5 g, KH2PO4·3H2O 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 0.1%孟加拉红溶液3.3 mL, 蒸馏水1 000 mL.
1.1.3 土样土样取自岳麓山(长沙), 剔除表面石子和树叶后于自然条件下风干, 然后再过40目尼龙筛备用.其基本理化性质为：pH 5.48, 有机质55.6 g·kg-1, 总镉含量0.07 mg·kg-1.配制不同含量硝酸镉, 取定量溶液加入土壤混匀, 污染土壤, 使得Cd含量为10、20和50 mg·kg-1(不包括土壤背景含量), 以下分别记为Cd(10)、Cd(20) 和Cd(50)[27], 将其置于塑料瓶内放置30天[28], 使其形态趋于稳定, 被污染后的Cd含量测定分别为10.50、20.35和50.26 mg·kg-1.
1.2 实验设置准确移取灭菌后的马丁培养基15 mL, 倒入9 cm灭菌平板中, 然后分别添加不同含量的含镉土样8.0 g, 混合均匀, 待其冷却后接种烟曲霉菌悬液, 每个浓度均设置供7次取样的平行样.置于37℃恒温培养箱中静置培养20 d, 分别于第0、3、5、8、11、14和20 d取样测定相关参数, 取样时挑取整个平板上所有菌体, 各项参数均测定3次取平均值.实验机理图详见图 1.
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图 1 实验机制 Fig. 1 Experimental mechanism |
菌体取样后, 将附着的土壤尽量剥除干净后置于60℃烘箱中干至恒重, 用分析天平称量其质量.
1.4 pH的测定取培养后的样品1 g, 然后加入2.5 mL超纯水, 于振荡器上振荡45 min, 离心后取上清液用精密pH计测定.
1.5 烟曲霉胞外吸附和胞内富集Cd含量的测定胞外吸附Cd含量采用Lima[29]的测定方法并作如下改动：取100 mg干菌体细胞悬浮于20 mL的ddH2O中, 于冰水中超声5 min, 然后在室温下以4 000 r·min-1离心10 min, 保存好上清液; 将余下菌体置于30 mL EDTA(pH 7.0, 20 mmol·L-1)中, 于振荡器上振荡30 min[30], 过滤, 保存滤液; 再用20 mL的ddH2O冲洗菌丝体, 并于4 000 r·min-1离心10 min, 保存上清液, 混合各步滤液, 过0.45μm滤膜, 滤液用原子吸收法(AAS)测定Cd浓度, 计算单位重量的菌体上吸附的Cd重量.胞内富集Cd含量采用Lima的测定方法[29]并作如下改动：50 mg处理后的菌丝体再悬浮于1 mL 100 mmol·L-1羟乙基哌嗪乙硫磺酸(pH 8.6), 1 mmol·L-1苯甲基硫酰氟和0.2%(体积比)Tween-20的混合提取液中, 于冰水中超声10 min后离心, 收集上清液, 并将剩余的细胞加入含25 mL的HNO3(2mol·L-1)中, 于100℃加热24 h[31], 离心后各步上清液合并后摇匀, 过0.45μm滤膜, 滤液用AAS法测定Cd浓度, 计算单位重量的菌体内富集的Cd重量.
1.6 重金属形态及总量的测定土壤重金属形态采用优化的BCR连续提取法[32].其中弱酸溶态、可还原态、可氧化态和残渣态分别记为步骤1、2、3和4.土壤重金属总量采用石墨消解法测定, 准确称量0.25 g样品于消解管中, 然后依次加入HNO3、HF和HClO4, 置于石墨消解仪上消解完全后定容至50 mL, 再用AAS法测定.
1.7 数据处理采用Microsoft Excel 2010进行数据处理, 实验中的数据均采用平均值±标准偏差.图形采用Origin 9.1进行处理.
2 结果与讨论 2.1 半固态培养过程中土壤Cd的去除 2.1.1 烟曲霉胞外吸附Cd含量的变化图 2为烟曲霉在20 d培养过程中对土壤Cd的去除变化.从中可见, 随着培养时间的增加, 菌体对土壤中Cd的吸附量先增加后减少.整个培养过程中, Cd(10)、Cd(20) 和Cd(50) 最大吸附质量分别为9.17、17.62和32.72 μg, 当Cd含量为50 mg·kg-1时, 其最大吸附量较低含量组[Cd(10) 和Cd(20)]提前3 d, 由此表明, 随着Cd含量和培养时间的增加, 菌体对体系中Cd的吸附效率下降, 去除效率降低.在培养的前期(前5 d), 吸附量较大, 这与环境中营养物质充足和菌体的快速生长有关, 第11 d后吸附量逐渐减少, 这个阶段烟曲霉生物量下降和部分菌体死亡消融是其原因(图 4).体系中Cd浓度越高, 烟曲霉吸附总质量越多, 这个阶段高含量Cd土样中烟曲霉尚能存活, 单位菌体吸附Cd的量较多.
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图 2 烟曲霉胞外吸附土壤中Cd质量 Fig. 2 Extracellular adsorption of Cd in soil by Aspergillus fumigatus |
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图 4 半固态培养过程中烟曲霉菌体干重的变化 Fig. 4 Changes in the dry weight of Aspergillus fumigatus in the semi-solid culture |
烟曲霉的胞内积累Cd质量如图 3所示, 随着培养时间的延长, 烟曲霉胞内富集Cd质量先增加后减少[Cd(10) 除外], 当体系中Cd含量为10 mg·kg-1时, 烟曲霉富集量在培养前后变化不大, 虽然后期菌体的干重有下降的趋势(图 4), 但该含量对菌体的副作用较小, 对菌体的富集作用产生不利影响有限[33]. Cd(20) 在前8 d被烟曲霉吸附逐渐增多, 最大富集Cd质量为24.05 μg, Cd(50) 组菌体富集Cd质量在整个过程中较Cd(20) 低.结果表明, 50 mg·kg-1的Cd对烟曲霉有一定的毒害作用, 相较10 mg·kg-1和20 mg·kg-1体系菌体的生物活性明显受到抑制(图 4), 使得菌体富集作用受到限制, 培养时间越长, 这种限制的影响越大.
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图 3 烟曲霉胞内富集土壤中Cd的质量 Fig. 3 Accumulation of Cd in soil by Aspergillus fumigatus |
图 4为烟曲霉在20 d培养过程中菌体干重的变化.从中可见, 菌体干重整体呈下降的变化趋势, 培养中期(5~11 d)下降迅速, 11 d后干重下降速度减缓.培养前期(前5 d), 不同组的变化趋势并不完全相同, 当含Cd为10 mg·kg-1时, 从第3~5 d, 菌体干重增加, 而后下降迅速; 而含量为20 mg·kg-1的含Cd土样中, 菌体干重略微上升, 下降时间比含量为Cd(10) 推迟3 d, 这可以认为是烟曲霉应对环境压力的一种响应[23]; 而含量为50 mg·kg-1的含镉土样中, 菌体干重持续下降, 最大下降幅度为64%, 这表明高含量的Cd明显抑制烟曲霉的活性, 这种抑制作用随着Cd含量和培养时间的增加而增加.
2.3 培养过程中pH值的变化pH对重金属的影响较大, 当pH较高时, 有利于重金属向化合态转化; 相反, pH较低时, 有利于重金属向游离态转化[34]. pH在整个培养过程的变化趋势见图 5.从中可知, pH一直呈上升趋势, 由5.48增加到6.59, 是体系内营养物质氨化作用所致[35].从图 2和图 3可以看出, 胞外吸附量和胞内富集量在3~8 d时最大, 此时体系pH值在5.6和6.0之间, 表明这是烟曲霉去除土样Cd的最佳pH.随着Cd浓度的增加, pH值逐渐下降, 这与烟曲霉应对环境压力分泌有机酸有关[36, 37].培养初期(前5 d), Cd(50) 的pH与Cd(20) 组接近, 上升较Cd(10) 缓慢, 这是烟曲霉高含量Cd作用下, 氨化减弱和产酸增强共同作用的结果.随着培养时间的延长(5 d后), pH逐渐增加, 烟曲霉在较高Cd环境下受到抑制, 菌体生长放缓, 富集Cd的量减少.
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图 5 培养过程中pH变化 Fig. 5 Variations in pH in the culture |
土壤重金属形态与多种因素有关, 不同形态的重金属活性和生物有效性不同.实验结果表明, 随着Cd含量增加, 可氧化态和残渣态所占质量分数逐渐上升(图 6), 这与烟曲霉在培养过中对弱酸溶态和可还原态中Cd的转化有关(表 1), 而培养前后有机结合态基本保持不变, 实验使用的外源性Cd加入到土壤后, 其主要是以生物有效性高的(弱酸溶态和可还原态)状态存在, 外源性Cd向可氧化态的转化不明显, 这与前人的研究结果一致[37].培养过程中由于烟曲霉的降解和代谢, 体系腐殖化程度增加, 整个过程中残渣态比率有小幅度上升[38].
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每组左列为处理前土样含 Cd 的形态,右列为处理后土样 Cd 的形态 图 6 培养前后土壤中Cd各形态百分含量 Fig. 6 Change in the different extraction fractions of Cd before and after the culture |
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表 1 处理前后Cd质量平衡及烟曲霉对Cd的去除率 Table 1 Quality balance and removal rate of Cd by Aspergillus fumigatus before and after the culture |
2.5 培养前后土样中Cd含量及总Cd去除率变化
表 1所示为培养前后土样Cd质量平衡及烟曲霉对土样Cd去除率的变化.可以看出, 烟曲霉对3个含量组中Cd的去除质量相近, 但是去除率却明显不同, 随着Cd浓度增加, 烟曲霉对土样中Cd的去除率逐渐减小, Cd(10) 组中去除率为31.33%, 而Cd(50) 组去除率仅为6.27%, 表明含Cd较低的土样明显有利于烟曲霉的去除, 可以看出这种方法更适合处理一些Cd浓度相对较低且对微生物毒害作用较小的污染土壤.通过对比土样中减少的Cd质量和菌体去除Cd的总质量可以看出, 二者基本持平, 表明土壤中Cd的降低途径主要是通过烟曲霉的吸附和富集来实现.可见这种通过半固态培养微生物来去除土壤中Cd的方法是可行的, 而且微生物生长速度快, 相对于植物吸附, 具有速度更快和操作更便捷的优势.
3 结论(1) 烟曲霉在加入外源Cd的环境下能正常生长, 随着Cd含量的增加, 菌体去除Cd的绝对重量呈现增加趋势, 但是去除率逐渐减少.其中当Cd含量为10 mg·kg-1时, 烟曲霉对土壤Cd的去除率可达31%, 初步表明通过半固态培养微生物来去除土壤中Cd的方法是可行的, 对于提升其效率和深入揭示其机制还需要进一步的研究.
(2) 烟曲霉在培养过程中生物量干重随着培养时间和Cd含量的增加呈下降的趋势, 并且最大下降幅度为64%, 最适pH为5.6~6.0.
(3) 烟曲霉去除半固态培养体系中Cd的形态主要为弱酸溶态和可还原态, 培养前后可氧化态基本保持不变.
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