2017, Vol. 38
2. 上海交通大学农业与生物学院, 农业部都市农业(南方)重点实验室, 上海 200240;
3. 上海市金山区山阳镇农业技术推广服务中心, 上海 201518;
4. 中新农业泰生示范农场, 上海 202161
, QI Zhi-ping2,4 , FENG Hai-wei2 , SUN Yu-jing3 , ZHI Yue-e2 , ZHANG Jin-zhong1
, ZHANG Dan2
2. Key Laboratory of Urban Agriculture (South), Ministry of Agriculture, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
3. Agro-technical Extension and Service Center of Shanyang Town, Jinshan District, Shanghai 201518, China;
4. Sino-Singapore Thaisheng Agricultural Demonstration Farm, Shanghai 202161, China
秸秆资源化利用对于治理农业污染、应对食品短缺和能源危机都有重要意义.据统计，我国每年产生作物秸秆约8亿t，其中水稻秸秆产量最高，占作物秸秆总量的31.6%[1].由于秸秆产量大、分布广，难以有效回收利用，直接燃烧或自然腐解会造成空气污染、传播病害和影响下一茬作物等问题.目前，秸秆的主要处理方法有物理法、化学法和生物法，物理法通过除去硅层，降低纤维素的结晶度，再用纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶进行处理，存在成本高、能耗大和操作复杂等问题[2]；化学法利用酸碱浸泡处理纤维素的成本高，容易造成二次污染；生物法具有无污染、成本低和操作简单等优点，环境中的微生物可以破坏秸秆木质素、纤维素和半纤维素之间的紧密结构[3]，秸秆堆肥还田能够减少化肥用量、改善土壤理化性质、提高作物产量，成为秸秆资源化利用的研究热点.在堆肥处理中添加微生物能加快纤维素分解，缩短发酵周期，提高堆肥产品质量[4].目前，应用于高温堆肥的微生物菌剂主要有单菌剂和复合菌剂，其中单菌剂主要为耐热能力较强的芽孢杆菌和放线菌等.然而，单一菌种的木质纤维素酶酶系不全，在高温环境活性降低，限制了单菌剂在堆肥中的应用效果.基于菌株间的互利共生效应，复合菌剂适应高温堆肥环境的能力强，应用效果显著好于接种单一菌株的堆肥处理[5]，能够杀死大量的寄生虫卵和病原微生物，大幅缩短堆肥时间，提高有机肥的产量和质量[6].
本研究利用实验室分离获得的15株高效纤维素降解菌，通过正交试验，筛选出可高效降解秸秆的复合菌剂JFB-1[7]，并与6株辅助菌结合，应用于水稻秸秆和芦笋秸秆堆肥.盆栽试验证实，施用秸秆堆肥可以显著提高土壤有机质和总氮含量，改善土壤酶活性和土壤微生物群落结构，提高普通白菜产量.
1 材料与方法 1.1 供试菌种所有供试菌种信息如表 1所示.18株菌为实验室分离并保藏，其中15株核心菌株(JSD-1~JSD-26)均分离自土壤，3株辅助菌(F-4~F-6)分离自有机肥，其余3株辅助菌(F-1~F-3)购自中国工业微生物菌种保藏中心.选用的辅助菌不与核心菌株产生拮抗作用，单独使用时几乎不能降解秸秆，与核心菌株共同作用可促进核心菌株对秸秆的降解能力[8].
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表 1 秸秆堆肥供试菌种 Table 1 Strains used in straw composting |
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20 g，自然pH.
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20 g，pH 7.0~7.2.
高氏Ⅰ号培养基：KNO3 1 g，NaCl 5 g，FeSO4 ·7H2O 0.01 g，MgSO4 ·7H2O 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，淀粉20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20 g，pH 7.2.
滤纸崩解培养基：牛肉膏1.5 g，蛋白胨1 g，CaCO3 2 g，蒸馏水1 000 mL.
1.3 优化菌种配方将2.5 g定量滤纸(杭州沃华滤纸有限公司，中国)剪成10 cm×1 cm的滤纸条，加入100 mL滤纸崩解培养基，按照正交试验，接种每种菌液0.5 mL，置于30℃恒温摇床，120 r ·min-1振荡培养3 d，观察各瓶中滤纸的崩解程度，筛选出可有效分解滤纸的复合菌剂.
1.4 秸秆腐熟复合菌剂的制备根据微生物种类，将真菌(JSD-15~JSD-26和F-1、F-3)接种于马铃薯葡萄糖培养基，细菌(JSD-3、JSD-8~JSD-12和F-6)接种于牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌(JSD-1、JSD-5、F-2和F-5)接种于高氏I号培养基，于30℃摇床150 r ·min-1振荡培养2 d，使菌液浓度在2×109 cfu ·mL-1以上.根据正交试验筛选出的菌剂组合，将不同菌液分别与麦麸载体混合，30℃发酵3 d，得到秸秆降解复合菌剂JFB-1.
1.5 秸秆堆肥实验供试水稻秸秆和芦笋秸秆均采自上海市崇明县中新农场，采用氧化还原滴定法分别测定秸秆中纤维素、半纤维素和木质素含量，K2Cr2O7滴定法秸秆有机质含量，凯氏定氮法测定秸秆的总氮含量，获得如表 2所示的结果.
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表 2 供试秸秆的理化特性 Table 2 Physicochemical characteristics of the tested straws |
将水稻秸秆粉碎至粒径为5~10 cm的小段，称取干重为200 kg的水稻秸秆小段，加入4.85 kg尿素，混匀，以调节初始C/N比为25 :1，设置接种秸秆重量1%的JFB-1复合菌剂和1%的辅助菌、1%的商业菌剂(EM菌剂，湖北启明生物工程有限公司)和1%的辅助菌、只接种1%的辅助菌3种处理，调节堆体初始含水量在65%左右，堆成2 m×2 m×2 m的堆体，进行好氧堆肥，供氧方式为翻堆和鼓风供氧相结合，每7~9 d翻堆1次[9]，共发酵26 d，分别得到接种JFB-1复合菌剂的水稻秸秆堆肥(RSJ)、接种商业菌剂的水稻秸秆堆肥(RSC)和只接种辅助菌的水稻秸秆对照堆肥(RS).
按照上述步骤，在干重为200 kg的芦笋秸秆中添加5.57 kg尿素，制得接种JFB-1复合菌剂的芦笋秸秆堆肥(ASJ)、接种商业菌剂的芦笋秸秆堆肥(ASC)和只接种辅助菌的芦笋秸秆对照堆肥(AS).
1.6 秸秆堆肥对土壤碳氮含量和酶活性的影响供试土壤为上海交通大学浦江绿谷试验基地的荒地土壤，一部分直接测定土壤理化性质，另一部分用于盆栽试验.盆栽试验所用盆钵上口直径为20 cm、下口直径为12 cm、高为18 cm，每盆装土2.5 kg，施肥处理如表 3所示，播种普通白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino)，间苗后每盆定苗5株，每个处理重复实验3次.
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表 3 盆栽试验设计 Table 3 Design of pot experiment |
定苗30 d后采集土壤和白菜样品，白菜样品在106℃杀青0.5 h，75℃烘干至恒重后称量.风干土壤样品，过0.25 mm筛，采用K2Cr2O7滴定法测定土壤有机质含量；浓H2SO4-H2 O2消煮，AA3流动注射分析仪(SEAL Analytical，德国)测定土壤总氮含量.新鲜土样用于测定土壤酶活性，采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[10]测定纤维素酶活性，以每克土壤催化羧甲基纤维素钠水解24 h时生成的葡萄糖质量(μg)表示；用靛酚比色法[11]测定脲酶活性，以每克土壤催化尿素水解24 h时生成的氨气质量(μg)表示.
1.7 BIOLOG测定土壤微生物种群多样性称取10 g新鲜土壤样品，加入90 mL质量分数为0.85%的灭菌生理盐水，在250 r ·min-1摇床中振荡30 min，静置5 min，转移10 mL土壤浸提液到另一90 mL灭菌生理盐水中，如此进行10倍梯度稀释直至稀释1 000倍.将BIOLOG-ECO板在25℃下预热30 min，每个孔接种150 μL上清液，用保鲜袋密封，置于25℃的微生物培养箱中，每隔12 h用酶标仪测定590 nm处吸光度.
BIOLOG-ECO微平板每孔的平均吸光值计算式为：
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(1) |
式中，Ai为上清液的吸光值；R为对照孔的吸光值；n取31，每个实验重复3次.
根据BIOLOG-ECO微平板孔中吸光值计算土壤微生物群落利用碳源多样性指数，即Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和McIntosh指数(U)，计算公式分别为：
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(2) |
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(3) |
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(4) |
式中，Pi为第i孔的相对吸光值(Ai-R)与整个微平板相对吸光值总和的比值；Ari为第i孔的相对吸光值.
1.8 数据处理与分析采用Excel 2016、SPSS 19.0软件处理和分析实验数据，用单因素方差分析法检验数据的显著性.
2 结果与讨论 2.1 秸秆腐熟复合菌剂的筛选利用15株高效降解纤维素核心菌，进行正交试验，考察菌剂组合对滤纸片的降解能力，筛选出合适的复合菌剂.正交试验设计及菌剂组合对滤纸的降解效果如表 4所示.从中可以看出，组合5和组合7对滤纸的分解效果最佳，3 d内即可将滤纸分解至糊状.堆肥是一个高温发酵过程，真菌类微生物的耐高温能力普遍较差[12]；另一方面，现有堆肥大多以畜禽粪便为原料，粪便中含有大量的抗生素[13]，以细菌和放线菌为优势菌种的堆肥可以有效降低抗生素污染的风险[14].因此，选择真菌比例较低的组合5(含菌株JSD-1、JSD-8、JSD-10、JSD-17、JSD-18、JSD-21和JSD-22)，并将该组合命名为JFB-1.
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表 4 筛选复合菌剂的正交试验(L16 215)1) Table 4 Orthogonal experimental design to screen composite inoculants |
2.2 秸秆堆肥过程中的温度变化
水稻秸秆堆肥过程中，每天14:00定时测定堆体温度，获得发酵周期的温度变化曲线(图 1).从图 1中可以看出，接种JFB-1菌剂的水稻秸秆堆体温度高于其它处理，最高温度达到68℃，高于接种商业菌剂的60℃和只接种辅助菌的59.9℃，且接种JFB-1菌剂的单个发酵周期约为7 d，少于接种商业菌剂的8 d和只接种辅助菌的9 d.
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图 1 水稻秸秆堆肥过程中的温度变化 Fig. 1 Variations of temperature during the composting process of rice straw |
类似地，测得芦笋秸秆堆肥过程中的温度变化曲线(图 2).从图 2中可以看出，接种JFB-1菌剂的堆体温度明显高于其它处理，最高温度达到72.5℃，在3个处理中最高.接种JFB-1菌剂的单个发酵周期为7 d，少于接种商业菌剂和只接辅助菌的8 d.因此，接种JFB-1菌剂进行秸秆堆肥，可以显著提高堆肥温度，缩短发酵周期.
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图 2 芦笋秸秆堆肥过程中的温度变化 Fig. 2 Variations of temperature during the composting process of asparagus straw |
温度是堆肥过程中的一项重要指标，较高的温度有利于堆肥过程的进行，并杀灭植物残体中的有害微生物.水稻秸秆和芦笋秸秆堆肥均能较快达到最高温度，接种JFB-1菌剂堆肥的最高温度分别达到68℃和72.5℃，且高温期(>50℃)分别为12 d和18 d，芦笋秸秆堆肥甚至高于猪粪和玉米秸秆堆肥的13 d[15].
2.3 秸秆堆肥的理化指标收集秸秆堆肥样品，测定理化指标，获得如表 5所示的结果.
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表 5 秸秆堆肥的理化指标 Table 5 Physicochemical indices of straw composts |
从表 5可以看出，接种JFB-1菌剂获得的水稻秸秆堆肥的含水率、有机质含量和碳氮比均低于对照堆肥和接种商业菌剂堆肥，但总氮和灰分含量均高于对照堆肥和接种商业菌剂堆肥，3种处理获得的堆肥pH均在7附近.同样地，接种JFB-1菌剂获得的芦笋秸秆堆肥也有类似的结果.本研究接种JFB-1菌剂的秸秆堆肥在26 d内已经充分腐熟，堆肥所需时间远低于玉米秸秆堆肥的90 d[16]，堆肥结束时的碳氮比也远低于蔬菜副产物和玉米秸秆堆肥的20左右[17]，制得有机肥的理化指标均符合我国有机肥料农业行业标准(NY525-2012)[18].
由2.2和2.3节可以看出，只接种辅助菌的对照堆肥(AS、RS)在一定程度上也达到与接种JFB-1菌剂类似的堆肥效果，这可能是6种辅助菌之间或者是辅助菌与环境微生物之间的相互作用促进了秸秆的降解，但是菌株之间相互作用的具体机制非常复杂，有待开展进一步研究.
2.4 施用秸秆堆肥对土壤碳氮含量的影响盆栽试验结束后，分别测定施用秸秆堆肥和不施肥土壤中的有机质和全氮含量，考察施用秸秆堆肥对土壤碳氮含量的影响，获得如图 3和图 4所示的结果.
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图 3 不同施肥处理下的土壤有机质含量 Fig. 3 Soil organic matter contents under different fertilization treatments |
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图 4 不同施肥处理下的土壤全氮含量 Fig. 4 Soil total nitrogen contents under different fertilization treatments |
一般来说，土壤有机质含量越高，作物生长越旺盛.有机质不仅为植物生长提供养分，还可以活跃土壤微生物，增加微生物多样性.从图 3可以看出，与不施肥比较，施用秸秆堆肥的土壤有机质含量均显著增加(P < 0.01)，其中最高的是施用150 g ·kg-1 RSJ的土壤，有机质含量增加127.7%.总体来看，土壤有机质含量随堆肥用量的增加而增加，相同用量下水稻秸秆堆肥的效果好于芦笋秸秆堆肥.当施用量为150 g ·kg-1时，与RS比较，施用RSC和RSJ的土壤有机质含量分别提高12.3%和33.5%；与AS比较，施用ASC和ASJ的土壤有机质含量分别提高29.2%和44.4%.
比较表 5和图 3可以看出，对照堆肥(AS、RS)中有机质含量高于接种JFB-1菌剂的秸秆堆肥(ASJ、RSJ)，但是接种JFB-1菌剂的堆肥还田后土壤中有机质含量(ASJ、RS)高于对照堆肥，其原因是在对照堆肥样品中测得的有机质包含相当部分未被分解的秸秆有机质，还田后这部分有机质不能直接转化为土壤有机质，由此间接说明接种JFB-1菌剂的秸秆腐解得更彻底，复合菌剂对秸秆的腐解能力强于其它处理.
从图 4可以看出，与不施肥土壤比较，施用秸秆堆肥的土壤全氮含量均显著增加(P < 0.01)，其中最高的是施用150 g ·kg-1的RSJ，全氮含量增加80.0%.同样地，土壤全氮含量随堆肥用量的增加而增加，相同用量下水稻秸秆堆肥的效果好于芦笋秸秆堆肥.当施用量为150 g ·kg-1时，与RS比较，施用RSJ的土壤全氮含量提高7.3%，而施用RSC的土壤全氮含量没有增加；与AS比较，施用ASJ的土壤全氮含量提高5.7%，而施用ASC的土壤全氮含量增加较少.施用水稻秸秆堆肥的土壤全氮含量比芦笋秸秆堆肥高的原因可能是水稻秸秆堆肥中的微生物群落更加活跃，提高了土壤微生物代谢氮素的能力，减少了氮素流失，达到了保氮的效果[19].
2.5 施用秸秆堆肥对土壤酶活性的影响施用有机肥可增加土壤脲酶、纤维素酶的活性[20].本研究分别测定施用秸秆堆肥和不施肥土壤中的土壤脲酶和纤维素酶活性，考察施用秸秆堆肥对土壤酶活性的影响，获得如图 5和图 6所示的结果.
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图 5 不同施肥处理下的土壤脲酶活性 Fig. 5 Soil urease activity under different fertilization treatments |
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图 6 不同施肥处理下的土壤纤维素酶活性 Fig. 6 Soil cellulase activity under different fertilization treatments |
土壤脲酶能够催化土壤中的尿素水解为(NH4)2CO3，进一步转化为NH3和CO2，常用脲酶活性表征土壤的供氮能力[21]，脲酶活性的提高有利于土壤中有机氮向植物可吸收利用的有效氮转化.从图 5可以看出，土壤脲酶活性随堆肥用量的增加而增加，相同用量下水稻秸秆堆肥的效果好于芦笋秸秆堆肥.与不施肥比较，施用秸秆堆肥的土壤脲酶活性显著增加(P < 0.01)，其中最高的是施用150 g ·kg-1 RSJ的土壤，脲酶活性增加163.5%.当施用量为150 g ·kg-1时，与RS比较，施用RSC和RSJ的土壤脲酶活性分别提高10.6%和16.7%；与AS比较，施用ASC和ASJ的土壤脲酶活性分别提高8.4%和17.8%.
土壤中的纤维素酶可以促进纤维素转化为纤维二糖和葡萄糖，其中β-糖苷酶与土壤呼吸作用关系密切，提高土壤纤维素酶活性对于进一步分解土壤中的植物残体、提高土壤呼吸、促进植物对土壤养分的吸收具有重要作用[22].从图 6可以看出，土壤纤维素酶活性随堆肥用量的增加而增加，相同用量下水稻秸秆堆肥的效果好于芦笋秸秆堆肥.与不施肥比较，施用秸秆堆肥的土壤纤维素酶活性显著增加(P < 0.01)，其中最高的是施用150 g ·kg-1 RSJ的土壤，纤维素酶活性增加138.8%.当施用量为150 g ·kg-1时，与RS比较，施用RSC和RSJ的土壤纤维素酶活性分别提高10.9%和30.8%；与AS比较，施用ASC和ASJ的土壤纤维素酶活性分别提高10.0%和29.9%.施用水稻秸秆堆肥的土壤纤维素酶活性比相应芦笋秸秆堆肥高的原因可能是水稻秸秆中纤维素组分含量明显高于芦笋秸秆[23].
2.6 施用秸秆堆肥对白菜生物量的影响分别施用50、100和150 g ·kg-1的秸秆堆肥，考察施用秸秆堆肥对栽培30 d的普通白菜生物量的影响.由于每盆定苗5株，用单株白菜的平均干重表示生物量，获得如图 7所示的结果.
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图 7 不同施肥处理下单株白菜的生物量 Fig. 7 Biomass of single cabbage under different fertilization treatments |
不施肥时普通白菜生长萎靡，植株矮小，单株干重仅为0.11 g；在3个施肥水平中，施用100 g ·kg-1秸秆堆肥时白菜的生物量最高.从图 7可以看出，当施肥量为100 g ·kg-1时，与RS比较，施用RSC和RSJ的白菜生物量分别提高32.1%和46.4%；与AS比较，施用ASC和ASJ的白菜生物量分别提高59.1%和81.8%.但是，施用150 g ·kg-1秸秆堆肥对白菜生长的促进作用比100 g ·kg-1低，其原因可能是过高的养分和含盐量导致白菜生长受阻.总体来说，施用水稻秸秆堆肥的白菜生物量比相应芦笋秸秆堆肥高，这是由于芦笋秸秆中更难降解的木质素含量较高，使得堆肥的腐熟效果较差[24].施用有机肥还可以提高土壤的代谢强度[25, 26]，秸秆堆肥中的大量氮素能够激活土壤中与氮循环有关的酶(如硝酸盐还原酶和脲酶)[27]，堆肥中大量降解纤维素的微生物可以提高土壤纤维素酶活性[28]，这些因素促进了白菜对养分的吸收，有利于白菜的生长.施用AS和RS时普通白菜生长较慢，这是因为秸秆中的纤维素未得到充分分解，堆肥中的营养成分相对较少，使得普通白菜植株矮小，生物量低下.
2.7 施用秸秆堆肥对土壤微生物多样性的影响当施用秸秆堆肥100 g ·kg-1时，利用BIOLOG-ECO平板[29, 30]测定土壤微生物利用碳源多样性指数，获得如表 6所示的结果.从中可以看出，与不施肥和AS比较，施用接菌处理的芦笋秸秆堆肥，土壤微生物多样性指标均显著增加(P < 0.01)，但施用ASJ的效果好于施用ASC；同样地，施用RSJ的效果好于施用RSC.结果表明，施用秸秆堆肥可以明显提高土壤微生物对碳源的利用率，又以接种复合菌剂JFB-1的秸秆堆肥效果最好；施用水稻秸秆堆肥的土壤微生物代谢多样性指数比相应芦笋秸秆堆肥高，更适合土壤微生物的生长代谢.施用秸秆堆肥可以显著提高土壤微生物多样性[31]，其原因可能是秸秆堆肥中含有丰富的有机质、铵态氮和硝态氮，这些养分会间接影响土壤微生物群落功能的多样性[32]，同时堆肥中的大量微生物也会影响土壤微生物群落的代谢活性.
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表 6 土壤微生物代谢多样性指数1) Table 6 Diversity indices of soil microbial metabolism |
3 结论
(1)以纤维素降解菌株为基础，筛选获得可高效降解水稻秸秆和芦笋秸秆的复合菌剂JFB-1.
(2)复合菌剂秸秆堆肥可以缩短发酵周期，提高堆体温度和堆肥养分含量.
(3)施用复合菌剂秸秆堆肥能够显著提高土壤养分含量，活跃土壤酶活性，改善土壤微生物群落结构，提高普通白菜产量，水稻秸秆堆肥的效果好于相应的芦笋秸秆堆肥.
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