2017, Vol. 38
2. 重庆工商大学重庆市发展信息管理工程技术研究中心, 重庆 400067;
3. 四川沃尔宜环保科技有限公司, 成都 610000;
4. 重庆市林业科学研究院, 重庆 400036
2. Chongqing Engineering Technology Research Center for Information Management in Development, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China;
3. Sichuan Allvery Environmental Technology Co., Ltd., Chengdu 610000, China;
4. Chongqing Key Laboratory of Forest Ecology, Chongqing 400036, China
近年来，迅猛的工、 农、 畜牧业发展加剧了环境污染和植被破坏，导致了生态系统生产力降低，生物多样性降低或丧失，土壤养分维持能力和物质循环效率降低等[1, 2]，生态环境退化已经成为当今世界所面临的重大问题. 土壤微生物和土壤酶是土壤生态系统的重要部分，共同推动了物质转化和养分循环，直接影响生态系统的结构和功能，左易灵等[3]利用磷脂脂肪酸(PLFA)法研究了蒙古沙冬青根围土壤微生物群落结构特征，靳振江等[4]比较了桂林会仙喀斯特溶洞湿地系统内的稻田湿地、 天然湿地和旱地表层土壤微生物和土壤酶活性，土壤微生物和酶作为土壤健康或土壤质量的评价指标被广泛用于土壤微生物生态学和地理学等研究领域.
季节更替会引起土壤温度和水分改变，进而影响土壤微生物群落结构和酶活性. 白震等[5]研究了季节更替对黑土(种植玉米)微生物群落的影响，结果显示土壤微生物PLFA含量呈显著的季节变化(P＜0.05)，总微生物PLFAs、 细菌PLFAs及真菌PLFAs均以夏季为最高，春秋两季较低，Spedding等[6]的研究也发现，真菌PLFAs、 总PLFAs在整个玉米生长季呈上升趋势，且真菌PLFAs生物量在夏季最高. 闫浩等[7]研究了宁南山区的两种灌木林土壤矿化过程中季节更替对PLFAs的影响，结果发现各类型土壤PLFAs随矿化时间大体表现为夏季＞春、 秋季＞冬季. 同时，罗飞等[8]研究结果发现土壤酶活性具有明显的季节变化规律，其中1年生杉木人工林蔗糖酶活性表现为冬季＞秋季＞春季＞夏季，而5、 10、 15、 20年生蔗糖酶表现为春季＞冬季＞秋季＞夏季； 5个龄级杉木人工林土壤过氧化氢酶活性随季节均表现为夏季＞秋季＞春、 冬季； 1、 5、 10年生杉木人工林土壤过氧化物酶活性表现为夏季＞冬季＞春季＞秋季，20年生则表现为冬季＞春季＞夏季＞秋季. 范艳春等[9]研究了三峡库区马尾松纯林和马尾松-杉木混交林土壤酶活性，结果发现2种林分土壤蔗糖酶、 土壤脲酶及土壤过氧化氢酶活性在秋季最大，其次是夏季和春季，冬季最低. 土壤微生物和酶活性易受地域[10]、 植被类型[11, 12]和土壤质地[13]等综合因素影响，研究区域和研究对象不同所得结论各异，且大多研究集中在生态林或农耕地，而以采果为主的柑橘林地土壤微生物随季节变化的相关报道鲜见，特别是利用生态学方法研究土壤微生物随季节变化的未见报道.
本文以中亚热带缙云山为研究基地，选择柑橘林(citrus forest)土壤为研究对象，探讨季节更替对土壤微生物PLFAs群落结构及酶活性的影响，以期为保护该区域经果林土壤生物多样性及土壤质量平均提供参考.
1 研究区概况缙云山国家级自然保护区(106°22′E，29°45′N)位于重庆市北碚区境内，距市中心60 km. 缙云山占地面积76 km2，海拔350~951.5 m，属典型的北亚热带温暖湿润季风气候. 年平均温度13.6℃，最高气温43℃，最低气温-1℃； 年平均相对湿度87%，年平均降雨量1 161.8 mm； 年平均日照1 293.9 h，干湿季分明. 雨季是4~9月(降雨量1 243.8 mm)，其中7~8月是伏旱期(蒸发量255.4 mm)，降雨量小，蒸发量大. 土壤以酸性黄壤及水稻土为主，伴有少量零星分布的紫色土. 区内植物资源丰富，植被种类繁多，森林覆盖率达96.6%.
2 研究方法 2.1 土壤样品采集2014年8月、 11月及次年2月和5月，在柑橘林(无施肥)内选取3块面积为20 m×20 m的标准样地，在标准样地中沿对角线各设置3个1 m×1 m的小样地，每个小样地中随机选择1个采样点(非根际采样，采样点有少量柑橘叶凋落物)，随机采集0~20 cm深度的土样，分别混匀同一标准样地中3个土样. 当天带回实验室，除去动植物残体，过2mm筛，储存在4℃并于1周内完成PLFA和酶活性测定. 柑橘林下无灌木层，草本层为优势群落，主要优势草本为：兔儿酸(Polygonum amphibium L.)、 糯米团(Gonostegia hirta (Bl.) Miq.)、 九层塔(Ocimum basilicum L.)、 加拿大飞蓬[Conyza canadensis (L.) Cronq.]、 杠板归(Polygonum perfoliatum L.)、 稗草[Echinochloa crusgalli (L.) Beauv.]. 供试土壤基本理化性质见表 1.
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil |
2.2 测定项目
土壤基本理化性质采用常规分析方法[14]. 磷脂脂肪酸采用修正的Bligh-Dyer方法[15]，以C19:0做内标，用Aligent 6850气相色谱仪测定，用MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version6.1,MIDI,Inc.,Newark,DE)分析PLFA图谱从而对脂肪酸成分进行鉴定.
脲酶测定用靛酚比色法，转化酶测定用3,5-二硝基水杨酸比色法； H2O2酶测定用KMnO4滴定法； 酸性磷酸酶测定用磷酸苯二钠法[16]. 所有测定结果均为3次重复的平均值，用烘干土壤质量表示. 采用紫外可见分光光度计进行测定(仪器型号：UV-5200).
2.3 数据处理夏、 秋、 冬、 春这四季土壤微生物PLFA含量分别用2014年8月、 11月及次年2月和5月所测数据平均值表示. 不同数据组间的差异(P＜0.05)采用SPSS 18.0中的单因素方差分析法(LSD)进行比较，柑橘林地土壤肥力的主要影响因子采用SPSS 18.0中的主成分分析方法(PCA)进行综合评价，图 2、3使用Origin 9.2软件进行制作，其余图表则均在Microsoft Excel 2007中完成.
根据脂肪酸含量和种类计算丰富度指数(R)[17, 18]、 Shannon-Wiener多样性指数(H′)[18, 19]、 Pielou均匀度(J)[17, 18]及Simpson优势度(D)[17]来评价微生物多样性，公式如下：
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式中，Pi=Ni/N，Ni为i类脂肪酸个数，N为该实验中总脂肪酸个数，S为微生物群落中总脂肪酸种类，即丰富度. 脂肪酸采用Frostegrd方法[20]命名，分子式用X:YωZ(c/t)表示，X代表脂肪酸分子的碳原子总数，Y代表不饱和烯键的数目，ω代表双键的位置(从羧基端算起)，Z为烯键或环丙烷链的位置. 表征微生物的PLFA[21~25]见表 2.
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表 2 表征微生物的PLFA Table 2 PLFA characterizing microbes |
3 结果与分析 3.1 土壤微生物PLFAs的季节变化特征
4个时间土壤共检测出48种PLFAs(图 1)，其中8月、 11月及次年2月和5月分别测得PLFAs14种、 27种、 30种和37种，且均以PLFAs16:0含量最高. 测得4个时间共有PLFAs分别为16:0、 i17:0、 16:1 2OH、 18:0、 cy19:0ω8c、 i17:1ω9c或16:0 10-methyl，含量之和所占总PLFAs的比例分别为49.57%、 41.63%、 35.41%和38.05%. PLFAs按结构类型分，可分为5类，分别为直链饱和PLFAs、 直链单不饱和PLFAs、 支链饱和PLFAs、 环丙烷PLFAs和多不饱和PLFAs，由表 3可知，8月、 11月及次年2月和5月直链饱和PLFAs分别占总PLFAs的15.40%、 20.50%、 17.26%和37.73%，直链单不饱和PLFAs分别占总PLFAs的6.04%、 2.81%、 4.51%和2.72%，支链饱和PLFAs分别占总PLFAs的6.87%、 22.01%、 23.24%和14.24%，环丙烷PLFAs分别占总PLFAs的8.77%、 7.62%、 9.91%和6.77%，多不饱和PLFAs分别占总PLFAs的7.11%、 14.53%、 9.81%和7.06%.
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Summed Feature 1代表 15:1 iso H/13:0 3OH或13:0 3OH/i15:1 H; Summed Feature 2代表 12:0 aldehyde 或unknown 10.928; Summed Feature 3代表161ω7c/16:1ω6c或16:1ω6c/16:1ω7c; Summed Feature 5代表18:2ω6,9c/18:0 ante或18:0 ante/18:2ω6,9c; Summed Feature 8代表18:1ω7c或18:1ω6c; Summed Feature 9代表 17:1 isoω9c或16:0 10-methyl 图 1 不同季节的土壤微生物PLFA图谱 Fig. 1 Soil microbial PLFA profiles in different seasons |
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表 3 不同季节柑橘林土壤PLFA类型及其含量(平均值±SE)1)/nmol·g-1 Table 3 Types and contents of soil microbial PLFA in citrus forest(mean±SE)/nmol·g-1 |
各类微生物的特征标记PLFAs含量随时间发生了显著变化(图 2)，其中细菌PLFAs所占比例最高，其次是真菌PLFAs，放线菌PLFAs比例最低. 除真菌PLFAs外，细菌PLFAs、 总PLFAs、 放线菌PLFAs、 G-及G+随时间均表现为先升高后降低再升高的变化趋势，与含量最高的5月相比，8月、 11月及2月细菌PLFAs分别降低了72.55%、 53.55%、 64.44%，总PLFAs分别降低了64.96%、 42.28%、 57.67%，放线菌PLFAs分别降低了73.52%、 21.55%、 23.19%，G-分别降低了40.65%、 14.84%、 39.74%，G+分别降低了90.16%、 24.65%、 38.68%. 真菌PLFAs随时间变化则表现为11月[(1.478±0.044) nmol·g-1]＞2月[(0.740±0.034) nmol·g-1]＞8月[(0.602±0.025) nmol·g-1]＞5月[(0.076±0.004) nmol·g-1]. 说明土壤微生物PLFAs组成及含量因时间不同而不同.
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小写字母表示在不同时间点在0.05水平上差异性 图 2 土壤真菌PLFAs、 放线菌PLFAs、 G+、 G-、 细菌PLFAs及总PLFAs随季节的变化特征 Fig. 2 Seasonal variation of the PLFAs content of soil fungi,actinomycetes,G+,G-,bacterial and the total PLFAs |
从8月到次年的5月，不同土壤微生物群落多样性指数变化趋势不同(表 4). 丰富度指数(R)随时间表现为直线升高，均匀度指数(J)则随时间变化直线下降，说明土壤PLFAs种类渐渐增加； 多样性指数(H′)和优势度指数(D)随时间变化先增加后降低，均在2月达最大值，说明2月的土壤微生物PLFA种类繁多，优势度物种小且奇异度最高.
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表 4 季节更替对土壤微生物PLFA群落多样性的影响1) Table 4 Effects of season changes on soil microbial PLFA community's diversity |
3.3 土壤酶活性的季节变化特征
季节变化对土壤酶活性有显著影响(P＜0.05)(图 3). 土壤脲酶随季节变化表现为夏季[(2.328±0.132) mg·g-1]＞春季[(1.667±0.257) mg·g-1]＞秋季[(1.424±0.124) mg·g-1]＞冬季[(0.619±0.037) mg·g-1]； 土壤蔗糖酶活性秋季[(12.363±0.765) mg·g-1]＞夏季[(9.701±1.069) mg·g-1]＞春季[(8.441±0.591) mg·g-1]＞冬季[(7.480±0.026) mg·g-1]； 土壤过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性随季节变化均表现为秋季最高，其次是春季和夏季，冬季最低，与冬季相比，春夏秋季土壤过氧化氢酶活性分别升高16.34%、 11.67%及29.50%，酸性磷酸酶活性则分别升高84.92%、 54.91%及161.18%.
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小写字母表示同一种酶在不同季节间在0.05水平上差异性； 脲酶以24 h后1 g土壤中生成NH3-N的毫克数表示； 转化酶以24 h后1 g土壤生成葡萄糖的毫克数表示； H2O2酶以20 min后1 g土壤消耗的0.2 mol·L-1 KMnO4的毫升数表示； 酸性磷酸酶以24 h后1 g土壤中释放出的酚的毫克数表示 图 3 土壤脲酶、 转化酶、 酸性磷酸酶及过氧化氢酶随季节的变化特征 Fig. 3 Seasonal variations of soil urease,invertase,acid phosphatase and catalase |
8个指标可优化为PC1、 PC2、 PC3这3个主成分，3个主成分的方差累计贡献率为100%，各个主成分贡献率大小依次为F1(42.45%)＞F2(38.86%)＞F3(18.69%)，且每个主成分特征根均大于1(表 5). 其中PC1主要由细菌PLFA、 G+、 G-、 放线菌PLFA和总PLFA组成，PC2主要由转化酶、 过氧化氢酶、 酸性磷酸酶和真菌PLFA组成，PC3则主要由脲酶组成(表 6).
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表 5 土壤微生物与酶活性的总方差分析 Table 5 Analysis of variance of indexes of the soil microbes and soil enzymes |
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表 6 土壤微生物及酶活性主成分分析旋转后的因子载荷矩阵 Table 6 Index score matrix of principal component analysis of the soil microbes and soil enzymes |
4 讨论 4.1 季节更替对土壤微生物PLFA种类及群落结构的影响
土壤微生物是陆地生态系统中最活跃的组成部分之一，虽所占比例小，但参与并调节土壤中物质循环和各种生化反应，在改善土壤理化性质、 分解植物调落物、 平衡养分循环、 提高养分可用性和林地生产力等方面起着十分重要的作用[26, 27]. 土壤微生物组成和数量易受土壤温湿度的影响，土壤水分参与土壤微生物分解土壤有机质进程，加速养分形态转化，加快土壤中微生物所需养分的运输，决定土壤含氧量高低进而影响土壤微生物量[28]. 土壤温度影响土壤水分蒸发速率及某类微生物群落对底物的利用率，在土壤湿度一定时，高温限制了氨基转化为硝基，抑制除真菌标记基因外的其他所有基因的表达[29].
本研究结果发现柑橘林土壤PLFA种类和组成受季节更替的影响显著，除真菌PLFA外，总PLFA、 细菌PLFA、 G-、 G+及放线菌PLFA均表现为春季最多，其次是秋季和冬季，夏季最低，这与白震等[5]、 Spedding等[6]和闫浩等[7]关于夏季最高的研究结论不一致. 原因是这些研究的是玉米地和灌木林地，夏季处于玉米生长季，一定高度的玉米和灌木林所营造的特有土壤环境为地下土壤微生物生长提供了良好的生长条件，加之在种植玉米过程中化肥等的施用为土壤微生物提供了较多的营养来源，因此使夏季土壤微生物含量最高，而本研究对象柑橘树低矮且郁闭度低，林下并无灌木的遮阳作用，加之重庆夏季温度奇高，水分蒸发快，太阳暴晒地表，而阳光透过稀少的地表草本层直接进入土壤，增加了土壤温度，当此温度超过土壤微生物生长的最适温度时，土壤微生物生长受到了限制，高温导致了夏季土壤微生物种类及数量均偏低的情况，因此造成了本研究与文献[5~7]的结果不同.
4.2 季节更替对土壤酶活性的影响土壤酶参与土壤各类生化反应，含量小但作用大，它易受土壤质地和土壤环境等综合环境因子的影响. 本实验结果表明土壤脲酶随季节变化表现为夏季＞春季＞秋季＞冬季，土壤转化酶、 土壤过氧化氢酶和酸性磷酸酶随季节变化均表现为秋季＞春季、 夏季＞冬季. 与罗飞等[8]和范艳春等[9]研究结论存在差异. 原因可能是文献[8, 9]分别研究的是杉木人工林、 马尾松纯林和马尾松-杉木混交林，与本实验的研究对象柑橘林林分类型不同，同时研究区域和研究时间也不一样，文献[8, 9]虽研究的是林地土壤酶活性，但与本实验研究的林地林分类型存在差异，不同林分所构成的林下土壤环境不同，造成了林下土壤光、 热、 水、 气等环境不同，而土壤酶受土壤光、 热、 水、 气等条件影响显著，因此，导致各林地土壤酶活性不一致，且随季节变化规律也不尽相同. 总的说来，本实验秋季土壤酶活性最强，冬季土壤酶活性最弱，秋季土壤温度为(23.966±3.032)℃，刚好位于脲酶升高的温度范围，冬季土壤温度跟土壤湿度都很低，与土壤酶适宜生长的最适范围不一致.
4.3 柑橘林土壤微生物与土壤酶的综合评价土壤中养分含量多少影响着林地植物生长，土壤微生物和土壤酶活性共同推动土壤养分循环、 参与进入土壤有机质形态转化，同时又是土壤能量和土壤碳、 氮、 磷、 硫等养分元素循环的“源”和“库”[30]，它们在土壤中的数量、 分布及活动情况，反映了土壤肥力的高低，对植株生长发育起着重要的作用[31]. 唐艳等[32]研究了银杏土壤酶活性与土壤肥力的关系，结果发现土壤脲酶、 转化酶活性均与土壤有机质、 全磷、 全氮、 速效磷、 碱解氮、 速效钾及银杏果实产量极显著相关. 张海燕等[33]对不同利用方式下19个黑土样品的养分和微生物量进行分析，结果表明土壤微生物与土壤有机质、 全氮、 全磷、 碱解氮和速效钾有显著或极显著的正相关关系. 刘秀清等[34]、 张焱华等[35]均发现土壤酶活性与土壤肥力显著相关，且均可作为评价土壤肥力的指标. 本实验结果表明，柑橘林土壤肥力主要受细菌PLFA、 G+、 G-、 放线菌PLFA和总PLFA等5个因子影响，且5个因子对土壤肥力的影响均表现为正向影响，即细菌PLFA、 G+、 G-、 放线菌PLFA和总PLFA值越大，该区域土壤越肥沃. 其次是转化酶、 过氧化氢酶、 酸性磷酸酶和真菌PLFA等4个因子，且对肥力具有正效应，转化酶、 过氧化氢酶、 酸性磷酸酶和真菌PLFA值越大，土壤越肥沃. 8个指标中对土壤肥力影响最低的为脲酶，但对土壤肥力同样具备正效应. 诸多研究结论也表明土壤酶和土壤微生物对土壤肥力产生正效应，张海燕等[33]和刘秀清等[34]研究结果表明土壤酶和微生物含量均与土壤肥力有正相关的关系，这与本研究结论一致.
5 结论(1) 季节更替对土壤微生物有显著影响(P＜0.05)，16:0、 i17:0、 16:1 2OH、 18:0、 cy19:0ω8c、 i17:1ω9c或16:0 10-methyl为4个季节共有脂肪酸，含量之和分别占总脂肪酸的49.57%、 41.63%、 35.41%和38.05%. 各微生物种类中，细菌比例最高，其次为真菌，放线菌比例最低，且随季节均呈显著的季节变化特征，土壤微生物总PLFA随着季节变化表现为先降低后增加再降低的趋势，即春季最高，其次是秋季和冬季，夏季最低； 细菌、 G-、 G+及放线菌也呈现相同的变化，但真菌最表现为秋季最高，其次是冬季和夏季，而春季真菌含量最低. 季节更替微生物群落的功能多样性指数亦产生显著影响，丰富度指数(R)随季节变化依次为春＞冬＞秋＞夏，多样性指数(H′)随季节变化表现出冬＞秋＞春＞夏，均匀度指数(J)表现为夏＞秋＞冬＞春，优势度指数(D)则随季节表现为直线升高的变化趋势.
(2) 季节更替对土壤酶活性具有显著影响(P＜0.05). 土壤脲酶随季节变化表现为夏季＞春季＞秋季＞冬季； 土壤转化酶活性秋季＞夏季＞春季＞冬季； 土壤过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性随季节变化均表现为秋季最高，其次是春季和夏季，冬季最低.
(3) 8个影响土壤肥力的因子中，细菌PLFA、 G+、 G-、 放线菌PLFA和总PLFA对土壤肥力贡献最大，其次是转化酶、 过氧化氢酶、 酸性磷酸酶和真菌PLFA，贡献最小的是脲酶.
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