2016, Vol. 37
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
养殖业是我国农业的重要组成部分，有力地推动了农村经济社会的发展. 抗生素具有促进禽畜生长、 预防疾病的功能，抗生素被当作有效的促生长剂和亚治疗剂在全球的养殖行业中被普遍使用[1~3]. 2000~2010年，全球总的抗生素消费量增加了36%，其中巴西、 俄罗斯、 印度、 中国和南非这五国贡献了全球增长量的76%[4]，表明发展中国家的抗生素使用量迅速攀升. 2013年我国抗生素总使用量约为16.2万t，其中人用抗生素占到总量的48%，其余为兽用抗生素[5]. 一直以来，由于抗生素管控措施松散，抗生素生产成本低，民众对抗生素的科学认识不足，抗生素在我国的医疗行业和养殖业存在着长期滥用和过度使用的现象，促使抗生素抗性的进化过程大大加快，导致抗生素耐药性的不断发展. 抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)的快速出现和扩散极大地影响了抗生素的治疗效果，同时，微生物群落存在水平基因转移机制(horizontal genes transfer,HGT)，使得抗性基因可以在不同环境微生物间迁移传播[6, 7]，人类可能面临着无药可用的局面[8]. 有研究表明，在不同环境介质中，例如施用城市污泥土壤[9]、 城市河流[10]、 施用猪粪水稻土[11]，甚至城市自来水[12]都有抗生素抗性基因检出. 环境抗生素抗性基因污染日趋严重[13]，进而可能对人类健康和福祉造成潜在的威胁，被认为是一种新型环境污染物[14]. 世界卫生组织(WHO)在2015年11月16~22日开展了首个世界提高抗生素认识周(World Antibiotic Awareness Week)相关活动，并把活动周主题定为: 慎重对待抗生素(Antibiotics: Handle With Care).
梅花鹿养殖是福建省近年来调整农村经济产业结构，转变农村经济发展方式而出现的新兴养殖业. 虽然梅花鹿疾病抵抗能力较强，但当梅花鹿发生巴氏杆菌病、 溶血性大肠杆菌病等细菌感染疾病时，也需注射抗生素进行治疗[15, 16]. 在南方地区，梅花鹿养殖业作为一种新兴的养殖业，可能产生的新型环境污染(抗生素抗性基因)目前还没有相关研究，因此开展梅花鹿养殖环境抗生素抗性基因的研究显得十分必要.
本研究采用高通量荧光定量PCR(high-throughput qPCR,HT-qPCR)技术，对福建省连城县某梅花鹿养殖场区对照土壤、 梅花鹿新鲜粪便、 梅花鹿粪便堆肥产物和施用堆肥菜地土壤中的抗生素抗性基因的丰度和多样性进行分析，以期对南方地区梅花鹿养殖业可能造成的抗生素抗性基因污染增加科学认识，提高梅花鹿养殖场的科学养殖水平，以期为梅花鹿养殖业潜在环境健康风险评价与行业管理者决策提供理论支撑.
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理采样地点位于福建省连城县某梅花鹿养殖场. 梅花鹿粪便与梅花鹿食用剩下的牧草、 秸秆等形成的混合物从饲养区被清扫出来后，直接在梅花鹿粪便堆肥区进行堆肥. 由于梅花鹿堆肥产物有肥效持久和肥力温和的特点，堆肥产物主要出售给周围的果园农场，用于果树的根系施肥，小部分作为养殖场内小菜园(主要种植玉米和地瓜，玉米秆和地瓜藤又作为青饲料喂给梅花鹿)的有机肥. 养殖场区有明显的功能分区，是一个小型的养殖农场(图 1). 该梅花鹿养殖场建于2015年2月，截至2016年5月该养殖场梅花鹿存栏量为220头. 本实验采集了养殖场区对照土壤(pristine soil，PS)、 梅花鹿新鲜粪便(deer maure，DM)、 梅花鹿粪便堆肥产物(deer manure composting，DC)和施用堆肥菜地土壤(vegetable soil,VS)，每种样品采集了约500 g，每个采样点3个采样重复. 所采集的样品放置于低温采样箱，迅速运回实验室-20℃冰箱中保存，用于环境样品的DNA提取. 此外用称重法测定了所采集样品的含水率.
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图 1 梅花鹿养殖场鸟瞰示意 Fig. 1 Sketch of sika deer farm |
所采集的样品用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)进行总DNA的提取. 其中，养殖场区对照土壤样品称取约0.5 g，其它样品称取约0.15 g分别添加到试剂盒中的Lysing Matrix E tube，按照生产商提供的方法提取样品的总 DNA，DNA洗脱体积为100 μL，然后用 1%的琼脂糖凝胶进行电泳验证. 样品所提取的 DNA 样品用 QuantiFluor® dsDNA System(Promega Corporation，美国)试剂盒测定双链 DNA 浓度. 最后，所得到DNA样品置于-20℃冰箱保存.
1.3 核糖体16S rRNA基因荧光定量PCR本实验采用Roche 480Ⅱ定量PCR仪(Roche，美国)测定所有样品的16S rRNA基因，并采用标准质粒外标法对样品的丰度进行绝对定量[17]. 所制备的标准质粒浓度为1.68×1010 copies·L-1，标准曲线(10倍稀释)的浓度范围为1.68×103~1.68×109 copies·L-1.
PCR反应体系为20 μL，包括10 μL的2×LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix(Roche，美国)，1 μL的DNA模板，各1 μL的上下游引物(10 μmol·L-1)，7 μL灭菌超纯水. PCR反应运行条件为: 95℃预变性5 min； 95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸15 s，总共40个循环； 仪器程序自动添加熔解曲线程序进行分析. 用灭菌的超纯水代替样品进行阴性对照实验，每个样品均做3次技术重复实验.
1.4 抗生素抗性基因高通量定量PCR采用SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.,美国)高通量荧光定量反应平台. 研究中所采用的293对引物在相关的研究中被有效验证过[18]. 此外另外添加了1对用于检定超级细菌的抗性基因blaNDM-1的引物[19]； 1对intI1整合子基因 (class 1 integron)引物[20]和1对CintI1临床医学意义上的整合子基因(clinical class 1 integon)引物[21]，这两个整合子基因用于分析研究抗性基因的水平基因转移情况.
高通量PCR扩增反应体系为100 nL. 反应体系中各试剂的终浓度为: 1×的LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix(Roche，美国),nuclease-free PCR-grade water，1 ng·μL-1的BSA，2 ng·μL-1的DNA模板，1 μmol·L-1的上下游引物. 高通量PCR反应条件为: 95℃预变性10 min； 95℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，总共40个循环； 仪器程序自动升温进行熔解曲线分析. 高通量定量PCR每个SmartChip芯片都有不添加DNA模板(用灭菌超纯水替代)的阴性对照. qPCR反应得到的数据通过Cycler预先设定的筛选条件(PCR扩增效率介于1.8~2.2)进行导出. 根据SmartChip Real-Time PCR Systems的灵敏度和精确度，确定循环次数CT值为31时作为仪器的检测限. 每个样品进行3次技术重复实验，当3次技术重复都被扩增出来时认为是阳性扩增，3个采样平行样品都是阳性扩增时，认为样品的目的基因被有效检出.
1.5 数据分析高通量定量PCR基因的相对拷贝数(relative copy number)参照Looft等[22]的方法，用公式(1)进行计算. 将高通量定量PCR得到的16S rRNA基因的相对拷贝数与Roche荧光定量PCR得到的16S rRNA基因绝对拷贝数(absolute copy number)进行Pearson线性拟合，两者极显著相关(r=0.96,P<0.01)，线性较好. 因此用公式(2)可以转化得到抗生素抗性基因的绝对丰度.
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(1) |
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(2) |
高通量定量PCR的数据采用Excel 2010进行计算，OriginPro 9.0进行相关作图，采用R 3.0.0(The R Project for Statistical Computing,Vienna,Austria)vegan数据包进行PCA分析以及pheatmap数据包进行热图分析[23].
2 结果与讨论 2.1 梅花鹿养殖环境抗性基因的多样性养殖场区对照土壤(PS)、 梅花鹿新鲜粪便(DM)、 梅花鹿粪便堆肥产物(DC)和施用堆肥菜地土壤(VS)这4种养殖环境样品分别检测到21、 120、 98和106种抗生素抗性基因(图 2). 根据抗性基因相对应的抗生素类型，抗生素抗性基因可以分为八大类: 氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside)、 β-内酰胺类抗生素(β-Lactamase)、 氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇抗生素类(FCA)、 大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素(MLSB)、 其它类/发挥外排泵作用(other/efflux)抗生素、 磺胺类抗生素(Sulfonamide)、 四环素类抗生素(Tetracycline)和万古霉素类抗生素(Vancomycin). 梅花鹿新鲜粪便(DM)、 梅花鹿粪便堆肥产物(DC)和施用堆肥菜地土壤(VS)在检测出的抗性基因种类组成上具有相似性，检测出的抗性基因种类数均显著(P<0.05)高于养殖场区对照土壤(PS). 前三者检测出了涵盖前述的八大类抗性基因，而养殖场区对照土壤(PS)未检测出磺胺类抗性基因和万古霉素类抗性基因. 磺胺类抗生素是一种广谱抗生素，同时具有价格低廉，性质稳定的特点在养殖业中被广泛使用[24, 25]，万古霉素被认为是治疗危重病人最后一道防线的抗生素药物[26]，磺胺类和万古霉素类抗性基因的出现，表明梅花鹿养殖过程中可能使用了相应类型的抗生素，具有潜在的环境健康风险. 抗生素抗性基因按照抗性机制可以分成抗生素失活(deactivation)、 外排泵作用机制(efflux)、 核糖体保护机制(protection)三大类. 将检测到的抗生素抗性基因按照抗生素抗性机制进行归类分析，抗生素失活(deactivation)和外排泵作用机制(efflux)是养殖场土壤环境中抗生素抗性两种最主要机制，比例分别为47.83%和28.41%(图 2).
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图 2 抗生素抗性基因的种类 Fig. 2 Profiles of detected antibiotic resistance genes |
通过venn图可以进一步分析检测到的抗性基因在不同样品之间的相互关系(图 3). 共有18种抗性基因在所有样品中被检出，占所有检测到基因的12.2%，主要是氨基糖苷类抗性基因(Aminoglycoside). 梅花鹿新鲜粪便(DM)和梅花鹿粪便堆肥产物(DC)检测到了82种相同的抗性基因，占所有检出抗性基因的比例为55.7%，其中共有77种抗生素抗性基因也存在于施用堆肥菜地土壤(VS)，表明梅花鹿粪便及其堆肥施用对养殖环境抗生素抗性基因有直接的影响.
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图 3 抗生素抗性基因韦恩图 Fig. 3 Venn diagram of antibiotic resistance genes |
梅花鹿新鲜粪便及其堆肥产物、 施用堆肥菜地土壤抗生素抗性基因相对于对照土壤具有更复杂的多样性，梅花鹿养殖活动显著改变了养殖场环境土壤中的抗性基因种类组成(P<0.05). 此外，梅花鹿是一种杂食性食草动物，疾病抵抗力较强，使用的抗生素种类和剂量远小于生猪养殖业，但仍可以检测出超过120种抗性基因，表明粪便是抗性基因的重要来源，并不一定跟抗生素滥用有关.
2.2 梅花鹿养殖环境抗生素抗性基因的丰度梅花鹿养殖环境各样品抗生素抗性基因的绝对丰度可以达到106~1012 copies·g-1，除对照土壤样品外，各类型的抗性基因丰度可达109~1012 copies·g-1，对照土壤样品总体上要比其它3种土壤样品低3个数量级(图 4). 其中，四环素类抗性基因呈现出最高丰度(1.68×107~1.47×1012 copies·g-1)，万古霉素类抗性基因呈现最低丰度(0~2.35×109 copies·g-1). 相较于对照土壤样品，其它3种样品的可移动基因元件丰度高出了约4个数量级，说明养殖环境可能存在高频率的抗性基因水平转移. 养殖环境4种样品的八大类抗性基因和可移动基因元件的绝对丰度总体上具有相似的分布趋势(图 4)，梅花鹿粪便堆肥产物(DC)、 梅花鹿新鲜粪便(DM)、 施用堆肥菜地土壤(VS)、 养殖场区对照土壤(PS)的丰度依次递减，表明梅花鹿新鲜粪便是养殖场区抗性基因的最重要来源，而且堆肥产物的抗性基因的丰度增加，这与Su等的研究结果一致[27]. 相较于对照土壤样品，施用堆肥菜地土壤各类抗生素抗性基因和可移动基因元件都显著增加，表明梅花鹿养殖活动改变了养殖环境土壤抗性基因的丰度.
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图 4 抗生素抗性基因的绝对丰度 Fig. 4 Absolute abundance of antibiotic resistance genes |
Klappenbach等[28]的研究表明，基于rRNA数据库，每个细菌约有4.0个rRNA基因的拷贝. 因此，为了更好地评估养殖环境土壤中抗性基因的相对丰度，将所有的抗性基因丰度均归一化到单个细菌水平(图 5). 总体上，梅花鹿粪便堆肥产物(DC)具有最高的归一化的抗生素抗性基因和可移动基因元件丰度，分别达6.72 copies·cell-1和1.50 copies·cell-1把整个梅花鹿养殖场(对照土壤除外)环境看成一个整体，那么抗生素抗性基因和可移动基因元件的归一化丰度分别为4.77 copies·cell-1和1.08 copies·cell-1，显著高于对照土壤样品中的1.22 copies·cell-1和0.55 copies·cell-1. 这也从另外一个角度证明了养殖环境微生物群落中抗性基因发生了显著富集并且具有很高的水平基因转移潜力.
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图 5 归一化的抗生素抗性基因丰度 Fig. 5 Normalized abundance of antibiotic resistance genes |
主成分分析表明，养殖场区对照土壤(PS)、 梅花鹿新鲜粪便(DM)、 梅花鹿粪便堆肥产物(DC)和施用堆肥菜地土壤(VS)这4种环境样品抗生素抗性基因分布格局不同(图 6). PCA1轴上(解释量60.1%)，梅花鹿新鲜粪便(DM)、 梅花鹿粪便堆肥产物(DC)和施用堆肥菜地土壤(VS)这3种样品与养殖场区对照土壤(PS)样品明显分开. 经mrpp、 adonis、 anosim显著性分析表明，养殖场区对照土壤(PS)与其它3种环境样品抗生素抗性基因分布格局呈显著性差异(P<0.05). 此外，养殖环境4种样品当中，梅花鹿粪便堆肥产物(DC)和施用堆肥菜地土壤(VS)在抗性基因分布结构上最为接近，表明施用堆肥对菜地土壤抗性基因有直接影响.
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图 6 梅花鹿养殖环境抗性基因主成分分析 Fig. 6 Principle component analysis of ARGs in sika deer farm |
抗生素抗性基因聚类热图可以进一步分析梅花鹿养殖环境抗性基因的分布格局及其具体差异(图 7). 聚类结果与主成分分析结果一致，具体到不同抗性基因类型在不同的样品中又有着独特的分布格局特征. A簇代表着在梅花鹿新鲜粪便中检测到的并且丰度较高的tnpA-02(可移动基因元件)、 acrA(多重抗性基因)等基因. B簇代表的是养殖场4种环境样品中都存在，并且在梅花鹿新鲜粪便及其堆肥产物、 菜地土壤样品中存在着丰度较高的抗性基因，主要是tetQ、 tetR、 tetX、 aadA1等抗性基因和tnpA-05、 intI1和 CintI1等可移动元件，表明四环素类抗性基因、 氨基糖苷类抗性基因具有一定的环境本底值，抗性基因即使在未受人类活动影响的对照土壤中也可以检测到，表明此类抗性基因是一种古老的并存在于大自然环境中[29]. 结合图 4从丰度上来看，梅花鹿粪便堆肥产物(DC)>梅花鹿新鲜粪便(DM)>施用堆肥菜地土壤(VS)>养殖场区对照土壤(PS)，这与热图结果具有一致性. 由于梅花鹿新鲜粪便四环素类抗性基因、 氨基糖苷类抗性基因和可移动基因元件本身丰度较高，并可能在tnpA-05、 intI1和 CintI1等可移动基因元件存在的情况下加快抗性基因的基因水平转移(HGT)，进而促进了抗生素抗性基因在养殖环境中的进一步传播、 富集和演化. C簇是在养殖场区对照土壤中未检出，但在其它3种样品中被有效检出，并且抗性基因丰度较高的抗生素抗性基因类型，主要包含了ermC、 aadD、 blaMP(分别属于MLSB类、 氨基糖苷类、 β-内酰胺类抗生素)等抗性基因，表明养殖过程中可能使用了相应的抗生素. 梅花鹿养殖活动显著改变了养殖环境的抗生素抗性基因的分布格局，养殖场抗生素抗性基因污染加剧.
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图 7 梅花鹿养殖环境抗性基因丰度聚类热图 Fig. 7 Pheatmap of ARGs in sika deer farm |
抗生素抗性基因的绝对丰度和归一化的丰度以及抗性基因的热图分析都表明抗性基因与可移动元件可能存在着相关关系. 因此，统计了各类抗生素抗性基因的绝对丰度和可移动元件的Pearson相关性(表 1).
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表 1 抗生素抗性基因与可移动基因元件的相关性1) Table 1 Correlation analysis between ARGs and MGEs |
相关研究表明，四环素类、 磺胺类抗生素抗性基因与一些新型的可移动元件有关[30, 31]. 梅花鹿养殖环境氨基糖苷类(Aminoglycoside)、 大环内酯类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类(MLSB)、 其它类/发挥外排泵作用(other/efflux)抗生素和四环素类抗生素(Tetracycline)分别与可移动基因元件(MGEs)具有极显著的正相关关系(P<0.01)，进一步表明了可移动基因元件可能加快这些抗生素抗性基因在土壤环境的迁移、 传播和富集过程. 抗生素抗性基因在梅花养殖场环境的变化是人类养殖活动和土壤环境微生物共同作用的结果. 微生物群落的各种抗性基因之间可能存在着连锁效应、 协同选择和进化的关系，需要采用宏基因组测序等方法，对微生物群落结构与抗性基因多样性及其演变开展进一步相关研究.
3 结论抗生素抗性基因在梅花鹿养殖场不同环境样品中具有不同的分布格局，其中抗性基因丰度梅花鹿粪便堆肥产物(DC)>梅花鹿新鲜粪便(DM)>施用堆肥菜地土壤样品(VS)>养殖场区对照土壤(PS)，梅花鹿养殖导致养殖环境土壤中抗性基因的丰度和多样性显著增加； 抗性基因与可移动基因元件丰度存在显著的线性相关关系，表明可移动基因元件可能促进了抗性基因的水平转移，加剧了养殖环境抗生素抗性基因污染.
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