2016, Vol. 37
2. 四川沃尔宜环保科技有限公司, 成都 610000
2. Sichuan Allvery Environmental Technology Co., Ltd., Chengdu 610000, China
近年来，氮肥施用、畜牧业快速发展及矿物燃料燃烧等人类活动使全球大气含氮化合物成倍增长，导致全球氮沉降量增加[1].氮素作为林木生长的养分限制因子虽可提升林地生产力但过多却会给环境造成压力如导致土壤酸化、水体富营养化、氮素流失、微生物多样性降低及森林蓄积量下降等[2~4]，目前，氮沉降引起的诸多土壤生态环境改变正逐步成为各领域学者研究的热点问题.微生物是土壤生态系统的重要部分，参与物质转化和养分循环，直接影响生态系统的结构和功能，同时对环境变化敏感，土壤微生物作为环境变化的指示因子渐渐引起人类重视[5, 6].氮沉降的土壤微生物效应深受植被类型、土壤性质、海拔梯度与气候差异等因子的影响[7~12]，研究区域不同研究结果各异.刘彩霞等[13]研究结果表明高铵态氮沉降促进土壤微生物PLFA的数量，低硝态氮沉降促进土壤微生物PLFA的数量.Wang等[14]、Contosta等[15]和Treseder等[16]的研究则表明氮沉降抑制了土壤微生物总量.除此之外，有的研究结果表明氮沉降对土壤微生物无影响，Huang等[17]和Zhao等[18]分别研究了氮沉降对草原和尾叶桉土壤微生物数量的影响，结果显示氮沉降并未显著影响土壤微生物数量.可见，氮沉降对土壤微生物群落的影响存在很大的不确定性，需要进一步地深入研究.研究微生物群落结构的方法很多，包括磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)法、Biolog法、DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)法等.本研究采用PLFA法是因为其操作简便，研究结果较为准确、高效且无需分离和培养技术[19, 20]，可定量描述土壤环境中微生物群体[21, 22].
本文以缙云山马尾松林土壤为研究对象，在春、夏、秋、冬这4个季节开展人工氮添加模拟氮沉降试验，研究该区域马尾松土壤微生物群落在不同氮沉降水平下的四季动态特征，以期为分析氮沉降对亚热带森林生态系统的影响提供参考.
1 材料与方法 1.1 研究区概况缙云山国家级自然保护区(106°22′E，29°45′N)位于重庆市北碚区境内(图 1)，距市中心60 km.缙云山占地面积76 km2，海拔350~951.5 m，属典型的中亚热带温暖湿润季风气候.年平均温度13.6℃，最高气温43℃，最低气温-1℃； 年平均相对湿度87%，年平均降雨量1 161.8 mm，年均日照1 293.9 h，干湿季分明.雨季是4~9月(降雨量1 243.8 mm)，其中7~8月是伏旱期(蒸发量255.4 mm)，降雨量小，蒸发量大，试验地2014年7月至2012年5月的月均降水和空气温度[23]如图 2.土壤以酸性黄壤及水稻土为主，伴有少量零星分布的紫色土.区内植物资源丰富，植被种类繁多，森林覆盖率达96.6%.
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图 1 研究样地地理位置示意 Fig. 1 Map of research plots at Jinyun natural conservation region |
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图 2 研究区的月平均降水量和空气温度 Fig. 2 Mean precipitation and air temperature in the study area |
2014年5月，在海拔350~500 m的马尾松林内选取3块面积为20 m×20 m的代表性样地，沿样地对角线确定3个点，于每个点各设置4个1 m×1 m的小样地(间隔＞1m以防相互干扰)作为氮添加处理(不考虑大气氮沉降)样方(图 3).氮添加处理设置了4个水平：对照N0[0 g ·(m2 ·a)-1]、低氮N20[20 g ·(m2 ·a)-1]、 中氮N40[40 g ·(m2 ·a)-1]和高氮N60[60 g ·(m2 ·a)-1]，每个处理各9次重复.分别于当年的7月、11月及次年的2月、5月施入样地中.施氮时将不同浓度NH4NO3溶于1 L水中，采用手提式喷雾器均匀喷洒在每个小样地内，对照样地喷洒等体积清水.为消除流水等对样地氮含量造成影响，施氮时应保证高浓度样方在低浓度样方之下.
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图 3 氮沉降样地设计示意 Fig. 3 Schematic design of nitrogen-loaded research plots |
45年生马尾松林平均密度为每亩35株，平均胸径18.6 cm，平均树高14.1 cm，郁闭度80%.其主要优势乔木为：马尾松(Pinus massoniana Lamb.)； 主要优势灌木为：杉木(Cunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook.)、盐肤木(Rhus chinensis Mill.)、四川山矾(Symplocos setchuensis Brand)、异叶榕(Ficus heteromorpha Hemsl.)、青冈(Cyclobalanopsis glauca (Thunb.) Oersted)、野桐(Mallotus japonicus (Thunb.) Muell.Arg.Var. floccosus S.M.Hwang)、毛桐(Mallotus barbatus (Wall.) Muell.Arg.)、朴树(Celtis sinensis Pers.)、黄牛奶树(Symplocos laurina (Retz.) Wall.)、钝叶柃(Eurya obtusifolia H.T.Chang)、白栎(Quercus fabri Hance)、慈竹(Neosinocalamus affinis (Rendle) Keng f.)等； 主要优势草本为：边缘鳞盖蕨(Microlepia marginata (Houtt.) C.Chr.)、中华里白(Diplopterygium chinense)、粽叶狗尾草(Setaria palmifolia (Koen.) Stapf)、菝葜(Smilax china Linn.)、山莓(Rubus corchorifolius Linn.f.)、尖叶清风藤(Sabia swinhonei Hemsl. ex Forb. et Hemsl)、香花崖豆藤(Millettia dielsiana Harms)等.林下土壤基本理化性质特征见表 1.
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表 1 马尾松林土壤理化性质特征 Table 1 Soil physical chemical properties in the Masson pine forest |
1.3 样品采集与分析
每次氮沉降处理2 d后(待NH4NO3完全渗入土壤中)采集小样地内0~20 cm深度土样(夏、秋、冬、春采样时间为2014年8月1日、2014年11月14日、2015年2月8日及2015年5月7日)，分别混匀同一标准地中相同氮沉降处理的3个土样.当天带回实验室，除去动植物残体，过2 mm筛，储存在4℃用于测定PLFA.
磷脂脂肪酸采用修正的Bligh-Dyer方法[24]，以C19:0做内标，用Aligent 6850气相色谱仪测定，用MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version6.1,MIDI,Inc.,Newark,DE)分析PLFA图谱从而对脂肪酸成分进行鉴定.土壤温度和湿度分别采用ACE自动土壤呼吸监测系统配带的2个土壤温度热电阻探头和2个土壤水分探头SM300进行测量.
1.4 数据处理与统计分析数据分析使用SPSS 18.0、Origin 9.0、Microsoft Excel 2007等软件，采用单因素方差分析法(LSD)比较不同数据组间的差异(P＜0.05).
磷脂脂肪酸含量计算公式：
| $PLFA\left( nmol\cdot {{g}^{-1}} \right)=\frac{A\times S\times V}{SA\times D\times R\times W}$ |
式中，A和SA分别为样品和标准物质的峰面积，S为标准物质的浓度(ng ·μL-1)，D为稀释倍数，R为分取倍数，V为样品的测定体积(μL)，W为烘干土壤质量(g).
根据脂肪酸含量和种类计算丰富度指数(R)[25, 26]、Shannon多样性指数(H′)[26, 27]、Pielou均匀度(J)[25, 26]来评价微生物多样性，公式如下
| $\begin{align} & R=S \\ & H'=-\sum{{{P}_{i}}\ln {{P}_{i}}} \\ & J=H'/lnS \\ \end{align}$ |
式中，Pi=Ni/N，Ni为i类脂肪酸个数，N为该试验中总脂肪酸个数，S为微生物群落中总脂肪酸种类，即丰富度.
细菌标记性脂肪酸有：16 ∶0、cy17 ∶0、16 ∶12 OH、18 ∶0、cy19 ∶0ω8c等，真菌标记性脂肪酸有：18 ∶1ω9c等，放线菌标记性脂肪酸有：10Me17 ∶0、10Me18 ∶0等[13~16]，脂肪酸命名参照文献[28]的方法.
2 结果与分析 2.1 模拟氮沉降对不同种类土壤微生物的影响氮沉降和季节变化对马尾松林土壤微生物有显著影响(P＜0.05)，随季节变化细菌、真菌、放线菌及总PLFA均表现为春季最高，冬季最低，而各类微生物对氮沉降的响应结果各异(图 4).
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大写写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)，小写字母表示同一处理不同季节间差异显著(P＜0.05) 图 4 氮沉降对土壤真菌、细菌、放线菌及总PLFA的影响 Fig. 4 Effects of nitrogen deposition on the PLFA content of different microbial groups |
春季模拟氮沉降结果表明随着氮浓度增加，细菌、真菌及总PLFA表现为直线下降的趋势，而放线菌则表现出先升高后降低的变化趋势.与对照N0相比，N20、N40及N60组细菌分别降低了2.39%、10.97%及20.59%，真菌分别降低了4.40%、8.68%及8.79%，总PLFA分别降低了5.72%、13.77%及21.46%，放线菌则分别升高5.69%、降低25.43%和27.51%.这说明春季低、中及高氮沉降处理降低了土壤细菌、真菌、放线菌及总PLFA.
夏季氮沉降处理后，细菌、真菌、放线菌及总PLFA均呈先升高后降低的变化趋势，N20、N40及N60组细菌分别比对照组N0增加17.20%、17.67%及2.04%，真菌分别比对照组N0增加48.01%、52.49%及31.09%，放线菌分别比对照组N0增加77.70%、降低44.60%和62.59%，总PLFA则比对照组N0分别增加19.01%、17.24%及2.30%.这说明夏季低、中及高氮沉降处理增加了土壤细菌、真菌及总PLFA，而低氮处理增加了放线菌，中、高氮处理则使其降低.
秋季氮沉降处理后，真菌和放线菌呈先升高后降低的变化趋势，N20、N40及N60组真菌分别比对照组N0增加2.48%、降低2.73%和20.25%，放线菌则分别比对照组N0增加126.53%和87.07%、降低3.40%，细菌和总PLFA则均呈直线下降趋势，与对照组相比，N20、N40及N60组细菌分别下降0.48%、10.13%及29.76%，总PLFA则分别下降2.54%、11.58%及31.84%.秋季低氮处理使土壤真菌和放线菌含量增加，使细菌和总PLFA降低，中氮增加了放线菌含量而降低了真菌、细菌及总PLFA含量，高氮使真菌、细菌、放线菌和总PLFA含量均降低.
冬季氮沉降处理后，细菌、真菌、放线菌及总PLFA均表现为先增加后降低的变化趋势，且最大值均出现在N40组，分别比对照组N0增加了8.73%、24.04%、131.08%及15.10%.细菌、放线菌及总PLFA最小值为N60组，分别降低了8.79%、13.51%和1.30%，而真菌最小值则为对照组N0.说明冬季低氮、中氮处理时土壤微生物含量升高，而高氮使其降低.
2.2 模拟氮沉降对土壤微生物群落结构的影响为进一步确定氮沉降水平和季节变化对土壤微生物的影响，本文引用丰富度指数(S)、Shannon-Wiener多样性指数(H′)、Pielou均匀度指数(J)来反映土壤微生物群落结构和功能(表 2).丰富度指数(S)和Shannon-Wiener多样性指数(H′)均为春季最高，冬季最低，而Pielou均匀度指数(J)则表现为秋季最高，夏季最低.
春季氮沉降处理后，S表现为N0＞N40＞N60＞N20，H′呈N0＞N40＞N20＞N60，J呈N20＞N40＞N0＞N60，S和H′最大均为N0处理而J最大则为N20处理，说明低、中氮沉降降低了土壤微生物丰富度指数及多样性指数但提高了微生物分布的均匀度指数，而高氮沉降使丰富度指数、多样性指数及均匀度指数均降低；夏季氮沉降处理后，S表现为N0＞N20＞N40＞N60，H′呈N20＞N40＞N0＞N60，J呈N20＞N40＞N60＞N0，说明低、中氮沉降提高了土壤微生物微生物多样性指数及均匀度指数但降低了丰富度指数，高氮沉降提高了微生物均匀度指数而使丰富度指数和多样性指数降低；秋季氮沉降处理后，S表现为N20＞N40=N0＞N60，H′呈N20＞N40＞N0＞N60，J呈N40＞N0＞N20＞N60，说明低、中氮沉降使微生物丰富度指数及多样性指数增加，中氮沉降使均匀指数升高而低氮沉降使其降低，高氮则使微生物丰富度指数、多样性指数及均匀度指数均降低；冬季氮沉降处理后，S和H′均表现为N40＞N20＞N60＞N0，J则表现为N60＞N40＞N20＞N0，说明冬季低、中、高氮沉降均能提高土壤微生物丰富度指数、多样性指数及均匀度指数.
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表 2 不同氮沉降处理对土壤微生物PLFA群落多样性的季节性影响1) Table 2 Seasonal effects of different nitrogen deposition on soil microbial PLFA community's diversity |
2.3 模拟氮沉降对土壤温度和含水量的影响
氮沉降处理对土壤温度、土壤含水量均有显著影响(表 3).总体而言，随着氮浓度升高，土壤温度和含水量均显著增大.
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表 3 不同氮沉降处理土壤温度和土壤含水量随季节的变化特征1)(平均值±SD) Table 3 Seasonal dynamics of soil temperature and soil moisture at 0-10 cm depth under different nitrogen deposition(mean±SD) |
2.4 土壤微生物与土壤温度、湿度间的相关性分析
土壤微生物群落结构与功能受温度、水分等条件差异的影响.由表 4可知，细菌与真菌、放线菌、总PLFA及土壤湿度呈极显著正相关，与氮沉降浓度呈极显著负相关； 真菌与放线菌和总PLFA呈极显著正相关； 放线菌与总PLFA呈极显著正相关，与土壤温度呈极显著负相关； 总PLFA与土壤湿度呈极显著正相关，与氮沉降浓度呈显著负相关； 土壤温度与土壤湿度呈极显著正相关.
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表 4 土壤微生物PLFA与环境因子的相关系数1) Table 4 Correlation coefficients between soil microbial PLFA and environment factors |
3 讨论
土壤微生物是土壤生态系统中所占比例小但却十分活跃的部分，参与了土壤中各种生化反应，对提高土壤养分利用性和林地生产力具有重要作用[29, 30].土壤微生物群落组成易受土壤温度和湿度等因素影响，土壤水分参与土壤微生物分解土壤有机质的进程，促进养分形态转化，加快土壤中微生物所需养分的运输，决定土壤含氧量高低进而影响土壤微生物量[31].土壤温度影响土壤水分蒸发速率及某类微生物群落对底物的利用率，在土壤湿度一定时，高温限制了氨基转化为硝基，抑制除真菌标记基因外的其他所有基因的表达[32]，从而使微生物群落结构发生改变.本研究发现土壤温度与真菌呈极显著负相关，说明该区域温度对放线菌生物量有明显影响，且随温度增加而降低.诸多研究表明土壤温度和湿度显著影响土壤微生物活性[33~35]，然而也有研究表明土壤温度或土壤湿度并非显著影响土壤微生物，李世清等[36]在研究杨陵土垫旱耕人为土时发现土壤微生物与土壤温度呈极显著正相关而与土壤湿度关系不密切.何容等[37]在研究武夷山不同海拔植被土壤微生物量季节变化动态时发现不同海拔梯度带土壤微生物量与土壤湿度呈显著正相关，与土壤温度相关性不显著.本试验表明土壤湿度与细菌和总PLFA呈极显著正相关，与土壤温度相关性不显著，说明微生物的变化受土壤湿度的影响较大而受土壤温度影响较小.原因是4~9月缙云山降雨量丰富，尽管7~8月属伏旱期，但缙云山植被覆盖率高，丰富的植物群落形成了独特的地区小气候，降低了林下土壤温度，进而减少土壤水分蒸发，使林地土壤中常年保持丰富的含水量，但过多却限制微生物生长，因此影响此区域土壤微生物变化的为土壤湿度而非土壤温度.
土壤微生物数量、组成和结构受氮沉降影响显著.刘彩霞等[13]研究了氮沉降对江西省分宜县杉木幼龄林土壤微生物群落结构的影响，结果发现氮沉降显著改变土壤微生物群落，高铵态氮沉降促进土壤微生物PLFA的数量，低硝态氮沉降促进土壤微生物PLFA的数量.这与本试验夏季低、中、高氮和冬季低、中氮沉降处理结果一致，低、中氮沉降增加了土壤中氮元素的有效性，促进微生物对底物的利用，进而改变了土壤微生物群落结构[38].而同时也有相当研究结果表明氮沉降使土壤微生物量降低，Wang等[14]研究发现氮沉降(+N,20 g ·m-2)明显降低了土壤0~10 cm深处细菌PLFA，G-及G+数量，但增加了10~20 cm土壤细菌PLFA数量，Contosta等[15]研究了同时升温和氮沉降情况下土壤微生物量和群落组成的改变，结果发现氮沉降抑制了土壤微生物总量，Treseder[16]对82个田间施氮试验对土壤微生物的影响进行综合评价，发现氮沉降使微生物生物量平均降低约15%，长期高氮沉降下细菌和真菌亦有降低的趋势，这与本试验春季低、中、高氮沉降、秋季低、中、高氮沉降及冬季高氮沉降处理结果一致.而相当一部分研究结果也表明氮沉降对土壤微生物影响不明显[17, 18].这些结果可能与土壤质地、植被类型、气候(气温、降水等)和地形等综合因素有关.
本研究结果表明4个季节高氮沉降使丰富度指数、多样性指数均和均匀度指数降低，而均匀度指数仅在夏季和冬季表现为升高，多样性指数在冬季也表现为升高； 在春季和夏季，低、中氮沉降使土壤微生物丰富度指数和多样性降低，使均匀度指数升高； 在秋季和冬季，低氮和中氮则使丰富度指数、多样性指数及均匀度指数升高.这可能是由于季节不同环境条件及植物生长状况差异大，秋冬季适量氮沉降有利于土壤微生物的生长，春夏季氮沉降则抑制土壤微生物生长.然而4个季节高氮处理均降低了土壤微生物多样性，说明高浓度氮抑制了大部分微生物种群的生长，致使微生物丰富度指数、多样性指数及均匀度指数均下降.袁颖红等[39]在研究不同氮沉降水平对杉木人工林土壤微生物的影响中也得出了低氮处理提高土壤微生物多样性指数与均匀度指数，而高氮处理使指数降低.该研究结论部分与本研究结论一致，原因是文献[39]的研究时间为2010年3月，跟本试验春季时间一致，研究结论亦相似.总的说来氮沉降有利有弊且季节不同影响也不尽相同，说明我国一些地区的高氮沉降对森林土壤微生物群落产生了一定的影响.
4 结论(1) 氮沉降和季节变化对马尾松林土壤微生物均有显著影响(P＜0.05)，随季节变化细菌、真菌、放线菌及总PLFA均在春季最高，冬季最低.氮沉降对土壤微生物的影响随季节变化而结果各异，总的来说春季和秋季氮沉降低了土壤微生物量，夏季和冬季氮沉降使土壤微生物量升高.
(2) 4个季节高氮沉降使丰富度指数、多样性指数均和均匀度指数降低，而均匀度指数仅在夏季和冬季表现为升高，多样性指数在冬季也表现为升高； 在春季和夏季，低、中氮沉降使土壤微生物丰富度指数和多样性降低，使均匀度指数升高； 在秋季和冬季，低氮和中氮则使丰富度指数、多样性指数及均匀度指数升高.
(3) 细菌与真菌、放线菌、总PLFA及土壤湿度呈极显著正相关，与氮沉降浓度呈极显著负相关； 真菌与放线菌和总PLFA呈极显著正相关； 放线菌与总PLFA呈极显著正相关，与土壤温度呈极显著负相关； 总PLFA与土壤湿度呈极显著正相关，与氮沉降浓度呈显著负相关； 土壤温度与土壤湿度呈极显著正相关.
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