中国西南分布着面积广泛的岩溶区，大部分岩溶区土层很薄，加之岩溶地区管道、 裂隙大量发育，地表水和地下水交换迅速，自净能力较弱^{[1, 2, 3]}. 杀虫剂、 化肥、 生活污水和动物粪便等污染物由降水经含水层带或直接从落水洞进入地下河，在地下河系统中造成化学和微生物(细菌)污染^{[4, 5]}. 微生物来源具有多样性，包括露天的公厕和下水道的人类排泄物以及圈养或散养的牲畜和天然粪肥等^{[6, 7, 8]}，其中最危险的病原微生物大多来自人和动物肠道(即人畜粪便污染). 传统方法上，对于水体粪便污染情况的鉴定主要是利用粪便指示菌(fecal indicator bacteria,FIB)培养(如大肠杆菌)的计数法，但是大肠杆菌为自然界广泛存在的一大类菌群，没有宿主特异性， 因此该方法不能示踪具体的微生物污染来源，只能反映水体的污染程度^{[9, 10]}. 拟杆菌(Bacteroides)于1985年被Fiksdal 证实具有很好的宿主特异性，常在面源污染水域中作为粪便污染源示踪的指示细菌而被广泛使用^{[11, 12]}. 拟杆菌属在人类肠道内的数量占细菌总量的一半以上，远高于肠杆菌属和肠球菌属微生物，更易被提取和识别. 且检测中的一些特异性的分子标记比大肠杆菌的检测更为灵敏，尤其在复杂的自然环境中拟杆菌更适合作为粪便污染指示菌^{[13, 14, 15]}.

南山老龙洞地下河系统位于重庆市南岸区城乡结合部，流域内城市化扩张迅速，同时也存在大量散居居民点和未开发农田. 因此，流域内地下水质受人类活动影响强烈，前期研究结果表明该系统地下水质恶化，其中地下水中的总细菌(total bacteria,TB)、 总大肠菌群(total E.coli,TE)、 粪大肠菌群(total fecal coliform,FC)和粪链球菌群(total fecal Streptocoocci,FS)分别最高达2.9×10⁷CFU ·mL^-1、 4.0×10⁵CFU ·mL^-1、 1.1×10⁶ CFU ·(100 mL)^-1、 1.1×10⁵ CFU ·(100 mL)^-1. 因此本文在此基础上，尝试利用粪大肠菌与粪链球菌的比值(FC/FS)和拟杆菌16S rRNA的PCR-DGGE方法来研究岩溶地下水中(粪便)微生物污染来源.

老龙洞地下河流域位于重庆市南岸区与巴南区境内，北纬29°32′30″，东经106°37′30″. 区域整体地貌类型为背斜低山. 背斜北段西翼陡峻，东翼平缓，呈现“一山二岭一槽”的岩溶景观； 自仙女洞往南，背斜南段则呈现“一山三岭两槽”的岩溶景观. 背斜轴部地层为三叠系下统嘉陵江组碳酸盐岩； 背斜两翼为三叠系中统雷口坡组碳酸盐岩和三叠系上统须家河组砂岩(如图 1).

图 1

Fig. 1

T3xj：上三叠统须家河组砂岩； T2l：中三叠统雷口坡组 碳酸盐岩； T2j：下三叠统嘉陵江组碳酸盐岩图 1 老龙洞流域水文地质、 土地利用方式及采样点分布 Fig. 1 Hydrogeology,land use and distribution of water sampling points of Laolongdong underground river system

老龙洞地下河流域内分布着大量的落水洞、 岩溶洼地、 岩溶裂隙等岩溶形态，流域沿构造线大致呈北东-南西走向，出口处为南山老龙洞风景区. 总长度近13 km，流域面积约20 km²，常年径流量约为50-80 L ·s^-1. 研究区的土地利用方式包括：上游以建筑用地、 餐饮、 学校为主，大部分污水并入城市污水管网； 下游以城乡结合部居民点、 农业用地、 工业用地、 养殖业为主，污水以零星散排为主. 区内人口密集，约为50 000人左右. 经实地调查，流域内分布有多处禽畜养殖厂、 露天公厕，流域内地下河面临着严重的粪便污染. 目前该流域水质的研究进展仅限于水化学指标的分析，而对于微生物及细菌污染特别是人畜粪便污染的调查研究还较为缺乏. 经调查，造成老龙洞地下河流域的粪便污染主要来源于人类及猪. 其中随着研究区居住用地的增加，人类粪便污染比例可能会有所增加.

在2014年1-12月每月采集小院儿井，仙女洞地下河、 龙井磅井、 高东寺1井、 高东寺2井、 犁子磅井、 赵家院子井和老龙洞地下河出口8个点的地下水(如图 2)，水样微生物计数样品使用微生物采样袋(LABPLAS，加拿大)采集水下10 cm以内的地下水水样，冰袋保存带回实验室，4℃保藏，24 h内检测； 水样总微生物DNA样品采集使用无菌过滤器和0.45 μm无菌滤膜(Millipore，美国)过滤水样1-2 L(根据水样洁净程度)，收集滤膜保存于50 mL无菌离心管，冰袋保存带回实验室-20℃冻存至DNA提取； 另外用无菌50 mL离心管采集人粪和猪粪各5个样品，加入无水乙醇保存至DNA提取.

图 2

Fig. 2

图 2 2014年1-12月滤膜法微生物检测结果 (对数值) Fig. 2 Results of microbial detection by filter membrane method in 2014(lgKoc)

地下水样品的粪便指示菌(总细菌、 大肠杆菌、 粪大肠菌和粪链球菌)使用滤膜法检测^{[16, 17, 18, 19]}得到. 总细菌、 大肠杆菌、 粪大肠菌、 粪链球菌分别使用R2A琼脂培养基、 Endos'(品红亚硫酸钠)培养基、 MFC培养基和KF培养基(青岛日水，中国)梯度培养计数.

水样总微生物和人畜粪便样品分别采用水样基因组DNA快速提取试剂盒和粪便基因组DNA快速提取试剂盒(Omega，美国)提取总DNA样品. 粪便样品提取前将人粪和猪粪各5个样品分别混合作为研究区的人粪和猪粪样品代表. 而后，应用特异性引物扩增Bacteroides^{[20, 21, 22]}的16S rRNA基因. 水样使用通用Bacteroides引物(Bac32F、 Bac708R)，人类粪便使用HF183F、 Bac708R，猪粪使用PF163F、 Bac708R. PCR扩增条件: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s,退火30 s(53℃和59℃),72℃延伸60 s,重复30个循环，最后72℃延伸10 min.

凝胶的变性梯度范围为35%-60%，电泳温度60℃. 电泳过程：120 V预跑10 min，而后90 V电泳540 min； 电泳完成后60℃保温并采用银染法对凝胶染色； 最后采用Quantity One软件包分析凝胶电泳图谱. 切胶回收DGGE凝胶上的优势条带，交由生物公司进行克隆测序，测序结果输入NCBI数据库中进行比对.

流域地下水总细菌数达10-2.9×10⁷CFU ·mL^-1，总体来看，各地下水的总细菌数量在夏秋季节明显高于冬春季节，其中小院儿井、 龙井磅井、 高东寺1井、 高东寺2井表现明显，而犁子磅井、 仙女洞井、 赵家院子井和老龙洞地下河出口地下水的总细菌数量全年均处于较高水平. 大肠杆菌数量总含量为4.3-4.0×10⁵CFU ·mL^-1，其季节变化趋势与总细菌数量类似，夏秋季节高于冬春季节. 总细菌和大肠菌群的含量受温度影响较大，这种变化趋势可能与夏秋季节温度较高适于细菌繁殖相关.

粪大肠菌含量达到1.0×10²-1.1×10⁶ CFU ·(100 mL)^-1，远高于国家水质标准(100 mL中不得检出)，小院儿井、 高东寺2井、 梨子磅井、 仙女洞井、 老龙洞井水中粪大肠菌含量全年变化不大，龙井磅井水的粪大肠菌夏秋季节高于冬春季节，而高东寺1井、 赵家院子井水的粪大肠菌秋冬高于春夏. 大部分采样水点的粪链球菌含量较低，含量为1.0×10²-1.1×10⁵ CFU ·(100 mL)^-1，小院儿井、 高东寺1井、 老龙洞出口水的粪链球菌秋冬季节高而春夏季节低，高东寺2井、 赵家院子井和仙女洞水的粪链球菌全年变化不大. 粪大肠菌群和粪链球菌群主要来自温血动物肠道，由于自然界温度低于动物体内温度，在自然状态下难以繁殖，并较少受温度影响，因此其来源主要是输入的差异.

从空间分布来看，地下河中游仙女洞微生物量最低，老龙洞出口地下水中微生物含量最高，其他岩溶地下水的微生物含量居中. 其中仙女洞地下水总细菌年度平均含量为8.8×10³CFU ·mL^-1，老龙洞出口为2.85×10⁶CFU ·mL^-1，其他地井水含量为7.8×10³-5.8×10⁴CFU ·mL^-1. 地下河下游老龙洞出口和东槽水井赵家院子井水的大肠菌群数量最多，年均值分别为2.7×10⁴CFU ·mL^-1和4.0×10⁴CFU ·mL^-1，地下河中游仙女洞以及西槽其他地下水的大肠菌群含量均值较低，为1.8×10³ CFU ·mL^-1和1.0×10³-5.6×10³CFU ·mL^-1. 地下河中游仙女洞和西槽高东寺2井水的粪大肠菌群年均值含量最低，约为1.5×10² CFU ·(100 mL)^-1，西槽高东寺1井水含量最高为1.1×10⁶ CFU ·(100 mL)^-1，地下河下游和其他地下水含量为1.3×10²-6.9×10² CFU ·(100 mL)^-1. 西槽高东寺1井水中粪链球菌含量最高为1.1×10⁵ CFU ·(100 mL)^-1，地下河河水和其他井水中粪链球菌的含量均值均较低，为2.1×10²-6.9×10³ CFU ·(100 mL)^-1(如图 2).

水样与粪便中的总DNA提取后使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，样品DNA都只有一条明亮清晰的条带，说明提取的DNA比较完整，可以用于PCR扩增实验. 接下来以得到的水样和粪便样品基因组总DNA 为模板，选取相应引物，分别进行PCR 扩增. PCR产物电泳结果如图 3，目的指纹条带(750bp)清晰，无非特异性杂带的产生^[23].

图 3

Fig. 3

样品编号: 1小院儿井，2仙女洞地下河，3龙井磅井， 4高东寺1井，5高东寺2井，6犁子磅井，7老龙洞出口， 8赵家院子井，A人类粪便，B猪粪图 3 2014-05水样和粪便样品PCR产物凝胶电泳图 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR product of groundwater samples and fecal samples in May,2014

将PCR产物25 μL进行垂直凝胶梯度电泳(DGGE)(如图 4)，条带的数目在20左右，不同水样之间、 水样和粪便之间、 人粪与猪粪之间的DGGE 图谱的条带位置、 数量和亮度等都存在差异性，且不同样品中的优势种群具有一定相似性^{[24, 25, 26, 27]}. 采用Quantity One对图谱进行优化处理，得到泳道间的对比分析结果，相似性矩阵表(similarity matrix，如表 1)和系统进化树(phylogenetic tree，如图 5).

图 4

Fig. 4

样品编号: 1小院儿井，2仙女洞地下河，3龙井磅井， 4高东寺1井，5高东寺2井，6犁子磅井，7老龙洞出口， 8赵家院子井，9、 10 人类粪便，11、 12 猪粪图 4 2014-05水样和粪便样品DGGE电泳图 Fig. 4 DGGE electrophoretogram of groundwater samples and fecal samples in May,2014

表 1(Table 1)

表 1 2014-05 水样和粪便样品基于非加权算术平均法(UPGMA)的相似性矩阵 1) Table 1 UPGMA-based similarity matrix of groundwater samples and fecal samples in May,2014 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 100.0 2 45.4 100.0 3 33.3 18.7 100.0 4 19.1 32.6 32.6 100.0 5 16.8 53.5 53.5 61.3 100.0 6 18.3 19.3 19.3 49.2 39.5 100.0 7 75.9 41.8 41.8 11.3 7.1 13.7 100.0 8 66.0 57.4 57.4 28.5 22.7 25.3 71.5 100.0 9 64.2 38.3 38.3 15.2 15.0 20.8 69.1 61.1 100.0 10 57.7 35.8 35.8 7.7 7.1 9.1 66.1 59.5 79.5 100.0 11 1.1 2.8 2.8 20.6 20.8 50.4 1.5 4.7 28.1 19.8 100.0 12 1.1 1.6 1.6 31.0 27.2 53.4 1.5 4.0 21.0 13.7 85.3 100.0 1) 样品编号如图 4

表 1 2014-05 水样和粪便样品基于非加权算术平均法(UPGMA)的相似性矩阵 1) Table 1 UPGMA-based similarity matrix of groundwater samples and fecal samples in May,2014

根据相似性矩阵，井水样品与人类粪便样品之间的相似性为7.1%-64.2%，其中小院儿井、 赵家院子井水样的相似性较高，达到60%左右，龙井磅井、 高东寺1井、 高东寺2井、 犁子磅井水样的相似性较低，均为20%左右或低于20%； 两个地下河样品中，仙女洞水样与人类粪便相似性较低(不到40%)，老龙洞出口水样与人类粪便相似性较高(60%以上). 井水样品与猪粪之间的相似性为1.1%-53.4%，其中小院儿井、 赵家院子井水样与猪粪之间的相似性不到10%，犁子磅井水样与猪粪之间相似性高于50%，其它井水样与猪粪之间相似性在20%-40% 之间. 两个地下河水样(仙女洞和老龙洞出口)与猪粪之间的相似性都很低(不到5%).

根据系统进化树图 5可知，所有样品分为人类粪便和猪粪更为相似的两类，其中龙井磅井、 高东寺1井、 高洞寺2井、 梨子磅井水样中Bacteroides(拟杆菌属)的种群特征与猪粪样品具有相对更高的相似性，小院儿井、 赵家院子井、 仙女洞和老龙洞出口水样与人粪样品具有更高的相似性.

图 5

Fig. 5

纵轴样品编号如图 4图 5 2014-05水样和粪便样品聚类分析 (进化树) Fig. 5 Clustering analysis(evolutionary tree)of groundwater samples and fecal samples in May,2014

针对DGGE图谱中不同位置的条带切胶，条带共计13条(如图 4)，将条带中的DNA提取出来克隆测序，测序结果提交与GenBank中的序列进行比对，所得结果如表 2所示. 比对结果可知，13条条带对比相似性为93%-100%之间，均属于拟杆菌门菌株，其中2、 3、 4、 5、 7、 8、 9、 11、 13为Bacteroides，1为Macellibacteroides，4、 6、 12为Prevotella，10为Parabacteroides. 其中，2、 5、 8、 9为同一菌株Bacteroides dorei strain 175的不同片段，为来自人类粪便的拟杆菌. 此外，3、 6、 10、 12、 13也均代表来自人类粪便或肠道的拟杆菌菌株. 1、 7分别从于屠宰场和牛场废水处理厂分离得来. 4、 12为来自自然环境中的拟杆菌菌株. 11为市政污水处理厂活性污泥中分离得到的菌株.

表 2(Table 2)

表 2 PCR-DGGE 条带序列比对结果 1) Table 2 Results of sequence comparison of PCR-DGGE bands 条带 登录号 GenBank 中的最大相似菌株 相似度/% 菌株来源 1 NR_117913.1 Macellibacteroides fermentans strain LIND7H屠宰场废水[28] 100 屠宰场废水 2 NR_041351.1 Bacteroides dorei strain 175人类粪便[29] 100 人类粪便 3 NR_074515.1 Bacteroides vulgatus strain ATCC 8482人类肠道[30] 98 人类肠道 4 NR_113122.1 Prevotella paludivivens strain JCM 13650土壤普氏菌[31] 98 土壤 5 NR_041351.1 Bacteroides dorei strain 175 人类粪便 100 人类粪便 6 NR_113411.1 Prevotella copri strain JCM 13464 人体普氏菌[32] 98 人体普氏菌 7 NR_113069.1 Bacteroides graminisolvens strain JCM 15093牛场废水 100 牛场废水 NR_041642.1 Bacteroides graminisolvens strain XDT-1牛场[33] 8 NR_041351.1 Bacteroides dorei strain 175人类粪便 100 人类粪便 9 NR_041351.1 Bacteroides dorei strain 175人类粪便 100 人类粪便 10 NR_119166.1 Parabacteroides merdae strain ATCC 43184 人类粪便[34] 93 人类粪便 11 NR_125463.1 Bacteroides luti strain UasXn-3市政污水[35] 99 市政污水 12 NR_113118.1 Prevotella oris strain JCM 12252 人类与环境 95 人类或环境 13 NR_041313.1 Bacteroides finegoldii strain 199 人类粪便[36] 100 人类粪便 1) 条带编号见图 4

表 2 PCR-DGGE 条带序列比对结果 1) Table 2 Results of sequence comparison of PCR-DGGE bands

根据流域地下水的粪大肠菌群和粪链球菌群的比值(FC/FS)初步判断粪便微生物污染的来源(如表 3)：小院儿井水春夏主要是以人类粪便污染为主，秋冬为混合污染，以温血动物粪便为主； 高东寺1井水冬春季节以动物污染为主，夏秋季节逐步转变为人类污染为主； 梨子磅井水春夏秋季主要为动物粪便污染和人类粪便污染同时存在，但多数时间人类粪便污染为主，冬季以动物粪便污染为主； 高东寺2井水除2月外全年均表现为动物粪便污染为主； 龙井磅井水全年表现为人类和动物粪便污染交替出现的混合污染的特征； 仙女洞地下水粪大肠菌和粪链球菌含量较少，多数月份无法判断其粪便污染来源，为混合污染型； 赵家院子井和老龙洞出口地下水全年都以人类粪便污染为主.

从时间分布来看，人类粪便对地下河的污染全年都存在，而且是地下河水粪便污染的主要来源. 动物粪便污染冬季最为严重，其次为春秋季节，夏季动物粪便污染最少，绝大部分采样点夏季人类粪便污染严重. 可能受当地养殖生猪数量波动有关，生猪养殖一般半年为期，冬季开始入夏前出栏或入秋开始春节出栏，避开夏季重庆地区炎热生猪生长缓慢期. 因此夏季生猪存栏量少，动物粪便污染较少. 此外，散养家禽(鸡、 鸭、 鹅等)也是动物粪便污染的重要来源，散养家禽多在水池、 洼地、 落水洞、 水渠等环境活动，粪便极易随水直接进入地下水造成污染，这也是全年粪便污染的重要来源.

结合老龙洞流域的各采样点的分布来看(如图 1)，井水的微生物污染来源受水井周边环境和人类活动影响较大，地下河水污染则受到污染补给源的影响较大. 流域西槽的水井小院儿井、 高东寺1井、 龙井磅井靠近居民区，因此更可能受人类生活污水的影响而显示出人类粪便影响为主的特征； 高东寺2井位于菜地中间，主要表现为粪便污染为主，可能原因是受施用动物粪肥的影响. 西槽下游的梨子磅井也位于菜地中间，但是附近有左侧山上猪场下来的排污管道，周边菜地也有人粪有机肥的使用，因此梨子磅井水的粪便污染受养猪场排污和人类有机肥施用影响，FC/FS变化较大. 流域东槽的赵家院子井附近则绝大部分为小型工厂和居民区，家禽家畜散养情况较少，因此大多数时间表现为人类粪便影响为主.

仙女洞上游由于大部分地块为城镇用地和新开发现代居民点，生活污水纳入城市管网，因而进入地下河的污染物较少，且在运移进入地下河过程中受到土壤截留、 地下河底泥吸附等因素的影响，仙女洞天窗段地下河中粪便微生物含量都很少，远低于其上游的小院儿井. 同时，由于FC、 FS含量极少，因而FC/FS比值变化很大，粪便污染来源判断不准确. 老龙洞出口处，汇集全流域的污染排放，尤其仙女洞以下基本为散居居民点，旱厕、 散养家禽、 直排生活污水等广泛存在，因此地下河受人类和动物粪便污染严重，微生物含量为全流域之最. 而中下游各个水井，尤其是东槽赵家院子井粪大肠菌群含量极高，人类粪便污染严重，应与老龙洞出口处大量人类粪便污染相关.

表 3(Table 3)

表 3 基于粪大肠菌(FC)和粪链球菌(FS)比值(FC/FS)的样品污染来源分析 1) Table 3 FC/FS-based sources origin analysis of groundwater samples 日期(月-日) 小院儿井 龙井磅井 高东寺1井 高东寺2井 犁子磅井 赵家院子井 仙女洞地下河 老龙洞出口 01-14 / 0.29★ 0.06★ 0.46★ 0.99☆ 27.5● 0.67★ 289.23● 02-14 89.33● 2.00△ 1.88△ 47.73● 0.57★ 41.9● / 18.24● 03-14 2.99○ 0.99☆ 16.67● 0.27★ 1.10△ 1.40△ 4.55● 1.45● 04-14 3.95○ 0.73☆ 0.40★ 1.82△ 10.24● 0.03★ 2.55○ 4.17● 05-14 33.33● 1.68△ 0.09★ 0.22★ / 31.90● 11.70● 12.82● 06-14 42.50● — 0.21★ — 6.86● 38.89● — 5.77● 07-14 — 2.52○ 1.06△ 1.09△ 5.52● 13.05● 1.21△ 12.24● 08-14 — / 10.10● 0.48★ 0.78☆ 6.63● 1.80△ 23.47● 09-14 0.90☆ 7.79● 10.00● — 1.04△ 3.80○ × 4.38● 10-14 1.63△ 1.21△ 25.41● 0.01★ 52.14● 6.25● 1.21△ 0.09★ 11-14 0.96☆ 0.11★ 4.22 ● 0.65★ 1.04△ 68.75● 1.29△ 1.24△ 12-14 0.87☆ 0.29★ 0.04★ 0.07★ 0.01★ 49.00● 0.21★ 2.78○ 1) FC/FS比值对应的粪便污染来源：≥4(●)人类粪便为主； 2 ＜FC/FS＜4(○)混合污染，人类粪便为主； 1≤FC/FS≤2(△)无法分辨； 0.7＜FC/FS＜1(☆)混合污染，温血动物粪便为主； ≤0.7(★)温血动物粪便为主： “—”代表实验设计梯度过高导致无法计数； “/”代表实验设计梯度过低导致未培养出目标细菌； “×”代表由于自然环境因素未采集样品

表 3 基于粪大肠菌(FC)和粪链球菌(FS)比值(FC/FS)的样品污染来源分析 1) Table 3 FC/FS-based sources origin analysis of groundwater samples

根据地下水和人畜粪便样品Bacteroides群落之间的相似性，可以发现两类粪便同类之内相似性极高，而两类粪便样品之间，相似性较差. 说明人畜肠道中存在的Bacteroides具有较大差异，可以作为区分粪便污染来源的依据^{[37, 38, 39]}. 5月地下水样品树状分类结果(如图 5)与4.1节中应用FC/FS比值得出的结论基本一致. 表 2中地下水样品和粪便之间相似性的加权分析得知粪便样品与地下水样品、 井水样品与地下河样品中Bacteroides群落之间的相似性，反映了粪便污染物对井水和地下河样品粪便微生物来源的贡献.

流域中小院儿井、 赵家院子井和地下河下游老龙洞出口水与人类粪便样品相似性最高达到为64.2%、 61.1%和69.1%，而与猪粪之间的相似性低于5%，说明这三处水样受人类粪便污染为主，受猪粪的影响很小. 地下河中游仙女洞天窗和龙井磅井水与人类粪便样品的相似性为30%-40%，而与猪粪的相似性低于5%，这两处人类粪便仍然为重要污染源，同时其他动物粪便的污染比重增大，但猪粪的影响很小. 高东寺1井和高东寺2井水中，与猪粪样品相似性为20%-30%，与人类粪便污染的相似性仅为10%左右，因此此处其他动物来源的污染可能更多，检测的两种粪便污染源中，猪粪为重要污染来源，人类粪便的污染较少. 梨子磅井水则与猪粪相关性达到53.4%，与人类粪便的相似性仅有10%左右，说明此处猪粪的影响占主导作用，人类粪便影响较少，同时也存在其他动物粪便污染来源.

水力联系上仙女洞为老龙洞上游，二者均以人类粪便污染为主，因此地下河水中的主要粪便污染源为人类粪便或散居居民点的未纳入城市污水管网的人类生活污水. 老龙洞地下河上游的6个井水样点中，高东寺1井、 高东寺2井位于中下游洼地中，以猪粪和其他动物粪便污染为主； 其他4个采样点均位于地下河主河道边缘，除梨子磅外另外3个采样点人类粪便占绝对主导地位. 因此，可以推论，岩溶区虽然土壤较薄，但土壤依然对粪便微生物的污染具有过滤截留作用，所以井水中的猪粪污染大部分被截留未能到达地下河. 老龙洞地下河流域中，靠近地下暗河的居民点、 旱厕等带来的人类生活污水和未处理的人类粪便为主要污染来源，污染物直接通过岩溶裂隙、 管道和落水洞进入地下河造成污染.

根据测序结果发现大部分条带测试所得菌株主要都是与人类相关的菌株. 地下水水样DNA条带中，主要含有的条带是1、 5、 6、 7、 11、 12，分别代表菌株Macellibacteroides fermentans strain LIND7H、 Bacteroides dorei strain 175、 Prevotella copri strain JCM 13464、 Bacteroides graminisolvens strain XDT-1、 Bacteroides luti strain UasXn-3、 Prevotella oris strain JCM 12252. 其中Bacteroides dorei strain 175、 Prevotella copri strain JCM 13464、 Prevotella oris strain JCM 12252最早发现与人类粪便或消化道来源相关； Macellibacteroides fermentans strain LIND7H和Bacteroides graminisolvens strain XDT-1最早发现于屠宰场和牛场废水中，可能与动物粪便来源相关； Bacteroides luti strain UasXn-3为最早发现于市政污水的菌株，应与城市生活污水相关. 其中条带较亮的5、 6、 12都是来源于人类粪便的菌株，11源自于市政污水，说明老龙洞地下河主要受人类粪便污染为主.

(1)南山老龙洞地下河流域，各类细菌含量很高，远超出国家水质标准，流域受人类粪便污染影响为主，其中部分井水也受到多种动物粪便的影响.从空间上来看，采样点中井水的微生物污染来源受水井周边环境和人类活动影响较大，而地下河水的微生物污染则受到污染补给源的影响较大.

(2)流域中小院儿井、赵家院子井水以及地下河下游老龙洞出口地下水受人类粪便污染为主，其他动物粪便的影响较少，而猪粪的影响很小；地下河中游仙女洞天窗和龙井磅井水尽管人类粪便污染仍为其重要污染源，但其他动物粪便的污染比重增大，猪粪的影响很小；高东寺1井和高东寺2井水受其他动物粪便来源的污染可能更多，检测的两种粪便污染源中，猪粪为重要污染来源，人类粪便的污染较少；梨子磅井水主要受猪粪的影响，人类粪便的影响较小，同时也存在其他动物粪便污染来源.