土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，直接参与有机质分解和氮、 磷、 硫等养分的转化利用^[1]，能固氮、 溶磷、 解钾，分泌土壤酶，催化土壤生物化学过程^[2]，在有机质的形成和分解、 养分循环与转化、 土壤肥力演替等方面起重要作用^[3]. 同时，土壤微生物对其生存的微环境十分敏感，能对土壤生态机制的变化和环境胁迫作出反应，是表征土壤有效养分变化的敏感指标之一^{[4, 5, 6, 7]}. 有关土壤微生物的研究在环境科学领域越来越受到关注^{[8, 9, 10, 11]}，近年来学者们利用磷脂脂肪酸(PLFA)方法对土壤微生物群落结构进行研究得到了大量成果^[12,13].

重庆市北碚区西南大学校本部试验农场内的“国家紫色土土壤肥力与肥料效益监测基地”，试 验 基 地 地 处 东 经 106°26′，北 纬30°26′，属紫色丘陵区，方山浅丘坳谷地形，海拔266.3 m，年均气温 18.4℃，全年降水1 105.5 mm，日照1 276.7 h，为亚热带季风气候. 研究区土壤为中性紫色水稻土，水田种植方式为水稻-油菜轮作. 供试土壤基本理化性质见表 1.

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil pH 有机质 /g·kg-1 全氮 /g·kg-1 全磷 /g·kg-1 全钾 /g·kg-1 碱解氮 /mg·kg-1 有效磷 /mg·kg-1 速效钾 /mg·kg-1 6.34 14.8 1.4 0.729 14.9 60.3 41.2 217

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil

于2014年5月在重庆市北碚区西南大学周边农村采集5种成熟作物秸秆(水稻秆、 小麦秆、 玉米秆、 油菜青秆、 蚕豆青秆)，实验室洗净，油菜和蚕豆青秆杀青，全部风干，剪成5 cm左右小段，再60℃烘干至恒重，一部分保存，另一部分粉碎过 1 mm 筛备用. 秸秆样品基本性质见表 2.

表 2(Table 2)

表 2 秸秆样品基本性质 Table 2 Basic properties of the straw samples 秸秆样品 碳 /g·kg-1 氮 /g·kg-1 磷 /g·kg-1 钾 /g·kg-1 碳氮比 小麦秸秆 452.8 3.77 2.36 2.07 120.11 水稻秸秆 395.6 6.56 4.27 16.84 60.30 玉米秸秆 418.9 6.14 6.02 18.48 68.22 蚕豆青秆 392.8 7.38 4.56 7.95 53.22 油菜青秆 385.5 7.94 7.07 32.18 48.55

表 2 秸秆样品基本性质 Table 2 Basic properties of the straw samples

实验选取旱地(D)和水田(P)两种耕作方式，分别将80 g过1 mm 筛的水稻秸秆(D-SD、 P-SD)、 小麦秸秆(D-XM、 P-XM)、 玉米秸秆(D-YM、 P-YM)、 油菜青秆(D-YC、 P-YC)、 蚕豆青秆(D-CD、 P-CD)与2 kg供试土壤混匀，另设不添加秸秆处理作为对照(D-CK、 P-CK)，置于孔径为100目的纯尼龙网袋中，共12个处理，每个处理3个重复. 实验于2014年5月30日将纯尼龙网袋埋入旱地和水田，距离表层土壤5 cm，期间旱地种植莴笋，水田种植水稻. 埋入的纯尼龙网袋于2014年9月30日收割水稻后取出，取出土样存于4℃冰箱保存，并于一周内完成磷脂脂肪酸(PLFA)的测定.

土壤基本理化性质采用常规分析方法^[26]. 借鉴 Bligh等^[27]的方法提取新鲜土壤中的 PLFA，经一系列提取和预处理后，用Agilent 6850气相色谱仪(FID检测器)分析PLFA成分. 色谱条件为: HP-5 柱(25.0 m×200 um×0.33 μm)，进样量1 μL，分流比10 ∶1，载气: H₂，尾吹气高纯N₂，助燃气是空气，流速0.8 mL ·min^-1. 汽化室温度250℃，检测器温度为300℃，柱前压10.0 psi. 升高柱温: 170℃起始，5℃ ·min^-1升至260℃，而后40℃ ·min^-1升至310℃，保留1.5 min. 各成分脂肪酸通过MIDI Sherlock微生物鉴定系统(Version 6.1，MIDI，Inc.，Newark，DE)进行，标准品购于美国MIDI公司的C9-C20的脂肪酸甲酯，PLFA用C19: 0做内标，换算PLFA的绝对含量^[28].

土壤中特定的PLFA标记表征特定微生物. 代表细菌类群的 PLFA有 11:0、 12:0、 13:0、 14:0、 α14:0、 i14:0、 15:0、 i15:0、 α15:0、 16:0、 16:0、 i16:0、 i17:0、 16:1ω7c、 cy17:0、 17:0、 cy17:0等^{[29, 30, 31, 32, 33, 34]}，其中i15:0、 α15:0、 i16:0、 i17:0 代表格兰氏阳性细菌 (G⁺)^[29]，10:0 2OH、 12:0 2OH、 14:0 2OH、 16:0 2OH、 16:1ω7c、 cy17:0、 cy19:0 代表格兰氏阴性细菌 (G^-)^[29]； 代表真菌类群的包括 18:2ω6、 18:1ω9c、 18:1ω9t； 10Me18:0 代表放线菌类群^[35]. 一般饱和脂肪酸以12:0、 13:0、 14:0等之和计，单烯不饱和脂肪酸以16:1ω7c、 cy17:0等之和计，异构PLFA以i14:0、 i15:0、 i16:0等之和计，反异构以α14:0、 α15:0等之和计^[34].

用土壤 PLFA含量计算土壤微生物的种群特征参数，包括物种丰富度指数、 均匀度指数和优势度指数^[36,37].

物种丰富度 Shannon 指数(H)的计算公式为：

其中，P_i=N_i/N，式中，N_i为测定第i种 PLFA 含量，N为该土壤的总 PLFA含量； Pielou 均匀度指数(E)的计算公式为：

式中，S 为该土壤 PLFA类别总数； Simpson 优势度指数(D)的计算公式为：

数据采用 Microsoft Excel 2007、 SPSS 17.0进行处理，用 LSD 法进行多重比较(α=0.05)，制图采用Origin 7.0软件.

由图 1(a)可看出，旱地不同处理土壤PLFA总量以及各菌群(细菌、 G⁺、 G^-、 真菌、 放线菌)PLFA量分布均不同. PLFA总量变幅为8.35～25.15 nmol ·g^-1，添加秸秆处理均提高了土壤微生物PLFA总量，大小顺序为D-YC＞D-CD＞D-XM＞D-SD＞D-YM＞D-CK，其中D-YC、 D-CD分别是D-CK的2.18、 2.08倍，差异显著； 细菌、 G⁺、 G^-、 真菌及放线菌PLFA量变幅分别为4.27～18.49、 1.02～8.74、 1.24～5.89、 0.14～0.39、 8.35～25.15 nmol ·g^-1，5种秸秆处理均提高了土壤微生物各菌群PLFA量，其中D-YM、 D-YC、 D-CD处理的G^-和细菌PLFA量均与D-CK处理差异显著，各处理间G⁺和放线菌PLFA量无显著差异，5种秸秆处理的真菌PLFA量均与D-CK处理差异显著.

图 1

Fig. 1

同系列不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)，下同图 1 不同秸秆翻埋还田对不同土壤PLFA总量和菌群分布的影响 Fig. 1 Influences of different straws returning with landfill on total PLFA and bacterial flora distribution under different farming

由图 1(b)可看出，水田不同处理土壤PLFA总量以及各菌群(细菌、 G⁺、 G^-、 真菌、 放线菌)PLFA量分布均不同. PLFA总量变幅为4.04～22.19 nmol ·g^-1，其中 P-SD、 P-YM、 P-XM较P-CK分别增加3.71%、 7.53%、 4.36%，同时P-CD显著低于其他处理； 细菌PLFA量变幅为2.17～16.70 nmol ·g^-1，其中仅 P-SD、 P-YM高于P-CK，P-CD显著低于其他处理； G^-PLFA量变幅为0.83～4.70 nmol ·g^-1，仅P-CD低于P-CK，且各处理无显著差异； G⁺PLFA量变幅为0.81～8.36 nmol ·g^{- 1}，其中仅P-YC和 P-CD低于P-CK； 真菌PLFA量变幅为0.19～1.11nmol ·g^-1，5种秸秆处理均高于P-CK，且除P-CD外其余处理显著高于P-CK； 放线菌PLFA量变幅为0～0.12nmol ·g^-1，P-CK未检测到放线菌PLFA，其余处理间无显著差异.

同时，旱地和水田之间也有明显不同. 对比图 1可以看出，总体上旱地5种秸秆翻埋还田均有利于提高土壤各菌群PLFA量，油菜和蚕豆表现突出； 而水田则表现相反，小麦、 水稻和玉米秸秆翻埋还田后对土壤各菌群PLFA量与不加秸秆处理无显著差异，油菜、 蚕豆秸秆反而降低了水田土壤各菌群PLFA量.

细菌/真菌、 G⁺/G^-值常用来表征土壤生态系统的稳定性，其值越大，土壤生态系统越稳定^[38]. 吴愉萍^[39]的研究指出微生物在外界胁迫越大，如在高温或是低pH、 低碳源和低氧浓度下，异构PLFA/反异构PLFA值越大. 因此，一般异构PLFA/反异构PLFA的值常被用作反映环境胁迫. 环丙基脂肪酸(cy17:0和cy19:0)对氧气供应状况反应敏感，可作为厌氧环境指标^[40].

从表 3可以看出，旱地土壤异构PLFA/反异构PLFA值以D-YC处理最小，且显著低于D-CK，其次是D-SD，其余处理均显著高于D-CK； 环丙烷PLFA值以D-SD处理最小，除D-XM、 D-YM显著高于D-CK外，其余处理与D-CK无显著差异； 细菌/真菌值以D-YC处理最小，但各处理间无显著差异； G⁺/G^-值以D-CD最小，且5种秸秆处理均显著低于D-CK. 水田土壤异构PLFA/反异构PLFA值以P-XM处理最小，其中P-SD、 P-YC显著高于P-CK，其余处理均显著低于P-CK； 环丙烷PLFA值以P-CD处理最小，且显著低于P-CK，其余处理与P-CK无显著差异； 细菌/真菌值以P-CD处理最小，且5种秸秆处理均显著低于P-CK； G⁺/G^-值也以P-CD处理最小，但各处理间无显著差异. 综合分析可知，秸秆填埋对旱地土壤微生物的胁迫小于水田土壤，油菜秸秆填埋对旱地土壤微生物的胁迫较小，小麦、 玉米秸秆和蚕豆青秆对水田土壤胁迫较小.

表 3(Table 3)

表 3 土壤微生物各类群PLFA比值 Table 3 Rations of different microorganism PLFA contents in soil 处理 异构PLFA/反异构PLFA 环丙烷PLFA/nmol·g-1 细菌/真菌 G+/G- D-CK 0.97±0.02a 0.59±0.05abc 13.2±0.34a 1.23±0.09a D-XM 1.61±0.16c 1.04±0.08c 14.08±0.76a 0.71±0.1b D-SD 0.78±0.05ab 0.31±0.07a 12.3±0.02a 0.74±0.06b D-YM 1.41±0.07c 0.89±0.21bc 12.55±0.37a 0.83±0.03b D-YC 0.55±0.07b 0.45±0.12ab 11.88±0.28a 0.69±0.01b D-CD 1.42±0.02c 0.83±0.16abc 12.28±0.15a 0.67±0.02b P-CK 1.24±0.08a 0.9±0.03ac 49.72±2.26a 1.96±0.61a P-XM 0.58±0.08b 0.33±0.14ab 14.47±2.02bc 1.49±0.05a P-SD 1.49±0.12d 1.23±0.3c 16.89±1.47c 1.9±0.31a P-YM 0.86±0.03c 0.33±0.14ab 17.20±2.00c 1.68±0.10a P-YC 1.36±0.04d 1.27±0.09c 11.20±0.96b 1.32±0.06a P-CD 0.74±0.04bc 0.15±0.02b 10.30±1.04b 1.2±0.10a 1)同列不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)，下同

表 3 土壤微生物各类群PLFA比值 Rations of different microorganism PLFA contents in soil

利用 PLFA含量可计算出土壤微生物的群落特征值 (表 4). 结果表明，不同处理间土壤微生物的物种丰富度、 均匀度和优势度指数有一定的差异. 物种丰富度，旱地和水田的5种秸秆处理均有提高，旱地D-YC、 D-CD处理显著高于D-CK，水田除P-CD外其余处理均显著高于P-CK，同时就相同秸秆来说，5种秸秆均表现为对旱地土壤微生物群落的物种丰富度影响大于水田，尤以蚕豆处理表现明显； 均匀度指数，旱地5种秸秆处理均低于D-CK，水田则表现相反，不同秸秆处理间旱地和水田无显著差异； 优势度指数，旱地仅D-YC、 D-SD处理高于D-CK，但无显著差异，水田除P-CD外其余处理均显著高于P-CK，同时仅蚕豆处理旱地和水田差异显著.

表 4(Table 4)

表 4 秸秆翻埋还田对土壤微生物群落特征的影响 Table 4 Influences of different straws returning with landfill on soil microbial community characteristics 处理 H E D D-CK 2.84±0.06ab 0.93±0.01a 0.93±0.01bc D-XM 2.98±0.06bc 0.87±0.01ab 0.93±0.01bc D-SD 2.90±0.03bc 0.89±0.006ab 0.93±0.002bc D-YM 2.93±0.01bc 0.89±0.01ab 0.93±0.005bc D-YC 3.00±0.04c 0.89±0.006ab 0.94±0.002bc D-CD 3.00±0.01c 0.88±0.01ab 0.94±0.006c P-CK 2.43±0.16a 0.83±0.006b 0.88±0.008a P-XM 2.93±0.04bc 0.88±0.023ab 0.93±0.002bc P-SD 2.81±0.01bc 0.88±0.019ab 0.92±0.003bc P-YM 2.87±0.02bc 0.85±0.015ab 0.92±0.001bc P-YC 2.81±0.02bc 0.88±0.004ab 0.92±0.002bc P-CD 2.66±0.11ab 0.87±0.017ab 0.90±0.018ab

表 4 秸秆翻埋还田对土壤微生物群落特征的影响 Table 4 Influences of different straws returning with landfill on soil microbial community characteristics

根据土壤总微生物PLFA 数据，应用Origin 7.0作 PCA 二维排序图(图 2)，PC1贡献率为 52.72%，PC2贡献率为12.86%，累计贡献率65.58%. 实验共检测出33种PLFA标记物，与PC1呈正相关的标记物高达27种，呈负相关的标记物仅6种，其中i15:0、 16:0、 16:1ω5c、 i17:0、 18:1ω9c、 cy19:0ω8c载荷量较高； 与PC2呈正相关的标记物19种，呈负相关的标记物14种，其中10:0 2OH、 12:0、 14:0、 14:1ω5c载荷量较高.

图 2

Fig. 2

图 2 土壤微生物PLFA主成分分析(PCA) Fig. 2 Principal component analysis (PCA) on soil microbial PLFA

同时，对不同处理土壤微生物PLFA进行主成分分析(图 3)，PC1贡献率为56.81%，PC2贡献率为26.21%，累计贡献率达到83.02%. 样方距离大小表示样方间微生物群落结构的相似程度，距离越近相似程度越高^[41]. 旱地6种处理均与PC1成正相关，其中D-YC、 D-YM处理与D-CK距离相近，其次是D-XM、 D-SD，相隔最远的是D-CD处理，说明蚕豆青秆对旱地土壤微生物群落结构影响最大，这与前面的分析结果一致. 水田除P-YC、 P-XM外其余均与PC1成正相关，其中P-YM与P-CK最相近，微生物群落结构相似程度高，其次是P-CD，最远的P-YC、 P-XM，说明油菜青秆和小麦秸秆对水田土壤微生物群落结构影响最大.

图 3

Fig. 3

图 3 不同处理土壤微生物PLFA主成分分析(PCA) Fig. 3 Principal component analysis (PCA) on soil microbial PLFA in different treatments

秸秆翻埋还田主要依靠土壤微生物进行分解释放养分，因此土壤养分、 秸秆种类和微生物活性三者关系紧密. 本研究结果表明，秸秆翻埋还田提高了旱地土壤中细菌、 真菌和放线菌数量，这与Lou等^[42]研究结果一致. 这是因为秸秆翻埋还田为土壤微生物提供了丰富的碳源和氮源，创造了一个营养充裕的土壤微生态环境，能够催生更多的微生物生长和繁殖，从而使土壤微生物区系和数量发生变化，进而提高土壤的微生物数量和活性^[43]. 同时不同秸秆对土壤微生物群落结构影响也不同，张成娥等^[44]研究表明油菜秸秆腐解速率明显高于水稻秸秆和小麦秸秆，这是因为油菜青秆外表面具有很厚的角质层，且中腔被易腐解的髓填充，而水稻秸秆与小麦秸秆外表面被蜡质层覆盖，腐解速率和养分释放都较慢^[45]，因此本研究中油菜和蚕豆青秆腐解速率相对较大、 养分释放相对较快； 微生物生长对氮源敏感，土壤和秸秆首先要满足微生物氮源供给的充足，胡宏祥等^[46]研究发现油菜秸秆还田后对土壤微生物群落结构影响较大，本研究采用的油菜青秆和蚕豆青秆氮含量较高，C/N值仅为小麦秸秆的0.4倍(表 2)，因此腐解过程中释放的氮含量相对较多，有利于微生物生长，这可能是造成不同秸秆翻埋还田对旱地土壤微生物群落结构影响差异的主要原因.

水田土壤为厌氧环境，而绝大多数土壤常见细菌属于好氧或兼性厌氧型，因此水田土壤微生物群落丰富度不及旱地土壤. 王允青等^[47]研究发现水泡处理下油菜秸秆外面的蜡质层更难腐解，本实验油菜和蚕豆青秆处理细菌/真菌值显著低于其他处理(表 3)，即土壤中细菌处于竞争劣势，养分代谢以真菌占据主导位置，有利于有机质贮存和氮的固持^[41]，从而导致油菜和蚕豆青秆填埋过程对土壤中微生物氮源的供给相对不足，不利于微生物生长. G⁺细菌拥有较厚的细胞壁且能产生孢子，其种群抗压性较强，不易发生变化^[48]，而G^-细菌对碳源较敏感，极易改变^[49]，因此G⁺/G^-值越高，表明土壤环境越适宜微生物生长. 本实验中油菜和蚕豆青秆处理的G⁺/G^-值也低于其他处理(表 3)，说明油菜和蚕豆青秆翻埋还田不利于水田土壤微生物生长.

5种秸秆翻埋还田均能提高旱地土壤微生物PLFA总量以及各菌群(细菌、 真菌、 放线菌、 G⁺、 G^-)PLFA量、 显著提高微生物群落的物种丰富度，其中以油菜青秆和蚕豆青秆对旱地土壤微生物群落结构影响最大； 5种秸秆翻埋还田均显著提高土壤微生物物种丰富度指数和优势度指数，小麦、 水稻和玉米秸秆提高土壤各菌群PLFA量，油菜、 蚕豆青秆反而降低了水田土壤各菌群PLFA量，因此不建议对水田土壤翻埋秸秆，旱地土壤以含氮量高的蚕豆青秆和油菜青秆翻埋还田为宜.

致谢: 感谢王子芳老师、 梁伟师兄在实验期间的帮助.