近年来，用于赤潮的预防、 控制和减缓(PCM)的技术和方法引起了科学界和相应管理机构的重视^{[1, 2]}. 这些技术和方法中，利用植物间化感作用来进行赤潮的预防、 控制和减缓表现出显著的应用潜力. 借鉴于淡水水华控制的研究成果，研究者们将某些陆地植物应用于赤潮微藻治理的研究. 例如，大麦秆浸泡液能显著抑制赤潮微藻的生长^[3]，小麦秸秆抑制棕囊藻(Phaeocystis globosa)^[4]、 凤眼莲根系及其提取物^[5]和玉米秸秆^[6]抑制塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)，玉米叶显著抑制塔玛亚历山大藻、 海洋卡盾藻(Chattonella marina)和赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)的生长^[7]. 前期研究中，发现菹草乙酸乙酯组分显著抑制了米氏凯伦藻(Karenia mikimitoi)、 中肋骨条藻(Skeletonema costatum)和塔玛亚历山大藻的生长^[8]. 研究表明，菹草中存在黄酮^[9]、 生物碱^[10]、 长链脂肪酸^[11]、 脂肪酸甘油酯、 甾体和半日花烷型二萜^[12]等化合物. 目前，已经发现同属光叶眼子菜(Potamogeton lucens)中的某些二萜具有抑制羊角月牙藻(Raphidocelis subcapitata)的抑藻活性^{[11, 13]}. 然而，菹草中抑藻活性物质的分离纯化研究较少^{[11, 14]}，并且尚未见其对赤潮微藻生长的抑制作用等研究.

菹草是一种能改善水环境质量，又能稳定水生生态系统，抑制藻类暴发的沉水植物^[15]，分布广泛. 利用菹草生物防控微藻赤潮，具有安全、 价格优廉的特点. 菹草抑藻活性物质的分离纯化对于利用其进行赤潮防控就尤为重要. 鉴于此，在前期研究基础上，本文以米氏凯伦藻为检测目标，采用硅胶柱层析和硅胶GF₂₅₄薄层层析分离方法，纯化菹草乙酸乙酯组分中的抑藻活性物质. 进一步，应用质谱、 核磁共振碳谱和氢谱等技术，鉴定出2种抑藻活性物质，此2种化合物为首次从菹草中分离得到，也是首次从沉水植物中分离得到. 本研究揭示了菹草乙酸乙酯组分抑制赤潮微藻的化学基础，为利用菹草生物防控赤潮奠定了良好的实验基础和提供了理论依据.

米氏凯伦藻(Karenia mikimitoi)无菌株由中国海洋大学提供，经进一步分离纯化后由江苏省海洋生物技术重点实验室保存，在f/2培养基中培养，培养温度为(20±0.1)℃，光照强度40 μmol ·(m² ·s)^-1，光暗比为12 ∶12.

菹草乙酸乙酯组分的制备参考文献^[8].

天然海水经过脱脂棉和300目筛绢过滤、 煮沸、 冷却，pH 值和盐度分别调节至8.5和30备用(实验所用海水均做如上处理).

无水甲醇、 乙酸乙酯和丙酮为分析纯.

将菹草乙酸乙酯组分加载于硅胶(200-300目)柱层析上(3 cm×40 cm)，氯仿/丙酮/甲酸(15 ∶3 ∶2，体积比)为洗脱剂. 洗脱馏分经减压浓缩和硅胶GF₂₅₄薄层层析检测后，合并收集组分. 将这些再分组分进行硅胶GF₂₅₄薄层层析分离(2次)，展开剂为氯仿/丙酮/甲酸(18 ∶1 ∶5； 15 ∶3 ∶2，体积比)，UV₂₅₄下检测. 抑藻活性检测后，分析抑藻活性样品纯度^[16].

分别加入一定体积的待测溶液(抑藻活性组分和薄层纯样品)到f/2培养基中，混合均匀后，接种米氏凯伦藻，培养混合液总体积为25 mL. 米氏凯伦藻接种细胞数量为(8-11)×10⁴·mL^-1，样品终浓度为16 μg ·mL^-1. 同时，设定添加相同体积甲醇的对照组(注： 甲醇加入体积不超过0.1 mL)，每个培养瓶设定3个平行样. 培养瓶置于GXZ-260B智能型光照培养箱中培养，温度(26±1)℃，光照强度62 μmol ·(m² ·s)^-1，光暗比为12 ∶12. 每天定时摇动培养瓶两次(08：00和16：00，各摇动1次)，每次摇瓶2 min，以防止微藻附壁生长. 每隔一日从培养瓶中取5 μL培养液，用Lugol's试剂固定后，计数藻细胞数量的变化.

参照化合物常用化学鉴定方法，进行生物碱、 酚酸、 脂肪酸、 萜类、 内酯、 鞣酸、 有机酸和糖类等8 种化合物预系统实验.

样品需进行HR-ESI-MS，¹H-NMR和¹³ C-NMR光谱测定. 用Bruker AV Ⅲ 600 质谱仪测定NMR(TMS为标准品)，在LTQ-Obitrap XL光谱仪进行 HR-ESI-MS测定.

实验数据采用SPSS 11.5软件包进行独立样本检验统计分析，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异.

微藻生长抑制率：

菹草乙酸乙酯组分经硅胶柱层析分离，收集到3个组分： Y1、 Y2和Y3. 分离过程和抑藻活性检测结果见表 1. 结果表明，3个硅胶柱层析分离组分中，仅组分Y3具有抑藻活性. 此组分通过硅胶GF₂₅₄薄层层析分离，氯仿/丙酮/甲酸(18 ∶1 ∶5，体积比)为展开剂，收集到6个薄层层析分离组分(Y31、 Y32、 Y33、 Y34、 Y35和Y36). 经抑藻活性检测，组分Y31具有明显的抑藻活性. 以氯仿/丙酮/甲酸(15 ∶3 ∶2，体积比)为展开剂，将此组分再次进行硅胶GF₂₅₄薄层层析分离，制备到2个样品Y311和Y312. 活性检测表明，此2个组分具有抑藻活性. 经纯度检测，样品Y311和Y312纯度已达到薄层纯^[16].

表 1(Table 1)

表 1 菹草抑藻活性物质的分离纯化 1) Table 1 Isolation and purification of antialgal activity substances from Potamogeton crispus 乙酸乙酯组分(2.0 g)，硅胶柱层析(15 ∶3 ∶2，体积比) Y1- Y2- Y3++(0.838 g) 硅胶GF254薄层层析(18 ∶1 ∶5，体积比) Y31++(0.182 g) Y32- Y33- Y34- Y35- Y36- 硅胶GF254薄层层析(15 ∶3 ∶2，体积比) Y311+(0.026 g) Y312+(0.037 g) 1) “-” 没有抑藻活性，“+” 较弱的抑藻活性 (20%-50%),“++” 明显的抑藻活性 (≥50%)

表 1 菹草抑藻活性物质的分离纯化 1) Table 1 Isolation and purification of antialgal activity substances from Potamogeton crispus

在前期研究中，浓度为16 μg ·mL^-1时，乙酸乙酯组分显著抑制了米氏凯伦藻的生长^[8]. 因此，设定本文中抑藻活性组分和薄层纯样品的检测终浓度为16 μg ·mL^-1. 上述结果表明，采用的硅胶柱层析和硅胶GF₂₅₄薄层层析分离方法，适用于菹草乙酸乙酯组分抑藻活性物质的分离纯化. 不过，同时也发现，制备到的抑藻活性物质的得率较低.

由表 2可以看出，样品Y311呈现出黄酮类的阳性反应，样品Y312呈现出生物碱类的阳性反应，进一步采用质谱和核磁共振谱确定此2种样品的结构.

表 2(Table 2)

表 2 菹草抑藻活性样品的化学成分系统预试验检测结果 Table 2 Results of chemical constituents analysis of two antialgal activity samples isolated from Potamogeton crispus 检查种类 检测方法 抑藻活性样品 Y311 Y312 鞣酸试剂 － + 生物碱 硅钨酸试剂 － + 苦味酸试剂 － + 碘化铋钾试剂 － + 三氯化铁试剂 － － 酚类 三氯化铁-铁氰化钾试剂 － － 重氮化试剂 － － 三氯化铁试剂 － － 鞣质 三氯化铁-铁氰化钾试剂 － － 明胶试剂 － － 有机酸 溴酚蓝试剂 － － 溴甲酚绿试剂 － － 异羟污铁试剂 － － 内酯香豆素 重氮化试剂 － － 开环-闭环试剂 － － 三氯化铝试剂 + － 黄酮 醋酸镁试剂 + － 氢氧化钾试剂 + － 三氯化铝试剂 － － 蒽醌 醋酸镁试剂 － － 硼酸试剂 － － 萜类甾体 香草醛-浓硫酸试剂 － － 1)“+”表示阳性反应，“－”表示阴性反应

表 2 菹草抑藻活性样品的化学成分系统预试验检测结果 Table 2 Results of chemical constituents analysis of two antialgal activity samples isolated from Potamogeton crispus

样品Y311白色粉末，图 1(a)为样品Y311的质谱和核磁共振谱. 结果表明，样品Y311分子式为C₁₆H₂₄O₄，白色粉末； ESIMS m/z:303 [M+Na]⁺； ¹H NMR (600MHz,MeOD) δ_H: 3.94 (1H,m,H-2),1.78 (1H,m,H-3a),2.08 (1H,m,H-3b),2.38 (1H,m,H-4a),2.48 (1H,m,H-4b),2.36 (1H,m,H-7a),2.81 (1H,m,H-7b),2.82 (1H,m,H-8a),2.95 (1H,m,H-8b),5.14 (1H,dd,J=8.4,2.4 Hz,H-9),2.42 (2H,t,J=4.2 Hz,H-11),1.45 (2H,m,H-12),1.26-1.28 (6H,m,H-13/14/15),0.85 (3H,t,J=7.8 Hz,3H). ¹³ C APT (150MHz,MeOD) δ_C: 194.7 (C-1),70.7 (C-2),30.1 (C-3),21.9 (C-4),176.1 (C-5),110.7 (C-6),31.3 (C-7),47.9 (C-8),81.7 (C-9),207.7 (C-10),42.3 (C-11),22.9 (C-12),28.8 (C-13),31.1 (C-14),22.0 (C-15),14.0 (C-16). 上述数据与文献^[9]报道Trichodermatides B基本一致，故将Y311鉴定为Trichodermatides B[图 2(a)]. Trichodermatides B是一种聚酮类衍生物，按照表 2化学成分系统预试验进行测试，会呈现出黄酮类的阳性反应. 因此，结构鉴定表明，表 2 中Y311的测试结果是正确的.

图 1

Fig. 1

图 1 样品Y311和Y312的质谱和核磁共振谱图 Fig. 1 HR-ESI-MS,1H-NMR and 13 C-NMR of two antialgal activity samples

图 2

Fig. 2

图 2 样品Y311和Y312的结构 Fig. 2 Structure of two antialgal activity samples

样品Y312黄色油状物，样品Y312的质谱和核磁共振谱见图 1(b). 其中表明，样品Y312分子式为C₁₄H₂₁NO₂； ESIMS m/z:258 [M+Na]⁺； ¹H NMR (600MHz,MeOD) δ_H: 0.89 (3H,t,J=7.1 Hz,H-7),0.95 (3H,d,J=6.0 Hz,H-8),1.26-1.43 (6H,m,H-3/4/5),1.57 (1H,m,H-2),3.78 (1H,m,H-2a),4.21 (1H,m,H-2b),7.49 (2H,d,J=7.8 Hz,H-3',5'),7.68 (2H,d,J=7.8 Hz,H-2',6'). ¹³ C APT (150MHz,MeOD) δ_C: 68.2 (C-1),39.7 (C-2),30.5 (C-3),29.9 (C-4),24.8 (C-5),23.9 (C-6),12.0 (C-7),14.2 (C-8),131.6 (C-2',6'),129.5 (C-3',5'),132.4 (C-4'),167.5 (C-7'). 上述数据与文献^[10]报道2-methylheptylisonicotinate基本一致，故将Y312鉴定为生物碱2-methylheptylisonicotinate [图 2(b)]. 因此，进行化学成分系统预试验时，Y312会呈现出生物碱的阳性反应(表 2).

沉水植物作为水体生态系统中具有重要生态和环境功能的初级生产者^[17]，对水体功能和维持生态平衡有非常重要的作用. 目前，利用水生植物控制藻类主要集中于沉水植物^{[18, 19]}. 菹草是眼子菜科(Potamo-getonaceae)多年生沉水草本植物，生长快，耐污性较强，分布广泛，是冬春季节沉水植被的优势种. 研究报道，菹草中存在黄酮^[9]和生物碱^[10]等化合物. 在本研究中，采用一系列分离方法和光谱技术，分离纯化并鉴定了菹草中的2种抑藻活性物质，Trichodermatides B和2-methylheptylisonicotinate(表 1、 图 1和图 2). 此2种化合物为首次从菹草中分离得到，同时也是首次从沉水植物中分离得到.

Trichodermatides B是一种聚酮类衍生物，目前，已在海泥真菌(Trichoderma reesei)中分离得到^[20]. 研究表明，其具有抗肿瘤活性^[20]，然而，尚未见其抑藻活性报道. 在本研究中，当浓度为16 μg ·mL^-1时，Trichodermatides B能抑制米氏凯伦藻的生长(表 1).

目前，已经发现链霉菌^[21]和陆生植物^[22]可产生2-methylheptylisonicotinate. 研究表明，此化合物具有类似于2,6-二氯异烟酸的功能，可以诱导植物产生系统抗性^[21]，并且可作为杀菌剂，对猝倒病菌等土壤病菌和细菌有效，但并未见此化合物的抑藻活性研究. 在本研究中，当浓度为16 μg ·mL^-1时，2-methylheptylisonicotinate对米氏凯伦藻的生长表现出一定的抑制作用(表 1). 2-methylheptylisonicotinate是1种生物碱，研究表明，菹草中存在生物碱^[10]，然而，目前尚未见菹草生物碱的分离及其抑藻活性研究. 在泉生软管藻(Hapalosiphon fontinalis)^{[23, 24]}、 金鱼藻(Ceratophyllum demersum)^[25]、 侧生藻(Fischerella sp. )^{[26, 27]}、 伊乐藻(Elodea nuttallii)^[28]等沉水植物中均发现了生物碱类化合物的存在. 然而，生物碱抑藻活性的研究较少，且主要集中在淡水微藻^{[25, 26, 27, 28]}，沉水植物生物碱对赤潮微藻的影响研究则更少.

不过，遗憾的是，由于纯化到的2种抑藻活性物质质量较少，未进行抑藻活性物质浓度与其对米氏凯伦藻生长的抑制作用之间关系、 对其它赤潮微藻生长的影响以及抑藻活性机制等研究. 在后续工作中，将进行这些研究，为利用菹草抑藻活性物质生物防控微藻赤潮奠定实验基础和提供理论依据.

(1)采用一系列分离方法，从菹草乙酸乙酯组分中分离纯化到2种抑藻活性物质，当浓度为16 μg ·mL^-1时，它们对米氏凯伦藻表现出一定的抑藻活性.

(2)经鉴定，此2种抑藻活性物质分别为Trichodermatides B和2-methylheptylisonicotinate，此2种化合物为首次从菹草中分离得到，同时也是首次从沉水植物中分离得到.