2025, Vol. 46
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
塑料薄膜广泛应用于农业生产中, 它能促进农作物增产和提高农作物的品质[1]. 从20世纪90年代开始, 我国地膜覆盖面积和使用量均呈现持续增长的趋势. 覆盖面积从1993年的572.19万hm2增至2022年的1 747.09万hm2, 增长了2.05倍, 地膜使用量增加了200万t[2, 3]. 但是传统的聚乙烯塑料地膜使用后易残留在土壤中破坏土壤结构、降低土壤肥力, 严重影响着农业的可持续发展[4]. 近年来, 生物降解地膜（BDM）作为传统地膜的替代品应运而生, 它具有易降解、保温、保湿和防杂草等优点. 该类地膜是以生物降解材料为主要的成分, 在自然条件下能被土壤中的微生物降解并生成二氧化碳和水[5].
聚乳酸/聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PLA+PBAT）类地膜由于具有机械性能好以及易被微生物降解等特性而被广泛应用[6]. 但是, 有研究发现生物降解地膜减少了水芹、小麦和油菜等植物的地面生物量[7]. 还有研究表明生物降解地膜的使用能够提高花生和草莓等作物的产量[7, 8]. Sintim等[9]经过2 a的监测评估发现, 生物降解地膜会对土壤铵态氮、硝态氮等19种土壤理化性质产生影响. 闵文豪[7]发现, 生物降解地膜的使用, 增加了土壤全氮的含量. 目前, 关于生物降解地膜对作物、土壤理化性质影响的研究已经比较深入, 然而关于生物降解地膜对土壤微生物影响的研究却相对较少. 土壤微生物是土壤质量和肥力评估的重要指标, 能够快速反映土壤质量变化情况, 对于土壤养分循环和提高植物生产力起着至关重要的作用[10].
传统地膜的使用能明显影响土壤中细菌群落的多样性、组成以及结构[11, 12]. 有研究发现, 使用传统地膜会增加土壤中变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度, 增加土壤中与人类和动物相关的病原菌的丰度[如诺卡菌（Nocardia）][13]. 还有些研究发现, 使用传统地膜会增加土壤中氮同化速率[14]和提高酶活性[15, 16], 从而对土壤生态系统造成影响. 由此可见, 传统地膜会对土壤细菌群落产生较大的影响. 生物降解地膜作为传统地膜的替代产品有广泛的应用市场, 但其对土壤细菌群落的影响尚不十分清楚. 因此, 深入开展相关的研究十分必要, 这对农业的可持续发展具有重要的意义. 本研究选择实际农田土壤, 对生物降解地膜（PLA+PBAT）进行大田填埋, 利用高通量测序技术（Illumina NovaSeq）检测填埋地膜表面的细菌群落, 分析不同填埋时期细菌群落的α多样性、组成、结构、指示物种、功能和网络, 以期为深入了解生物降解地膜在自然降解过程中微生物群落演替规律和评估生物降解地膜对土壤的影响提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 土壤样品采集本研究在辽宁省某试验站农田中进行, 实验设置两组处理, 每组处理设6个重复. 两组处理分别为：①对照组（CK）（无地膜填埋区域的农田土壤）；②生物降解地膜处理（PBAT+PLA, 厚度为0.008 mm）（H8）. 填埋实验一共进行了75 d, 分别在填埋处理后第30 d（T1, 填埋初期）、第60 d（T2, 填埋中期）和第75 d（T3, 填埋后期）采集对照组土壤与生物降解地膜样品. 样品采集后放入无菌袋中, 将生物降解地膜剪成2 cm×2 cm的薄膜碎片, 用0.85%氯化钠溶液洗掉地膜表面松散的土壤, 之后再利用无菌水稍稍洗涤, 去除表面的氯化钠溶液, 以备提取DNA使用[17].
1.2 DNA的提取、高通量测序和细菌总量的定量准备0.5 g的土壤样品和2 cm×2 cm的薄膜碎片, 然后采用Fast DNA® SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals LLC, USA）试剂盒进行DNA的提取[18]. 采用NanoDrop 2000分光光度计（中国杭州奥盛仪器有限公司）以260/280 nm（1.8~2.0）和260/230 nm（> 1.7）的吸光度比值来评价DNA的质量和浓度. 提取的DNA放入-80℃冰箱保存, 用于之后的16S rRNA基因测序[19, 20]. 本研究使用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGT AA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对保存的DNA样品进行扩增[21]. PCR扩增的反应体系、反应的条件参数以及纯化和测序均按照文献[21]的步骤进行实验. 纯化后的样品在美格生物技术有限公司（中国广州）的Illumina NovaSeq 6000平台（Illumina Inc., USA）上进行测序[22]. 微生物的定量测定选用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法[23], 对待测样品中的总细菌量进行定量. 荧光定量（qPCR）的引物序列为：Forward：5′-CCTACGGGAGGCAGCA G-3′；Reverse：5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′. 按照杜雄峰等[23]的研究步骤, 在CFX96触控实时PCR仪上进行实验.
1.3 测序数据的分析在https://dmap.denglab.org.cn/网站对样品的原始测序数据进行处理, 并且进行细菌多样性、物种组成、共有物种、LEfSe和功能注释等分析, 在http://inap.denglab.org.cn/网站完成了网络分析, 利用SPSS进行了多样性的显著性分析. 本研究对3个时期CK和H8处理的独有和共有的OTUs进行分析[24]；选用香农指数（Shannon）、丰富度（Richness）和Chao1值来分析细菌群落的α多样性[25, 26]；通过基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维排列分析（NMDS）和优势物种相对丰度分析, 揭示细菌群落结构与组成的变化规律[17]；通过FAPROTAX对细菌群落的功能进行分析[27]；采用线性判别分析（linear discriminant analysis effect size, LEfSe）, 寻找组间差异最大的分类群生物标志物[[28]；采用基于随机矩阵理论的分子生态网络进行分析, 对CK和H8处理中细菌的互作关系进行研究[29].
2 结果与分析 2.1 细菌群落多样性与结构分析本研究对对照土壤和生物降解地膜样品进行高通量测序, 共得到654 490条高质量的序列. 如图 1所示, CK处理中的细菌群落的香农指数、丰富度和群落Chao1指数显著大于H8处理中细菌群落的多样性指数（P < 0.05）. 在H8处理中, 填埋初期（T1）细菌群落的α多样性指数均显著高于（P < 0.05）填埋中期（T2）及填埋后期（T3）. 在CK处理中的细菌群落的香农指数、丰富度指数和群落Chao1指数随着时间的增加没有显著的变化. NMDS分析的结果如图 2（a）所示, CK和H8处理中的细菌群落结构存在显著差异（MRPP, P < 0.01）且沿着第一坐标轴分布. 这表明与CK处理相比, H8处理中细菌群落结构发生显著的变化. H8处理在3个时期细菌群落结构差异较大, 样品点沿第二坐标轴自上而下分布. 这表明细菌群落随着地膜填埋的时间增加, 群落结构也发生了较大的变化. 由图 2（b）可知, H8处理中细菌总量低于CK处理. H8处理中的细菌总量随着填埋时间的增加逐渐增加, 且不同填埋时期之间差异显著（P < 0.05）. 而CK处理中的细菌总量随着时间没有明显变化.
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不同小写字母表示各组分间的差异显著（P < 0.05）, T1、T2和T3表示不同填埋时期 图 1 不同填埋时期对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中细菌群落的α多样性指数 Fig. 1 The α diversity indices of bacteria communities in CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
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（a）细菌群落的结构, （b）细菌总量；不同小写字母表示各组分间的差异显著（P < 0.05）, T1、T2和T3表示不同填埋时期 图 2 不同时期对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中细菌群落的结构和细菌总量 Fig. 2 Bacteria community structure and total bacterial copy number of CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
样品中共检测到来自39个门、85个纲、132个目、309个科和996个属的细菌. 其中, 变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、奇古菌门（Thaumarchaeota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）为优势菌门（相对丰度 > 1%）, 见图 3（a）. 亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）、噬氢菌属（Hydrogenophaga）、Gp6、Gp4、贪噬菌属（Variovorax）、拟节杆菌属（Paenarthrobacter）、分支杆菌属（Mycobacterium）、Gaiella、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和假节杆菌属（Pseudarthrobacter）为优势菌属（相对丰度 > 1%）, 见图 3（b）. 在门水平上, 变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）在H8处理中的丰度显著高于CK处理, 表明它们在生物降解地膜表面得到了富集. 在属水平上, 噬氢菌属（Hydrogenophaga）和贪噬菌属（Variovorax）的相对丰度在H8处理中显著高于CK处理且在T1~T2时期, 随时间增加而增加.
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图 3 不同时期的不同优势菌门和属在对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of dominant bacterial phyla and genera in CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
本研究使用花瓣图显示出不同时期CK和H8处理中细菌OTUs的重合情况. 由图 4可知, 不同时期CK和H8处理中细菌OTUs数目各不相同. CK和H8处理中3个时期重复的OTUs有1 826个, 其中门水平物种主要来自变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）, 属水平物种主要属于亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）和贪噬菌属（Variovorax）. CK处理中3个时期重复的OTUs有7 823个, 主要来自变形菌门（Proteobacteria）和亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）. H8处理3个时期共有2 235个OTUs（图 4）, 主要来自变形菌门（Proteobacteria）、噬氢菌属（Hydrogenophaga）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）.
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（a）对照土壤中的细菌OTUs, （b）生物降解地膜H8表面样品中细菌OTUs, （c）所有处理的细菌OTUs 图 4 不同时期对照土壤、生物降解地膜H8表面样品和所有处理中的细菌OTUs Fig. 4 OTUs of bacterial communities in CK soil, BDM (H8) surface samples, and all treatments at different periods |
本研究采用LEfSe选取4为LDA的阈值来分析CK和H8处理中的指示物种. 根据结果可知, 指示物种在不同的时期均不相同（图 5）. 在填埋初期, H8处理相比CK处理中差异显著的类群是假节杆菌（Pseudarthrobacter）和食酸菌属（Acidovorax）；填埋中期是贪噬菌属（Variovorax）和分支杆菌属（Mycobacterium）；在填埋后期是噬氢菌属（Hydrogenophaga）和黄色金线菌（Chryseolinea）. 和H8处理相比, 在填埋初期CK处理中差异显著的类群是亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）、Gp4属、Gp6属和Gaiella属（图 5）. 以上类群可以被看做是该阶段的指示微生物.
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图 5 不同时期对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中的生物标志物 Fig. 5 Biomarkers in CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
基于FAPROTAX对CK和H8处理中的细菌群落进行功能预测, 共分析了56种功能. 本研究挑选其中重要的23种功能进行可视化, 主要包括能量代谢、氮代谢、碳代谢和病原菌相关功能等. 与CK相比, H8处理在填埋初期和中期的功能类群里, 发酵、芳香族化合物降解、甲醇氧化、甲基营养、尿素分解等和碳代谢相关的功能类群增加, 这表明生物降解地膜表面细菌群落的碳代谢功能可能在填埋的初期和中期被增强（图 6）. 此外, 在填埋中期发现了较多的与病原菌相关的功能类群.
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图 6 不同时期对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中细菌群落的功能 Fig. 6 Functional analysis of bacterial communities in CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
如表 1所示, CK处理中的总节点数（1 899~2 245）和总边数（11 697~31 728）远大于在H8处理中细菌群落网络的总节点数（542~613）和总边数（1 002~2 234）. CK处理中有更高的平均度（avgk）和平均聚类系数（avgCC）、更短的测量距离（hd）和更小的模块化值. 另外, 在图 7上可以看出CK处理中细菌群落网络比H8处理中的细菌群落网络更大更复杂. 随着时间的变化, H8处理中的总节点数和总边数先减少后增加. 从填埋初期到填埋后期, H8处理中正相关连接数减少, 负相关连接数增加, 且H8处理中的负相关连接数多于在CK处理. 这表明, H8处理中的细菌之间的竞争更加激烈. 在H8处理中的细菌群落网络中, 填埋初期的关键物种主要包括克雷伯氏菌属（Klebsiella）和Xenophilus属等；填埋中期的关键物种包括热单胞菌属（Thermomonas）等. 填埋后期的关键物种包括鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Anderseniella属等. 以上关键物种主要来自变形菌门（Proteobacteria）的细菌.
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表 1 分子生态网络的拓扑特性 Table 1 Topological characteristics of molecular ecological networks |
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图 7 不同时期对照土壤和生物降解地膜H8表面样品中的细菌网络 Fig. 7 Bacterial network in CK soil and BDM (H8) surface samples at different periods |
本研究发现H8处理中的细菌α多样性显著小于CK处理, 且多样性指数在填埋的中后期显著减少（图 1）, H8处理中的细菌群落结构会随着时间变化发生显著变化[图 2（a）]. Li等[30]发现, 地膜表面的微生物群落结构会发生显著的变化. 地膜进入土壤后, 其表面能够降解地膜的细菌也会逐渐地富集. 还有研究表明, 地膜填埋到土壤里, 其表面细菌的α多样性会随着时间的增加而显著减少[13, 31]. Šerá等[32]也发现生物降解地膜的添加会影响土壤中细菌的总量. 这可能是因为生物降解塑料作为外来的碳源改变了土壤中营养物质的结构进而影响了细菌群落的多样性、结构和细菌的总量[33].
对细菌群落组成进行分析发现, 在门水平上H8处理中的优势菌门为：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）细菌相对丰度随时间显著增加[图 3（a）]. Zhao等[17]的研究发现, 变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的细菌是生物降解地膜表面的优势菌门. 变形菌门（Proteobacteria）是有机物的主要分解者, 它们具有降解合成聚合物的能力[34]. 鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）可以富集在生物降解地膜的塑料际中, 包含许多与降解相关的酶[35], 且与生物降解地膜的降解相关[36]. 此外, 在共有物种分析中发现, CK和H8处理中3个时期共有的OTUs主要来自于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）和贪噬菌属（Variovorax）；CK处理中3个时期共有的OTUs主要来自于变形菌门（Proteobacteria）和亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）；H8处理中3个时期共有的OTUs主要来自于变形菌门（Proteobacteria）、噬氢菌属（Hydrogenophaga）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）. CK和H8处理中的共有物种都是优势菌门和优势菌属. 亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）是土壤硝化作用的重要驱动者, 能够影响N2O释放从而影响氮循环[37, 38].
LEfSe的结果显示, H8处理在填埋中期的指示物种是贪噬菌属（Variovorax）, 在填埋后期的指示物种是噬氢菌属（Hydrogenophaga）（图 5）. 有研究表明, 贪噬菌属（Variovorax）具有高度多样化的分解代谢能力, 可以降解有机聚合物以及聚酯的单体, 具有降解地膜的功能[39, 40]. 还有研究发现, 噬氢菌属（Hydrogenophaga）广泛分布在芳香族化合物污染的环境中, 具有分解多环芳烃污染物的能力[41]. 最近, 孙娇等[42]发现它能够在需氧和厌氧条件下降解高分子量多环芳烃且在铁还原厌氧条件下可以显著降解芳香族碳氢化合物. 具有芳香族化合物降解功能的细菌可以把塑料地膜中的聚合物当作碳源来利用, 会在地膜表面逐渐富集[43]. 在本研究中, 芳香族化合物降解功能类群的丰度在填埋处理样品中增加了, 这与徐松等[44]的研究结果一致. 此外, 本研究还发现了尿素分解这种和碳代谢相关的功能细菌在地膜表面丰度增加. 这表明生物降解地膜进入土壤中可能会促进碳、氮循环过程.
地膜的加入会改变细菌的结构, 降低细菌群落网络的复杂度[45]. 地膜表面的细菌网络具有比土壤较少的节点和边、平均度和平均聚类系数[46]. CK处理中, 碳源种类较多且十分复杂, 使得该样地样品中细菌群落网络较为复杂. 有研究发现, 负相关连接数增加表明细菌群落中竞争占主导地位, 物种之间的竞争效应增强[47]. 地膜进入土壤后作为外加碳源, 细菌将大分子长链有机物分解成更易被细菌利用的短链小分子有机物[48]. 地膜表面中大量的细菌均与地膜组分代谢相关, 导致细菌群落网络相对简单. 还有研究发现, 生物降解地膜的填埋可能会促进生态位的分歧, 增强扩散限制从而减少细菌的相互作用、降低细菌群落网络的复杂性和增加模块化值[47]. 通过网络分析, 本研究还发现变形菌门（Proteobacteria）的物种是H8处理中最丰富的关键物种类群. 有研究表明, 变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的细菌能够降解高分子有机化合物[49]. 变形菌门（Proteobacteria）中的绿脓杆菌属（Pseudomonas）和放线菌门（Actinobacteria）的Gordonia属等细菌能合作降解石油烃污染物[50]. 还有报道称, 变形菌门（Proteobacteria）中的寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和放线菌门（Actinobacteria）的微杆菌（Microbacterium）等细菌能合作降解纤维素[51]. 这些研究表明变形菌门能够参与多种污染物的降解.
4 结论（1）生物降解地膜填埋后显著地改变了土壤细菌的群落结构、组成, 降低了细菌群落多样性及细菌总量. 其中, 变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、奇古菌门（Thaumarchaeota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）为优势菌门.
（2）在填埋初期H8处理中的指示物种是假节杆菌（Pseudarthrobacter）和食酸菌属（Acidovorax）；填埋中期的指示物种是贪噬菌属（Variovorax）和分支杆菌属（Mycobacterium）；填埋后期的指示物种是噬氢菌属（Hydrogenophaga）和黄色金线菌（Chryseolinea）. 随着填埋时间的增加, H8处理中与芳香族化合物降解相关的功能类群增加.
（3）与CK处理相比, H8处理中细菌群落网络的复杂性下降, 模块化值增加和竞争性变强. H8处理中的关键物种有克雷伯氏菌属（Klebsiella）、Xenophilus属、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Anderseniella等.
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