随着我国生态文明建设日益取得突破, 城镇污水处理厂的数量和污水的处理率逐步提高. 目前, 污水问题已经得到了较有效地解决, 然而, 处理污水的同时产生的污泥量也在与日俱增. 预计2020~2025年间, 我国污泥年产量将突破8 000万t(含水率80%计). 我国城市污水处理厂常见的污泥处理工艺包括厌氧消化、好氧发酵、机械浓缩和脱水干化等^[1], 其中厌氧消化不仅能将污泥有机物减少约50%^[2], 还能产生清洁能源沼气, 被认为是污水处理厂实现碳中和的重要技术之一^{[1, 3]}.

厌氧消化包括4个阶段, 分别是水解、发酵产酸、产氢产乙酸和产甲烷过程^[4]. 污泥中易降解的有机物大多被束缚于细胞或胞外聚合物中^[5], 若直接进行厌氧消化处理, 有机物降解速率较慢, 发酵周期较长, 有机物降解率只能达到30%~40%^[6], 减量化和资源化的效果较差. 有研究报道污泥中有机物水解是主要限速步骤^{[5, 7 ~ 9]}, 并通过物理、化学或生物方法对污泥进行预处理来加速污泥水解过程. 在众多的预处理技术中, 热水解预处理技术已被证实可以增加污泥中易降解有机物浓度^[6], 缩短厌氧消化反应时间^[7], 提高有机物固体去除率^[8], 进而提高厌氧消化效率. CambiTHP、Exelys、BioThelys、LysoTherm和TurboTec等多项热水解预处理技术被应用到污泥处理过程^{[10 ~ 12]}, 能够最大限度地减少污泥量, 降低污泥处置成本, 实现了污泥的高效利用.

厌氧消化是一个多种微生物共同作用过程, 特定微生物的活性和相互之间的代谢平衡是影响厌氧消化效率的重要因素^{[13, 14]}. 污泥热水解处理时, 蛋白质中的有机氮和有机硫转化至液相并部分水解为氨氮及硫化氢逸出^[15]. 在厌氧消化所有反应中, 产甲烷菌生长速度慢, 对氨氮浓度等最敏感^[16]. 赵晶^[17]研究发现, 热水解污泥消化罐中降解蛋白质和多糖的发酵产酸菌逐渐增多, 同时嗜氢型产甲烷菌丰度逐渐增加并占据优势. 了解和掌握厌氧消化微生物与热水解处理条件之间的关系, 有助于富集和调控特定微生物, 提高厌氧消化工艺效率.

本研究选取北京市大兴区某污水处理厂初沉污泥和剩余活性污泥分别进行不同时间的热水解预处理, 采用高通量测序技术对厌氧消化前后污泥中微生物群落结构进行分析, 通过掌握热水解时间的影响规律, 以期为污泥热水解工艺升级方案制定提供数据支持.

初沉污泥、剩余活性污泥样品取自北京市大兴区某污水处理厂, 取回后进行离心脱水处理, 含水率达到83%~85%. 热水解预处理装置如图 1所示, 将离心后的初沉污泥、剩余活性污泥分别加入两侧反应罐, 打开阀门控制蒸汽流量调节反应罐压力为0.6 MPa(温度160℃), 计时15、30和45 min, 共计3个批次. 污泥闪蒸并冷却至室温后, 调整含水率为92%, 放置在4℃冰箱冷藏储存.

图 1

Fig. 1

1.锅炉；2.反应罐；3.闪蒸罐；4.压力表 图 1 热水解预处理装置示意 Fig. 1 Thermal hydrolysis pretreatment device

厌氧消化接种污泥需进行20~30 d的驯化, 稳定后的消化污泥静置14 d左右, 待污泥完全不产气后进行接种.

TS和VS采用标准重量法进行测定^[18]；pH值采用pH计测定. 总COD、总蛋白质和总碳水化合物需经匀浆机匀浆后待测, 可溶COD、可溶蛋白质和可溶碳水化合物需取样品于50 mL离心管经9 000 r·min^-1, 15 min离心后, 取上清液经0.45 μm膜过滤后测定. COD采用哈希试剂-快速测定法；蛋白质采用Folin-酚试剂法测定^[19]；碳水化合物采用苯酚-硫酸法测定. 北京市大兴区某污水处理厂初沉污泥和剩余活性污泥的性质见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 污水处理厂污泥性质1) Table 1 Characteristics of sludge in wastewater treatment plants 污泥类型 含水率/% VS/TS/% pH值 ρ/mg·L-1 COD总 COD可溶 蛋白质总 蛋白质可溶 碳水化合物总 碳水化合物可溶 初沉 97.8 63.5 7.11 78 885 250 16 288 169 7 135 71 剩余活性 99.0 63.1 6.82 82 700 330 20 966 102 9 344 63 1)污泥COD、蛋白质和碳水化合物浓度均为含水率92%时测量值

表 1 污水处理厂污泥性质1) Table 1 Characteristics of sludge in wastewater treatment plants

将采集的污泥样品提取总DNA后, 委托北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序. MiSeq测序得到的是双端序列数据, 将双端序列拼接为单端的扩增子序列, 筛选去除冗余序列和错误序列, 并校正序列方向, 得到有效代表性序列. 将所得序列进行相似性分析, 按照USEARCH11-uparse算法对序列在97%的相似度水平下进行聚类划分, 获得OTU. 根据OTU数据, 对初沉污泥和剩余活性污泥中物种多样性和群落丰富度指数进行计算.

对污水处理厂11个污泥样品的门水平和属水平优势物种进行可视化分析, 以探究厌氧消化过程中微生物群落结构变化, 及热水解时间对厌氧消化系统中微生物的影响. 在属水平上, 采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)^[20]和Spearman相关性分析探究微生物群落结构和4个环境因子(消化进泥可溶蛋白质、消化进泥pH值、消化出泥氨氮、热水解时间)之间的响应关系.

污水处理厂11个污泥样品分别是初沉污泥(CY)、剩余活性污泥(SY)、驯化后消化污泥(XY)、初沉消化污泥(C1)、热水解160℃-15 min初沉消化污泥(C2)、热水解160℃-30 min初沉消化污泥(C3)、热水解160℃-45 min初沉消化污泥(C4)、剩余活性消化污泥(S1)、热水解160℃-15 min剩余活性消化污泥(S2)、热水解160℃-30 min剩余活性消化污泥(S3)和热水解160℃-45 min剩余活性消化污泥(S4). 11个污泥样品按照最小样本序列数36 861抽平后, 共检测到总计51门、143纲、315目、506科和919属. 污水处理厂不同污泥微生物群落的α多样性指数见表 2, 对反映微生物群落丰富度指数和物种多样性指数进行了计算. Coverage指数表示样本的测序深度, 11个污泥样本的Coverage指数均大于0.99, 表明测序深度足够, 数据结果可靠. Chao指数表示微生物丰富度, Shannon指数表示微生物多样性, 如表 2所示, 污泥XY的Chao指数低于污泥CY和污泥SY, 污泥XY的Shannon指数低于污泥CY和污泥SY, 表明消化污泥的微生物群落丰富度和多样性低于初沉污泥和剩余活性污泥. 由此推断, 厌氧条件下的选择压更大, 较少种类微生物能够在此条件下生存. 不同热水解时间的初沉消化污泥的Chao指数平均值(1 318)低于剩余活性消化污泥(1 525), 但是显著性检验发现并无差异(P = 0.23), 同样地对不同热水解时间初沉消化污泥和剩余活性消化污泥的Shannon指数进行显著性差异检验, 结果显示无显著性差异(P = 0.62).

表 2 (Table 2)

表 2 污泥样品α多样性分析 Table 2 The α analysis of sludge samples 指数类型 CY SY XY C1 C2 C3 C4 S1 S2 S3 S4 Chao 1 871 1 605 1 364 1 412 1 354 1 267 1 238 1 733 1 281 1 521 1 564 Shannon 5.43 4.94 4.03 3.65 3.73 3.60 3.08 3.99 3.41 2.76 3.33 Coverage 0.992 0.992 0.994 0.992 0.991 0.993 0.993 0.996 0.991 0.996 0.996

表 2 污泥样品α多样性分析 Table 2 The α analysis of sludge samples

初沉污泥和剩余活性污泥在厌氧消化前后门水平上的菌群分布如图 2所示. 从中得出, 污泥CY中优势类群主要分布在Chloroflexi(绿弯菌门, 22.3%)、Proteobacteria(变形菌门, 20.8%)、Actinobacteriota(放线菌门, 15.7%)和Acidobacteriota(酸杆菌门, 10.0%), 相对丰度之和为68.8%；污泥SY中的优势类群主要分布在Acidobacteriota(酸杆菌门, 32.3%)、Chloroflexi(绿弯菌门, 14.8%)、Planctomycetota(浮霉菌门, 13.9%)和Proteobacteria(变形菌门, 13.2%), 相对丰度之和为74.2%. 马切切等^[21]和杨思航等^[22]均报道, Chloroflexi和Proteobacteria普遍存在于污水处理过程, 参与有机物的降解与转化, 所以在污泥CY和污泥SY中的相对丰度都很高. 污泥XY、污泥C1和污泥S1中优势类群主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、阴沟单胞菌门(Cloacimonadota)、绿弯菌门(Chloroflexi)和同力菌门(Synergistota), 相对丰度之和分别为68.4%、70.7%和67.7%. 相较于污泥XY, 污泥C1中优势菌门的相对丰度升高2.3%, 污泥S1中优势菌门的相对丰度降低0.7%, 表明剩余活性污泥有利于增加厌氧消化过程微生物多样性. 以上结果显示, 污泥CY、污泥XY和污泥S1优势菌门相对丰度之和超过60%, 污泥C1和污泥SY优势菌门相对丰度之和达到70%以上, 呈现出少数优势物种的高丰度特征.

图 2

Fig. 2

(a)初始污泥, (b)剩余活性污泥 图 2 厌氧消化前后门水平微生物菌群分布 Fig. 2 Microbial community composition at phylum level in sludge anaerobic digestion system

在属水平下, 不同热水解时间初沉污泥和剩余活性污泥消化后微生物菌群分布如图 3所示. 消化污泥中相对丰度最高菌属为W5, 属于阴沟单胞菌门(Cloacimonadota), 占比为20.8%~54.5%, 是中温产甲烷反应系统中的优势物种^[23], 能够生产乙酸和氢气^[24], 通过同力菌门(Synergistota)协同共生作用与氢营养型产甲烷菌密切合作^[25]. 相比较污泥XY、污泥C2-C4和S2-S4中的W5相对丰度均增加, 且相对丰度随初沉污泥热水解时间的增加逐渐增加, 污泥S3的相对丰度增加得最多. 厚壁菌门(Firmicutes)包括：norank_Firmicutes、D8A-2、Dethiobacteraceae、Fastidiosipila、Syntrophomonas和Caldicoprobacter等优势菌属, 具有水解和酸化污泥中蛋白质、碳水化合物和脂肪等复杂有机物的功能^{[26, 27]}. 厌氧消化后, 污泥中norank_Firmicutes、D8A-2、Fastidiosipila和Caldicoprobacter相对丰度均呈现减少趋势. 这可能是由于污泥经过热水解预处理, 大量存在于固体中的有机物转变为可溶态有机物^[7], 发酵初期Firmicutes在可溶性有机物含量高的环境中会快速增长^[27], 厌氧发酵结束时系统内的有机物几乎消耗殆尽, Firmicutes的相对丰度减少.

图 3

Fig. 3

图 3 不同热水解时间下消化污泥属水平微生物菌群分布 Fig. 3 Microbial community composition at genus level in digested sludge with different thermal hydrolysis pretreatment times

污泥中丰度较高的古菌类群为广古菌门(Euryarchaeota), 本次监测全部产甲烷菌均属于广古菌门(Euryarchaeota). 如图 3所示, 在属水平下, 消化污泥微生物相对丰度前3的产甲烷菌属分别是Methanospirillum、Methanobacterium和Methanosarcina, 其中Methanospirillum和Methanobacterium为嗜氢型产甲烷菌^[28], Methanosarcina属于嗜乙酸型产甲烷菌^[28]. 由图 3可得, 污泥C2 ~ C4和污泥S2 ~ S4中嗜氢型产甲烷菌的相对丰度高于嗜乙酸型产甲烷菌. Pasalari等^[13]综述112项研究结果得出嗜氢型产甲烷菌比嗜乙酸型产甲烷菌具有更强的鲁棒性. Gagliano等^[29]研究发现蛋白质水解菌与嗜氢产甲烷菌存在共生关系, 在高温厌氧发酵过程中占主导地位. 厌氧消化后, 污泥C2 ~ C4和污泥S2 ~ S4中Methanosarcina的相对丰度减少了一半以上, Methanosaeta的相对丰度低于0.5%. Kim等^[30]对3个大型厌氧沼气池中微生物群落结构进行了研究, 结果发现所有消化池中以氢型产甲烷途径占据绝对优势. Kim等^[30]分析认为当乙酸浓度低于1 mmol·L^-1时, 更加适合嗜乙酸型产甲烷菌科(Methanosaetaceae)的生长. 污泥经过热水解预处理, 乙酸浓度可达到5~20 mmol·L^-1, 会影响Methanosaetaceae产甲烷. 另外, 经检测该污水处理厂污泥中含有30%~40%的蛋白质, 热水解预处理后, 氨氮浓度会升高进而影响产甲烷过程. Wang等^[16]和Meng等^[31]研究发现嗜乙酸产甲烷菌对氨抑制更敏感, 同时嗜乙酸产甲烷菌的缺乏会加剧VFAs的积累与氨抑制. Lv等^[32]通过同位素标记法研究发现高氨氮浓度时, 嗜乙酸产甲烷途径会受到抑制. 除此之外, W5和Acetomicrobium等优势菌属均能够利用反应过程有机物生产氢气^{[24, 33]}, 为嗜氢型产甲烷菌提供反应底物, 促进CH₄产生. 综上所述, 在热水解污泥厌氧消化产甲烷过程中, 嗜氢产甲烷为主要途径.

污泥中微生物多样性指数与环境因子的Pearson相关系数分析结果如表 3所示. 结果显示, Chao丰富度指数与Shannon多样性指数之间呈正相关关系. Shannon多样性指数与消化进泥可溶性蛋白质呈显著负相关, 与热水解时间呈负相关. 从相关性系数得出, 热水解时间对Chao指数的影响较大, 呈负相关关系. 热水解时间与Chao丰富度指数和Shannon多样性指数均呈负相关, 表明较长热水解时间不利于厌氧消化过程微生物菌群.

表 3 (Table 3)

表 3 污泥多样性指数与环境因子的Pearson相关系数1) Table 3 Pearson correlation coefficient between diversity index and environmental factors in sludge SP pH TAN t Chao指数 Shannon指数 SP 1 pH -0.731* 1 TAN 0.739* -0.601 1 t 0.856** -0.494 0.618 1 Chao指数 -0.264 0.244 0.249 -0.303 1 Shannon指数 -0.806* 0.500 -0.598 -0.686 0.238 1 1)*表示显著相关, 0.01 ≤ P < 0.05, **表示极显著相关, P < 0.01；pH为消化进泥pH值, TAN为消化出泥氨氮, SP为消化进泥可溶蛋白质, t为热水解时间

表 3 污泥多样性指数与环境因子的Pearson相关系数1) Table 3 Pearson correlation coefficient between diversity index and environmental factors in sludge

在属水平上, 对污泥中微生物进行RDA冗余分析(如图 4)和Spearman分析(如图 5). 图 4结果所示, 相对丰度最高的W5、Proteiniphilum和Bacteroidetes_vadinHA17与消化进泥可溶性蛋白质、消化出泥氨氮和热水解时间之间夹角小于90°, 呈正相关关系. 由Spearman分析进一步得出, 相对丰度最高的W5、Proteiniphilum和Bacteroidetes_vadinHA17与3个环境因子的相关系数介于0.390~0.857. 以此推断, W5等不仅能够适应热水解污泥中高有机物含量, 将大分子有机物转化为简单有机物, 还对氨氮等具有耐受性, 在厌氧消化过程中更具有竞争力. 如图 5所示, Methanobacterium与消化出泥氨氮呈显著负相关, 与消化进泥可溶性蛋白质和热水解时间呈负相关, Spearman相关性系数分别为-0.857、-0.738和-0.488. 同样地Methanospirillum与消化出泥氨氮、消化进泥可溶性蛋白质和热水解时间均呈负相关, Spearman相关性系数分别为-0.690、-0.405和-0.146. 结果表明, 消化出泥氨氮对产甲烷菌属的影响最大, 消化系统中的氨氮越高, 越易出现氨抑制.

图 4

Fig. 4

红色箭头为环境因子, 蓝色箭头为优势菌属 图 4 属水平的微生物与环境因子的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of microorganisms and environmental factors at the genus level

图 5

Fig. 5

pH为消化进泥pH值, TAN为消化出泥氨氮, SP为消化进泥可溶蛋白质, t为热水解时间；色柱为Spearman等级相关系数；X轴为环境因子, Y轴为优势菌属；*表示0.01 < P ≤ 0.05, **表示0.001 ≤ P < 0.01 图 5 污泥性质与优势菌属物种相关性Heatmap图 Fig. 5 Spearman correlation heatmap between characteristics of sludge and dominant bacteria

(1) 不同热水解时间, 初沉消化污泥和剩余活性消化污泥的Chao指数和Shannon指数无显著性差异(P > 0.05).

(2) 污水处理厂污泥中优势类群(门水平)相对丰度之和超过60%, 呈现出少数优势物种的高丰度特征.

(3) 热水解污泥厌氧消化过程中, 高VFAs和氨氮浓度导致嗜乙酸产甲烷菌Methanosarcina和Methanosaeta的相对丰度均减少, 嗜氢型产甲烷菌的相对丰度高于嗜乙酸型产甲烷菌, 推测嗜氢产甲烷为主要途径.

(4) 热水解时间与Chao指数和Shannon指数均呈负相关关系, 较长热水解时间不利于厌氧消化过程微生物菌群. 消化出泥氨氮对产甲烷菌属的影响最大, 呈负相关关系.