2024, Vol. 45
2. 稻米品质安全控制湖南省工程实验室, 长沙 410004
, HU Yu-dan1 , ZHOU Hang1,2
, CHEN Qiong1 , TAN Wen-tao1 , ZENG Peng1,2 , GU Jiao-feng1,2 , LIAO Bo-han1,2
2. Hunan Engineering Laboratory for Control of Rice Quality and Safety, Changsha 410004, China
据2021年《中国环境生态状况公报》显示, 全国农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属, 其中镉（Cd）为首要污染物[1].Cd具有高毒性、易积累、不可降解性等特点[2, 3].Cd可通过大气沉降、污水灌溉、农药及肥料施用等途径进入农田土壤[4]；当土壤Cd积累达到一定程度时, 就会对农作物产生毒害作用, 降低农作物品质和农田生产力, 并通过食物链传递危害人类健康[5].水稻属于易吸收富集Cd的大宗粮食作物, 据报道食用稻米已成为人体Cd摄入的最主要途径[6, 7].因此, 急需研发易操作且有效可行的技术方法修复Cd污染稻田, 实现农田安全利用和水稻安全生产.
锌（Zn）与Cd属于同族元素, 二者核外电子构型相同, 具有相似的化学性质和离子半径, 在同一环境之下, 离子之间会产生交互作用[8].当Zn与Cd共存于土壤环境, 竞争力较强的Zn2+会占据土壤胶体上的结合位点[9].朱波等[10]发现当土壤溶液中Zn浓度为Cd浓度10倍时, Cd吸附量降低50%, 表明高浓度Zn明显抑制紫色土对Cd的吸附.Zn是植物生长必需的微量营养元素, 在植物生长发育过程中起着重要作用[11].由于Zn与Cd同为二价元素, 性质相似, 在植物体内可以相互取代, 导致Zn与Cd在植物体内存在竞争或拮抗作用[12].Köleli等[13]发现Zn通过与Cd竞争与关键细胞成分（即酶、膜脂质和蛋白质）的结合, 并改善植物对Cd诱导的氧化应激的抗氧化防御, 从而保护植物免受Cd毒害.植物体内存在Zn和Cd共享ZIP族转运蛋白（如IRT1和IRT3）, 而Zn与Cd对于相同的转运蛋白竞争激烈[14].由于农作物对Zn的吸收是主动运输, 而对Cd的运输主要是被动运输, 因此Zn对根细胞膜吸附位点和根部运输通道的竞争能导致植物对Cd吸收量下降[15, 16].然而有研究者发现, Zn对于水稻Cd吸收在某些条件下存在着协同作用[17].Wang等[18]发现当Zn2+浓度为32.0 μmol·L-1和56.0 μmol·L-1时, 水稻地上部Cd含量与根部Cd含量比值显著增加（P < 0.05）, 表明添加过多的Zn会促进根系Cd向地上部位转移, 过量Zn与Cd在水稻体内存在协同作用, 从而可能增加水稻Cd积累风险.目前, 有一些研究利用叶面喷施Zn肥[19]和土壤基施Zn肥[20]来降低水稻Cd吸收积累.在水稻开花期叶面喷施ZnSO4处理能使水稻籽粒中Cd含量显著下降16.9%~28.5%[21].应金耀等[22]通过田间试验发现, 土壤基施Zn肥对轻、中度污染土壤生长的水稻籽粒中Cd积累有明显的抑制作用, 分别比对照下降了37.04%和28.21%.Huang等[23]研究发现, 在土壤基施Zn肥75.0 kg·hm-2处理下, 使土壤中CaCl2可提取Cd含量在盆栽试验中降低32%~64%, 在田间试验中降低16%~30%.
水稻是一种湿生作物, 水稻整个生育期需要灌溉水0.75~1.05 m3·m-2（约500~700 m3·亩-1）[24].然而, 在水稻关键生育期施加外源Zn灌溉水是否可降低水稻对Cd吸收和转运还需进一步开展研究.因此, 本文以湖南省浏阳市某Cd污染稻田为研究对象, 分析在水稻Cd积累关键生育期（孕穗期和灌浆期）施加外源Zn灌溉水, 探讨其对土壤交换态Cd含量、土壤孔隙水Cd浓度以及水稻各部位Cd吸收与转运的影响, 以期为Cd污染稻田安全生产提供技术支撑.
1 材料与方法 1.1 供试土壤和材料选择湖南省浏阳市某Cd污染稻田（28°17'25″N, 113°52'55″E）开展田间试验.该地属于中亚热带季风湿润气候, 年平均降水量1 400~1 700 mm, 平均温度16.8~17.5 ℃.供试稻田土壤基本理化性质见表 1.供试水稻品种为常规籼晚稻黄华占, 由湖南金色农丰有限公司提供.本试验中Zn选用七水合硫酸锌分析纯（ZnSO4·7H2O）, 由国药集团化学试剂有限公司提供.
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表 1 供试稻田土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested paddy soil |
1.2 试验设计
本试验共设置7个处理, 分别为孕穗期前施加含Zn 20 mg·L-1或100 mg·L-1的灌溉水（B1和B2）、灌浆期前施加含Zn 20 mg·L-1或100 mg·L-1的灌溉水（F1和F2）以及孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1或100 mg·L-1的灌溉水（BF1和BF2）, 以不添加Zn的原灌溉水为对照（CK）, 试验各处理设置见表 2.每个试验处理重复3次, 共21个样方, 每个小区面积为3 m × 3 m, 随机排列, 单排单灌.在水稻孕穗期前或灌浆期前, 各试验处理按表 2中设置方式于各样方中分别施加0.45 m³含Zn灌溉水, 并在水稻孕穗期和灌浆期维持田间表面水层高度为5 cm左右.田间沟渠中原灌溉水Cd和Zn浓度分别为1.63 μg·L-1和84.23 μg·L-1, 原灌溉水Cd和Zn浓度远低于《农田灌溉水质标准》（GB 5084-2021）中总Cd和总Zn限值标准0.01 mg·L-1和2.0 mg·L-1.水稻种植管理按照传统农业耕作模式进行基肥的施加和病虫害防治等措施.
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表 2 试验设计 Table 2 Experimental design |
水稻于2020年7月中下旬插秧, 2020年10月26日收获.在每个样方水稻根际附近以60°的角度插入3根土壤孔隙水采样器（Rhizon MOM）, 将采样器连接到25 mL塑料注射器以提取土壤孔隙水.分别于分蘖期（2020年8月13日）、拔节期（9月1日）、孕穗期（9月15日）、灌浆期（9月29日）、蜡熟期（10月13日）和成熟期（10月26日）采集水稻生长期间土壤孔隙水, 并使用0.45 μm滤膜进行过滤, 于4℃保存待测.
水稻成熟后, 每个样方按5点取样法采集5株水稻, 置于尼龙网袋, 水稻植株用自来水、纯水和超纯水洗净, 105℃杀青, 然后在70℃下烘干至恒重.用小型脱谷机将水稻谷粒脱壳, 然后将水稻植株分为根、茎、叶、谷壳和糙米这5个部位分别称取干重, 粉碎后用塑料密封袋保存待测.同时采集根际土壤, 自然风干, 磨碎, 过10目和100目尼龙筛, 分别用塑料密封袋保存待测.
1.3 样品的分析测定土壤pH采用酸度计（PHS-3C, 雷磁）测定[25]；土壤有机质采用水合热重铬酸钾氧化-比色法测定[26]；土壤有效态Cd和Zn含量（CaCl2-Cd和CaCl2-Zn）采用0.01 mol·L-1 CaCl2溶液提取[27]；土壤孔隙水采用土壤孔隙水采样器（Rhizon MOM, 农环科技（上海）有限公司）提取；根表铁膜中Cd、Zn和Fe采用连二亚硫酸钠-柠檬酸三钠-碳酸氢钠（DCB）试剂提取[28]；水稻植株各部位中Cd和Zn含量采用干灰化法消解（GB/T 5009-2010）.采用石墨炉原子吸收分光光度计（240Z, Agilent）测定水稻植株消解液中Cd浓度及土壤孔隙水中的Cd和Zn浓度, 所有土壤样品溶液中Cd和Zn含量采用ICP-AES（ICP6300, Thermo Fisher）测定.以国家标准物质土壤[GBW（E）-070009]和大米[GBW10045（GSB-23）]进行质量控制, 样品Cd和Zn的回收率分别为98.6%~102.1%和98.4%~101.8%.
1.4 数据统计与分析采用Office 2016、SPSS 20和Origin 2021软件进行数据处理和图表绘制, 结果表示为平均值±标准偏差（n = 3）.在P < 0.05和P < 0.01显著水平下进行F检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）、Duncan多重比较和Pearson相关性分析.水稻各部位间转运能力以转运系数（translocation factor, TF）表示, 即后一部位重金属含量（C）与前一部位重金属含量的比值, 如TF根-茎 = C茎/C根, 式中C根表示根干样的重金属含量, C茎表示茎干样的重金属含量, 单位是mg·kg-1.
2 结果与分析 2.1 关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻生物量的影响从表 3中可看出, 关键生育期施加外源Zn灌溉水增加了水稻各部位生物量.与CK相比, 水稻茎、叶、谷壳、糙米和地上部位生物量分别增加了8.9%~28.8%、9.1%~32.3%、2.6%~26.2%、3.7%~11.1%和6.4%~18.5%, 但仅B1和B2处理下水稻茎部生物量较CK处理相比显著增加.相较于施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水, 施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水对地上部位生物量的增幅更大, 说明施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水更能促进水稻生物量的增加.
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表 3 关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻生物量的影响1） Table 3 Effect of applying irrigation water containing Zn on rice biomass at key growth period |
2.2 关键生育期施加外源Zn灌溉水对土壤Cd和Zn有效性的影响
关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下, 土壤中CaCl2-Cd和CaCl2-Zn含量的变化见图 1.在孕穗期和灌浆期, 施加外源Zn灌溉水各处理土壤中CaCl2-Cd含量略高于对照CK, 但均无显著性差异, 表明关键生育期施加外源Zn灌溉水对土壤有效Cd无显著影响.与CK处理相比, 施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水各处理（B1、F1、和BF1）土壤中CaCl2-Zn含量增加85.7%~162.2%, 施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水各处理（B2、F2、和BF2）土壤中CaCl2-Zn含量增加220.0%~887.3%, 表明关键生育期施加外源Zn灌溉水可显著提升土壤有效Zn, 且施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水对土壤中Zn的有效性增幅更大.
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不同小写字母表示在P < 0.05水平上差异显著, 下同 图 1 关键生育期施加外源Zn灌溉水对土壤中CaCl2-Cd和CaCl2-Zn含量的影响 Fig. 1 Effect of applying irrigation water containing Zn on the contents of CaCl2-Cd and CaCl2-Zn in soil at key growth stage |
关键生育期施加外源Zn灌溉水降低了土壤孔隙水Cd浓度, 增加了土壤孔隙水Zn浓度（图 2）.在CK处理下, 土壤孔隙水中ρ（Cd）随着时间的延长总体呈上升趋势（0.73~9.42 μg·L-1）.与CK处理相比, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理使孕穗期、灌浆期、蜡熟期和成熟期土壤孔隙水Cd浓度分别降低了14.7%~73.7%、44.3%~87.9%、25.1%~69.0%和16.7%~57.6%；其中, BF1处理下水稻孕穗期、蜡熟期和成熟期土壤孔隙水Cd浓度降幅最大.关键生育期施加外源Zn灌溉水可显著增加土壤孔隙水中Zn浓度.与CK处理相比, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下水稻孕穗期、灌浆期、蜡熟期和成熟期土壤孔隙水中Zn浓度分别增加了23.0%~1 073.6%、70.9%~597.5%、74.3%~596.0%和61.0%~414.3%；其中, B2和BF2处理下水稻孕穗期土壤孔隙水Zn浓度增幅均明显大于其他处理, BF2处理下灌浆期、蜡熟期和成熟期土壤孔隙水Zn浓度增幅最大.这些结果表明, 在孕穗期前和灌浆期前均施加外源Zn灌溉水在显著提升土壤孔隙水Zn浓度的同时显著降低了土壤孔隙水Cd浓度.此外在孕穗期至灌浆期土壤孔隙水中Zn浓度急速下降, 表明这两个时期是水稻大量吸收营养物质的阶段.
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图 2 关键生育期施加外源Zn灌溉水对土壤孔隙水中Cd和Zn浓度的影响 Fig. 2 Effect of applying irrigation water containing Zn on Cd and Zn concentration in soil pore water at key growth stage |
关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下根表铁膜中Cd含量较CK处理相比下降了9.8%~26.5%, 而根表铁膜中Zn含量增加了22.7%~162.0%（图 3）, 表明关键生育期施加外源Zn灌溉水可降低水稻根表铁膜中Cd含量, 而增加根表铁膜中Zn含量.相较于B1、F1和BF1处理, B2、F2和BF2处理下水稻根表铁膜中Zn含量均有所增加, 表明关键生育期施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水能使水稻根表铁膜中Zn含量增幅更大.B1、B2、F1和F2处理下水稻根表铁膜Fe含量与CK相比无显著差异, 而BF1和BF2处理下水稻根表铁膜Fe含量分别增加24.5%和77.2%, 表明在孕穗期前和灌浆期前均施加外源Zn灌溉水可增加根表铁膜中Fe含量.
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图 3 关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻根表铁膜中Cd、Zn和Fe含量的影响 Fig. 3 Effects of applying irrigation water containing Zn on Cd, Zn, and Fe contents in iron plaque on rice root surface at key growth stage |
从图 4可看出, 关键生育期施加外源Zn灌溉水可降低水稻各部位Cd含量, 增加各部位Zn含量.与CK相比, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下水稻根、茎、叶、谷壳和糙米中Cd含量分别降低2.8%~56.0%、4.8%~83.8%、13.6%~43.9%、6.3%~62.9%和3.6%~85.2%, Zn含量分别增加2.5%~180.9%、46.1%~190.1%、4.5%~78.8%、2.1%~56.2%和13.6%~22.9%, 表明施加外源Zn灌溉水在促进水稻Zn吸收的同时降低了水稻对Cd的吸收.相较于B2、F2和BF2处理, B1、F1和BF1处理下水稻各部位Cd含量降幅更大, 且BF1处理下糙米中ω（Cd）为0.126 mg·kg-1, 低于国家食品污染物限量标准（0.2 mg·kg-1）, 说明在孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水阻控水稻对Cd吸收效果最佳.
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图 4 关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻Cd和Zn吸收的影响 Fig. 4 Effect of applying irrigation water containing Zn on Cd and Zn uptake by rice at key growth stage |
关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻各部位间Cd和Zn转运系数（TF）的影响见图 5.F1和F2处理下水稻各部位间的Cd转运系数较对照CK相比均无显著差异, 表明仅在灌浆期前施加外源Zn灌溉水无法有效抑制水稻对Cd的转运.与CK处理相比, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下水稻根-茎之间Cd转运系数有所降低（B2处理除外）, 但施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水比施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水的Cd转运系数更低.与CK处理相比, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下水稻根-茎之间的Zn转运系数有所增加（除BF2处理）, 茎-叶、茎-谷壳和茎-糙米间的Zn转运系数减小, 表明水稻中Zn主要存储在茎部.在BF1处理下, Cd的TF根-茎最小, 为0.035, 表明BF1处理下水稻体内的Cd基本固定在根部.因此, 在孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水能有效阻止水稻体内的Cd向糙米转运.
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图 5 关键生育期施加外源Zn灌溉水对水稻Cd和Zn转运系数的影响 Fig. 5 Effect of irrigation water containing Zn on Cd and Zn transport coefficient in rice at key growth stage |
Zn是植物生长必不可少的微量营养元素[29], 在正常生长的情况下, Zn不仅能促进植物的光合作用[30], 还能促进细胞内各种蛋白质和酶的合成[31].有研究表明, 施Zn可增加植物产量[32, 33].在本研究中, 关键生育期施加外源Zn灌溉水处理下水稻地上各部位生物量与CK处理相比均有一定程度增加（表 3）, 说明施加外源Zn灌溉水能够促进水稻的生长.
关键生育期施加外源Zn灌溉水可显著增加土壤中CaCl2-Zn含量（图 1）和孔隙水Zn浓度, 显著降低土壤孔隙水Cd浓度（图 2）.本研究中, 灌溉水中含有大量的Zn2+, 从而有效提高土壤中CaCl2-Zn含量.Cd与Zn有相同的离子半径及较为相似的化学性质, 二者均为土壤中氧化物、粘土矿物及阳离子交换吸附点的主要竞争者[34].有研究表明, 施加Zn可提供更多的Zn2+来竞争Cd2+的吸附点位, 使Cd2+从土壤胶体上解吸, 从而增加土壤有效态Cd含量[9].本研究结果中, 关键生育期施加外源Zn灌溉水仅略微提高了土壤中CaCl2-Cd含量, 但无显著差异.原因可能是Cd的水合离子半径比Zn小, 土壤对Cd2+的吸附能力比Zn2+强, 仅只有少部分Cd2+在吸附点位解吸[35], 故土壤中CaCl2-Cd含量未显著增加；该研究结果与应金耀等[22]和辜娇峰等[36]的一致.关键生育期施加外源Zn灌溉水降低了孔隙水Cd浓度（图 2）, 其原因一方面可能是在淹水条件下, 氧化还原电位（Eh）较低, SO42-易还原成S2-, 与Cd产生CdS沉淀, 从而降低土壤孔隙水中可溶性Cd浓度[37, 38].另一方面, 当土壤从淹水还原状态过渡到湿润氧化状态, 由于土壤Eh值升高, CdS和ZnS等金属硫化物都会发生氧化溶解[39], 此时CdS（361 mV）和ZnS（243 mV）之间由于电化学势不同而构成原电池[40].在ZnS-CdS构成的原电池中, 因ZnS电化学势低于CdS[23], 作为原电池阳极则优先发生氧化溶解, 释放出电子传递给CdS, 抑制作为阴极的CdS的氧化溶解, 从而抑制了土壤孔隙水中Cd浓度的增加[41].在孕穗期前和灌浆期前均施加外源Zn灌溉水, 淹水时间比单一时期施加灌溉水的淹水时间长, 能更好地降低孔隙水中Cd浓度[38, 42, 43], 本研究中BF1处理下孕穗期、蜡熟期和成熟期土壤孔隙水Cd浓度降幅最大.因此, 施加外源Zn灌溉水能有效抑制土壤Cd向土壤孔隙水的释放过程.
关键生育期施加外源Zn灌溉水增加水稻各部位Zn含量, 显著降低水稻各部位中Cd含量（图 4）, 表明水稻对Cd和Zn的吸收和转运存在明显的竞争和拮抗作用.Zn主要通过3种途径抑制糙米中Cd的累积.首先, Zn可通过竞争根表皮细胞质膜上的转运蛋白减少对Cd的吸收, 如ZIP家族的OsIRT1[44]和OsZIP9[45]两种转运蛋白, 是非特异性蛋白, 可以吸收转运Cd2+和Zn2+.其次, Cd进入水稻根系之后, 液泡膜转运蛋白OsHMA3会将Cd转运进入液泡中储存, 限制Cd向上转运[46]；而Zn可促进OsHMA3蛋白质的表达[47], 可将Cd固定在根系的液泡中区隔.最后, 由于Zn与Cd在植物体内共用同一运输系统, 因此提高水稻各部位中Zn含量可通过竞争作用抑制各部位中Cd的转运.Tan等[48]和Yamaji等[49]研究发现, OsZIP7和OsHMA2是Cd和Zn的质膜转运蛋白, 主要分布在水稻根的中柱鞘细胞质膜和水稻节的韧皮组织质膜上, 参与根中Cd和Zn向地上部位转运及从木质部到韧皮部的转运.有研究表明, 水稻在营养生长阶段, 吸收的Cd大部分积累在叶中[50], 而在生殖生长阶段, 积累在老叶中的大量Cd被重新激活, 可转运到水稻籽粒中[51].Zhou等[52]通过水稻盆栽试验研究表明, 在低浓度和高浓度Cd污染土壤中, 水稻乳熟期和成熟期叶片中Cd再转运对糙米Cd累积的贡献率分别达到30.0%和22.5%.图 6（a）显示了水稻各部位Cd、Zn含量与土壤中CaCl2-Cd、CaCl2-Zn含量的相关性关系, 图 6（b）显示了不同生育期土壤孔隙水中Cd浓度和Zn浓度相关性关系.本研究叶片Zn含量分别与糙米Cd和谷壳Cd含量之间存在显著负相关关系（图 6）, 相关系数分别为-0.80和-0.79.这说明在孕穗期前和灌浆期前施加外源Zn灌溉水, 可增加叶片中Zn与Cd的竞争, 抑制叶片中Cd向糙米转运.本研究中, 在孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水处理下, Cd的TF根-茎最小（图 5）, 且该处理下水稻糙米Cd含量（0.126 mg·kg-1）低于国家食品污染物限量标准（GB 2762-2017）.此外, 施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水处理水稻各部位Cd含量高于施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水各处理, 表明施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水使水稻体内Cd与Zn产生了协同作用, 其原因在于：一方面可能施加大量Zn刺激植物产生更多的离子载体、运输蛋白和转运载体, 导致植物在吸收Zn的同时吸收了Cd[53]；另一方面也有可能是植物体内一定浓度Zn的存在阻断了Cd2+对金属硫蛋白等结合蛋白的诱导表达的信息传导途径, 抑制了Cd结合蛋白生物合成的过程, 从而加重植物体内的Cd含量[54].因此, 在孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水, 可有效地抑制水稻对Cd的吸收和转运.
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（a）水稻各部位Cd、Zn含量与土壤中CaCl2-Cd、CaCl2-Zn含量相关性, （b）不同生育期土壤孔隙水Cd浓度与Zn浓度相关性；*表示P≤0.05, **表示P≤0.01；色柱颜色从红色到蓝色表示相关系数的数值大小, 椭圆圆扁程度表示相关性大小, 数字表示相关系数 图 6 相关性分析 Fig. 6 Correlation analysis |
（1）关键生育期施加外源Zn灌溉水有利于水稻的生长.施加外源Zn灌溉水处理下水稻地上部位生物量与CK相比增加了6.4%~18.5%, 且施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水对地上部位生物量增幅更大.
（2）关键生育期施加外源Zn灌溉水可在增加土壤孔隙水中Zn浓度的同时降低Cd浓度.孕穗期和灌浆期土壤孔隙水Zn浓度的最大增幅分别为1 073.6%和597.5%, Cd浓度最大降幅分别为73.7%和87.9%.
（3）关键生育期施加外源Zn灌溉水提升了水稻根表铁膜量, 降低根表铁膜对Cd的吸附富集.根表铁膜中Cd含量降低了9.8%~26.5%, Fe和Zn含量分别增加了24.5%~77.2%和22.7%~162.0%.
（4）关键生育期施加外源Zn灌溉水可降低水稻对Cd的吸收和转运.在孕穗期前和灌浆期前均施加含Zn 20 mg·L-1的灌溉水处理下, 糙米Cd含量（0.126 mg·kg-1）低于国家食品污染物限量标准, 而施加含Zn 100 mg·L-1的灌溉水有增加糙米Cd含量的风险, 实际应用中应控制含Zn灌溉水浓度.
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