2023, Vol. 44
2. 南阳师范学院生命科学与农业工程学院, 南阳 473061
, ZHANG Yu1 , REN Xue-min1 , LI Yu-ying1 , ZHANG Ying-jun2 , ZHANG Hao1 , HAN Hui1 , CHEN Zhao-jin1
2. School of Life Science and Agricultural Engineering, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China
我国现阶段面临着较为严峻的土壤重金属污染问题, 重金属在土壤中难以被微生物所吸收和分解, 在土壤中滞留, 累积到一定程度时还可能被活化, 然后通过食物链进入人体, 重金属的摄入会对人体健康产生不同程度的毒害作用[1].近年来, 微塑料(microplastics, MPs)污染作为一种新兴环境污染物越来越受到研究人员的重视, 其进入到土壤、水体等自然环境中对整个生态系统产生威胁[2, 3].MPs因其体积小且比表面积大等特点, 对植物生长和水分吸收产生影响, 表现出一定的毒性效应或刺激效应[4].同时, MPs对污染物具有较强的吸附能力, 在环境污染物中可能起到“载体”作用, 探究其与其他污染物共存时的毒性效应和作用机制具有重要意义[5].土壤中MPs和重金属共存时对植物生长和重金属积累的影响, 目前开展较少[6, 7].宁瑞艳等[7]研究表明MPs的添加促进了东南景天和叶芽鼠耳芥对镉(Cd)的吸收, 增强了Cd对东南景天生长的抑制作用, 但当ρ(MPs)为500 mg·L-1时减弱了对叶芽鼠耳芥的毒害作用.狼尾草作为能源植物在重金属污染修复研究中具有独特的优势, 但MPs和重金属复合污染对狼尾草生长和重金属积累的影响目前尚未开展[8~10].
土壤微生物是土壤中最活跃的组分, 被认为是植物的“第二大基因组”, 在植物生长和土壤元素生物化学地球循环等过程中均起到重要作用[11].冯雪莹等[12]研究表明MPs和Cd都存在于土壤农田中, MPs能不同程度上改变Pb和Zn的生物有效性, 同时基于扩增子测序分析表明其对微生物群落组成和功能产生影响.目前, MPs重金属复合污染土壤中狼尾草根际微生物群落组成和功能研究尚未开展.宏基因组学作为新一代测序技术, 能直接分析环境中微生物的DNA来获知微生物群落的遗传、功能与生态特征, 在技术上具有先进性[13].因此, 本研究以狼尾草为实验对象, 开展土壤中重金属Cd(10 mg·kg-1)与不同MPs种类(聚乙烯PE、聚苯乙烯PS)、粒径(13 μm、550 μm)和质量分数(0.1%、1%)复合污染对植物生长和重金属积累的影响, 同时基于宏基因组学分析该过程中微生物群落和功能, 以期为MPs重金属复合污染的生态毒理效应及其生物修复提供基础数据和科学依据.
1 材料与方法 1.1 实验材料供试狼尾草种子购买自沐阳县拓景园艺有限公司, 挑选大小相近、颗粒饱满和表面无破损的种子进行实验.MPs聚乙烯PE(粒径分别为13 μm和550 μm)购自中国石油化工有限公司, 聚苯乙烯PS(13 μm)购自广东东莞东明塑化.供试土壤采集自河南省南阳市南阳师范学院西区石榴园周边, 土壤类型为黄棕土, 采样深度为表层土0~20 cm, 去除杂质和植物残体后, 自然风干研磨成细土, 过20目筛备用.
1.2 实验方法和样品采集盆栽土壤过筛后加CdSO4·8H2O使其ω(Cd)为10 mg·kg-1, 充分搅拌至混匀后晾晒一周, 每盆称入净重0.75 kg的土壤.本实验设计两种MPs种类(PE、PS)、两个粒径(13 μm、550 μm)和两种MPs质量分数(0.1%、1%), 设置不添加MPs不添加Cd的处理组(CK组), 同时设置不添加MPs只添加10 mg·kg-1 Cd污染组(Cd组).每个处理设置3个重复, 具体实验设计见表 1.盆栽种植期间, 浇水使土壤含水量保持在75%田间持水量左右.当狼尾草生长70 d后收集植物和根际土壤样品.将盆栽中狼尾草拔出, 采用抖落法收集根际土壤, 然后用清水洗净后浸泡在0.01 mol·L-1的EDTA-2Na缓冲液中20 min, 装入信封中放入100℃的烘箱中烘干24 h后, 测量地上部和地下部的干重.把地上部和地下部分别研磨成粉, 消解后用ICP-OES测定植物不同组织中Cd含量[14].
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表 1 实验设计 Table 1 Design of experiments |
1.3 根际土壤细菌总DNA的提取与宏基因组测序分析
取0.5 g根际土壤样品, 用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒提取土壤微生物总DNA.采用上海美吉生物医药科技有限公司提供的Illumina NovaSeq测序系统进行宏基因组学测序[15].将测序平台上得到的原始序列利用Fastp(v0.20.0)进行质控, 去除长度小于50bp和平均碱基质量值低于20以及含N碱基的序列, 去除宿主污染, 获得优化序列.采用MEGAHIT v1.1.2软件对优化序列进行组装[16].使用MetaGene对拼接结果中的重叠群进行基因预测, 选择核酸长度≥100bp的基因将其翻译为氨基酸序列.用CD-HIT v4.6.1软件对所有预测结果进行聚类(相似度≥90%和覆盖率≥90%), 每类取最长的基因作为代表序列, 构建非冗余基因集.使用SOAPaligner(v2.21)分别将每个样品的高质量序列与非冗余基因集进行比对(相似度≥95%), 统计基因在对应样品中的丰度信息.基因丰度计算方法为Reads Per Kilobase Million, 即每100万条序列中, 每个基因以1 000个碱基为单位, 比对序列条数.使用Diamond(v0.8.35)将非冗余基因集的氨基酸序列与eggNOG数据库和KEGG数据库进行比对, 以获得物种和功能注释.为识别在两组样本中具有显著差异的微生物, 基于费舍尔精确检验对样本进行了组间差异检验, 设置P值为0.05.
1.4 数据分析所有数据均有3次重复, 使用SPSS 23.0进行统计分析, 显著性差异检验使用T检验和单因素方差分析(P＜0.05).转移系数计算公式[17]:
转移系数=植物地上部Cd含量/根部Cd含量
2 结果与分析 2.1 MPs和Cd复合污染对狼尾草生物量的影响由图 1可知, 与对照组CK相比, MPs和Cd复合污染时地上部只有13 μm 1% PE+Cd处理下的干重增加, 增幅为7.62%, 其余5组处理分别降低14.81%、21.14%、3.60%、5.06%和9.17%.地下部只在13 μm 0.1% PS+Cd处理下干重增加了1.76%, 其余5组处理分别降低了20.95%、0.82%、28.42%、16.94%和14.74%.以上结果表明, MPs和Cd复合污染整体呈现对狼尾草生长胁迫增加的趋势.
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1.CK, 2.13 μm 0.1% PE+Cd, 3.13 μm 1% PE+Cd, 4.550 μm 0.1% PE+Cd, 5.550 μm 1% PE+Cd, 6.13 μm 0.1% PS+Cd, 7.13 μm 1% PS+Cd; 不同小写字母表示处理之间有显著差异(P < 0.05) 图 1 狼尾草不同处理的地上部干重和地下部干重 Fig. 1 Dry weight of above-ground part and underground part of different treatments of Pennisetum hydridum |
由表 2可知, 单一Cd处理组地上部和地下部ω(Cd)分别为3.595 mg·kg-1和2.888 mg·kg-1, 不同MPs和Cd复合污染处理组地上部Cd含量均下降, 降幅为16.31% ~84.05%. MPs和Cd复合污染处理组地下部Cd含量与地上部相似, 降幅为5.83% ~71.26%. MPs和Cd复合污染处理组中13 μm 1% PE+Cd处理组Cd含量地下部和地上部均为最低, 550 μm 1% PE+Cd处理组Cd含量地上部为最高.
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表 2 狼尾草各部位Cd的含量、积累量和转移系数1) Table 2 Content, accumulation, and transfer factor of Cd in different parts of Pennisetum hydridum |
与单一Cd处理组地上部和地下部Cd积累量相比, 不同MPs和Cd复合污染处理组地上部和地下部Cd积累量均有所下降, 降幅分别为23.34% ~84.82%和9.35% ~67.94%.MPs和Cd复合污染处理组中550 μm 1% PE+Cd处理组地上部Cd积累最高, 为5.082 mg·pot-1, 13 μm 1% PE+Cd处理组地下部Cd积累最高, 为1.217 mg·pot-1.
处理也能对植物转移系数(TF)产生影响, 与单一Cd处理组的转运系数1.25相比, 550 μm 1% PE+Cd处理组转移系数有所增加, 为1.348 6, 增加了7.89%; 其余处理组转运系数均降低, 降幅为7.42% ~55.73%, 13 μm 0.1% PS+Cd处理组转运系数最低, 为0.553 3.
2.3 MPs和Cd复合污染对土壤细菌群落组成的影响 2.3.1 α多样性指数微生物α多样性指数如表 3所示, 包括Sobs指数(实测OTU数目)、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数[18].与对照组Cd相比, 不同MPs和Cd复合污染组Chao1指数和Sobs指数均降低, 其中550 μm 0.1%PE+Cd处理组最低, 分别降低了9.62%和10.62%; ACE指数只有13 μm 0.1% PS+Cd处理组增加, 增加了2.06%, 其余处理组均降低, 分别降低了5.11%、8.81%、9.90%、1.52%和6.43%, 其中550 μm 0.1% PE+Cd处理组降低最多; Shannon指数处理组13 μm 0.1% PS+Cd降低, 其他处理组均增加.
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表 3 不同样品土壤细菌群落多样性评估1) Table 3 Estimation of soil bacterial community diversity in different samples |
2.3.2 组成分析
群落组成分析表明, 狼尾草根际细菌由41个门和976个属组成.门水平上主要有变形杆菌门(Proteobacteria, 22.29% ~26.35%, 占比, 下同)、放线杆菌门(Actinobacteriota, 18.52% ~26.51%)、酸性细菌门(Acidobacteriota, 12.06% ~22.15%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 9.03% ~11.76%)、厚壁菌门(Firmicutes, 6.83% ~10.27%)、髌骨细菌门(Patescibacteria, 3.60% ~4.53%)和蓝藻门(Cyanobacteria, 3.12% ~4.05%)等优势菌门, 占全部序列的90% ~96%(图 2).与对照组CK相比, Cd处理组、13 μm 0.1% PE+Cd、13 μm 1% PE+Cd、550 μm 0.1% PE+Cd和13 μm 0.1% PS+Cd处理组中变形杆菌门丰度增加, 分别增长了6.75%、18.64%、16.66%、12.25和14.32%; Cd处理组、13 μm 1% PE+Cd、550 μm 0.1% PE+Cd和13 μm 0.1% PS+Cd处理中放线杆菌门丰度增加, 分别增长了4.06%、5.17%、8.66%和8.83%.属水平上由芽孢杆菌属(Bacillus, 4.91% ~7.77%)、厌氧菌属(norank_f_norank_o_Vicinamibacteralesnorank, 3.42% ~6.98%)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas, 3.27~4.42%)和诺兰克氏念珠菌属(norank_f_Vicinamibacteraceae, 1.95% ~4.47%)等优势菌属组成, 占全部序列的50% ~60%.与CK相比, 13 μm 0.1% PS+Cd处理组芽孢杆菌属丰度增加, 增长了4.44%; 13 μm 0.1% PE+Cd、550 μm 1% PE+Cd和13 μm 1% PS+Cd处理组厌氧菌属丰度增加, 分别增长了2.80%、26.24%和39.56%.以上结果表明, 不同种类、粒径和质量分数MPs和Cd复合污染处理能改变狼尾草根际土壤细菌群落组成.
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1.CK, 2.Cd, 3.13 μm 0.1% PE+Cd, 4.13 μm 1% PE+Cd, 5.550 μm 0.1% PE+Cd, 6.550 μm 1% PE+Cd, 7.13 μm 0.1% PS+Cd, 8.13 μm 1% PS+Cd; Myxococcota: 粘球菌门, Gemmatimonadota: 芽单胞菌门, Bacteroidota: 拟杆菌门, 蓝藻门：Cyanobacteria; Methylomirabilota; 浮霉菌门：Planctomycetota 图 2 门分类水平上细菌群落相对丰度分布 Fig. 2 Relative abundance of sequences at the phylum level of the bacterial community |
比对Egg NOG数据库后, 对不同处理组狼尾草根际土壤细菌功能进行了COG功能注释[19], 如图 3所示.在COG中共注释到4个大类, 分为25个功能组.新陈代谢(metabolism)在8组样品中的总丰度最高, 占总丰度的45.98%, 信号储存和处理最低(information storage and processing), 占总丰度的14.56%.氨基酸的转运和代谢(amino acid transport and metabolism)、能量生成和转换(energy production and conversion)及信号转导机制(signal transduction mechanisms)是相对丰度前3的功能基因, 染色质结构和动力学(chromatin structure and dynamics)相对丰度最低.与单一Cd污染相比, 不同MPs种类、质量分数和粒径的MPs添加能提高新陈代谢、氨基酸的转运和代谢、能量生成和转换等功能组的基因丰度, 影响因组合的不同有所差异.其中在复合污染处理中, 13 μm 1% PE+Cd处理组在25个功能组中基因数量均为最高值, 550 μm 0.1% PE+Cd和550 μm 1% PE+Cd处理组在25个功能组中基因数量均为较低值.
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A.RNA加工和修饰, B.染色质结构和动力学, C.能源生产和转换, D.细胞周期控制、细胞分裂和染色体分割, E.氨基酸的转移和代谢, F.核苷酸转运和代谢, G.碳水化合物的运输和代谢, H.辅酶转运和代谢, I.脂质运输和代谢, J.翻译、核糖体结构和生物发生, K.翻译, L.复制、重组和修复, M.细胞壁/细胞膜/包膜生物发生, N.细胞能动性, O.翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白, P.无机离子转移和代谢, Q.次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢, R.一般功能预测, S.未知, T.信号转导机制, U.细胞内运输、分泌和囊泡运输, V.防御机制, W.细胞外结构, X.移动组: 原噬菌体和转座子, Z.细胞骨架; A中RNA加工和修饰功能的基因数量如下, CK: 234, Cd: 234, 13 μm 0.1% PE+Cd: 270, 13 μm 1% PE+Cd: 244, 550 μm 0.1% PE+Cd: 194, 550 μm 1% PE+Cd: 262, 13 μm 0.1% PS+Cd: 216, 13 μm 1% PS+Cd: 260;B中染色质结构和动力学的基因数量如下, CK: 172, Cd: 146, 13 μm 0.1%PE+Cd: 136, 13 μm 1% PE+Cd: 170, 550 μm 0.1% PE+Cd: 126, 550 μm 1% PE+Cd: 90, 13 μm 0.1% PS+Cd: 106, 13 μm 1% PS+Cd: 154 图 3 不同处理下狼尾草根际细菌COG功能注释 Fig. 3 COG functional annotation of Pennisetum hydridum rhizosphere bacteria in different treatments |
采用费舍尔精确检验, 对不同品种、粒径和质量分数MPs和Cd复合污染处理间COG功能进行组间差异分析[20].由表 4可知, 当处理中的MPs种类和粒径相同, 但质量分数不同时, 氨基酸的转运和代谢、辅酶转运和代谢和一般功能预测均存在显著差异, 细胞骨架均无显著差异, 其中13 μm 0.1% PE+Cd与13 μm 1% PE+Cd之间COG功能分组显著差异最多, 为15组.当处理中的MPs种类和质量分数相同, 但粒径不同时, 氨基酸的转运和代谢、细胞壁/细胞膜/包膜生物发生和复制重组修复等6个功能组均存在显著差异, 细胞内运输、分泌和囊泡运输均无显著差异.当处理中的MPs质量分数和粒径相同, 但种类不同时, 氨基酸的转运和代谢、信号转导机制和碳水化合物的运输等9个功能组均存在显著差异, 细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割和细胞骨架均无显著差异.以上结果表明, 在复合污染中不同MPs品种、粒径和质量分数均能显著影响狼尾草根际土壤细菌的功能.
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表 4 狼尾草根际土壤细菌COG功能组间差异性1) Table 4 Differences in COG functional groups of bacteria in Pennisetum hydridum rhizosphere soil |
3 讨论 3.1 Cd与MPs复合污染对狼尾草生长和Cd积累的影响
MPs和重金属在土壤中单独存在时能通过影响土壤理化性质、对植物直接产生胁迫从而影响植物的生长[21].MPs和重金属复合存在时, MPs具有较大的比表面积, 可以作为污染物的载体加剧重金属的毒性[22].本研究对狼尾草生物量的测定结果表明, 复合污染处理中除13 μm 0.1% PS+Cd外, 地下部和地上部干重降低0.82% ~28.42%和3.60% ~21.14%, 整体呈现复合污染胁迫增加的趋势.刘蓥蓥等[23]研究了聚乙烯微塑料对绿豆发芽的毒性效果, 指出聚乙烯微塑料的植物毒性与粒径和质量分数密切相关, 粒径越小、质量分数越高, 其植物毒性可能越强.本研究对比分析PE+Cd复合污染中粒径550 μm地上部和地下部生物量均低于13 μm, 表明MPs和重金属复合污染时粒径越小复合污染毒性越大.
有研究表明, 不同种类的MPs对Cd的吸附能力具有差异, 且对不同质量分数Cd的吸附能力不同, 因此推断MPs与Cd复合作用对植物的作用机制差异较大[24].MPs可能会改变重金属在土壤中的流动性和生物有效性, 对植物生长和重金属积累产生影响.本研究对狼尾草重金属含量和积累量测定表明MPs+Cd复合污染处理组地上部和地下部Cd含量均下降, 降幅分别为16.31% ~84.05%和5.83% ~71.26%. MPs+Cd复合污染处理组地上部和地下部Cd积累量均有所下降, 降幅分别为23.34% ~84.82%和9.35% ~67.94%.有研究表明, 土壤中的MPs通过物理吸附和共沉降, 能降低重金属的交换态、碳酸盐结合态和铁锰氧化物结合态, 增加有机结合态, 这样的作用会降低重金属在土壤中的生物有效性和迁移率, 从而降低植物重金属的积累[25].另外降低重金属吸收的原因可能是与MPs添加到土壤中之后抑制狼尾草水分吸收, 进而影响水溶性Cd进入植物体内有关[26].
3.2 Cd与MPs复合污染对狼尾草根际土壤细菌群落和功能的影响根际微生物能直接参与和影响植物的生理过程, 土壤环境的变化更会直接影响到微生物群落结构和功能[27].Feng等[28]研究表明, MPs对微生物群落丰富度和多样性产生了负面影响, 其影响因素主要是MPs的类型和质量分数.本研究结果与之一致, MPs重金属复合污染中Chao1指数和Sobs指数均降低, 表明复合处理会对土壤细菌群落产生胁迫, 降低其多样性.复合污染降低细菌多样性因MPs种类、质量分数和粒径不同有所差异.Feng等[28]研究表明相较于单一重金属污染, MPs导致的土壤性质(pH、DOC、NH4+-N和NO3--N)和提取态重金属(DTPA-Pb和DTPA-Zn)与微生物群落多样性和组成有显著负相关性.本实验中不同MPs品种、粒径和质量分数对土壤有效态重金属和理化性质等的影响未进行测定, 后续需加以测定, 以分析不同MPs类型、粒径、质量分数和与土壤重金属的交互作用对微生物群落组成的影响[29].
在重金属和MPs等胁迫条件下, 具有相应耐受能力的微生物得以富集生长[30].在组成上, MPs与Cd复合污染土壤中以变形杆菌门、放线杆菌门、酸性细菌门、绿弯菌门和厚壁菌门等优势菌门组成, 这些优势菌门广泛存在其他重金属和MPs污染土壤中[31, 32].其中变形杆菌门作为重金属和MPs抗性微生物在复合污染中比例得以提升[32].属的水平上由芽孢杆菌属、鞘脂单胞菌属、诺兰克氏念珠菌属等优势菌属组成, 其中芽孢杆菌属和鞘脂单胞菌属是已报道的重金属抗性细菌, 广泛存在于不同的重金属土壤中[31, 33].同时, MPs的添加MPs能够为这些微生物提供附着点, 芽孢杆菌属和鞘脂单胞菌属是MPs表面生物膜的重要组成, 在MPs降解中起到重要作用[34, 35].
MPs与Cd复合污染导致的微生物群落变化可能会影响代谢功能的多样性.Feng等[28]采用扩增子测序结合PICRUSt2功能预测分析表明, MPs增加了次生代谢产物的生物合成、核苷酸代谢、萜类和聚酮化合物代谢等功能基因丰度.但Feng等[28]指出PICRUSt2功能预测分析有一定的局限性, 需要结合宏基因组测序等更为准确的技术掌握MPs引起的基因组学变化.目前宏基因组在MPs与Cd复合污染中应用较少, 本研究通过宏基因组分析发现与单一Cd污染相比, 不同MPs种类、质量分数和粒径的MPs添加能提高新陈代谢、氨基酸的转运和代谢、能量生成和转换等功能组的基因丰度, 影响因组合的不同有所差异, 这与Fei等[36]分析的PE和PVC添加能提高膜转运蛋白(membrane transporters)和信号转导等丰度的研究结论相似.不同样品功能分组差异分析发现, 氨基酸的转运和代谢在所有分组之间均呈现显著差异(P < 0.05), 另外辅酶转运和代谢、信号转导机制、能源生产和转换、碳水化合物的运输和代谢等都是差异的主体.以上功能分组也是其他研究者分析MPs污染土壤中微生物功能的主要组成, 在微生物耐受MPs和重金属污染中可能起到重要作用[28, 37~40].总体来看, 不同处理的根际土壤中微生物的代谢功能产生差异, 微生物多样性也会降低, 体现了重金属和MPs复合污染胁迫能影响微生物多样性和物种功能.
4 结论(1) 不同种类、粒径和质量分数的MPs和Cd复合污染对狼尾草生物量、Cd含量和积累量产生影响, 整体呈现复合污染胁迫增加的趋势.
(2) MPs和Cd复合污染能影响狼尾草根际土壤群落组成.
(3) 不同种类、粒径和质量分数的MPs和Cd复合污染会对土壤细菌群落产生胁迫, 降低其多样性, 影响因组合的不同有所差异.
(4) 宏基因组分析表明与单一Cd污染相比, 不同MPs品种、粒径和质量分数的MPs添加能提高新陈代谢、氨基酸的转运和代谢、能量生成和转换等功能组的基因丰度, 显著影响狼尾草根际土壤细菌的功能.
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