2023, Vol. 44
氮是植物生长所必需的大量元素之一.反硝化过程决定了土壤中植物利用的氮素有效性和形态, 为植物提供可直接利用的氮素, 但也是农田氮损失的重要途经[1~3].反硝化过程指硝酸盐(NO3--N)在多种微生物和还原酶的参与和作用下, 经过一系列酶促反应最终还原为氮气(N2)的过程, 通常发生在低氧或厌氧环境中[4~6].在反硝化过程中, 亚硝酸盐还原酶(Nir)催化亚硝酸盐(NO2-)还原为一氧化氮(NO)的过程是反硝化过程的限速步骤, Nir由nirS和nirK基因编码[7~9], 但nirS和nirK丰度与环境因子之间的关系与土壤类型和施肥种类等多种因素相关[10]; 氧化亚氮还原酶(Nos)催化N2O还原为N2是反硝化过程中的最后一步, 在减缓土壤N2O排放中发挥重要作用, nosZ基因是编码Nos的唯一基因[11].因此, nirS、nirK和nosZ基因常作为研究传统反硝化过程的目标基因[12].反硝化势是指反硝化酶活性, 能反映出土壤反硝化作用的强度[13, 14].
生物炭是一类比表面积大、吸附性好的富碳物质, 作为一种缓效碳源和土壤改良剂近年来备受学者关注.已有研究表明, 生物炭不仅能改变土壤性质, 还能改善土壤环境, 为微生物提供良好的环境从而影响土壤N2O的排放[15].武玉等[16]的研究发现, 生物炭能够通过改变土壤容重、孔隙度和pH等理化性质从而提高土壤肥力.有机肥能够显著改变土壤结构和土壤微生物群落结构, 为微生物提供碳源, 促进反硝化微生物生长的同时, 通过促进土壤其他微生物活性加速氧气的消耗, 为反硝化作用提供良好的低氧微域环境[17~19].王军等[17]的研究发现单施有机肥处理的反硝化势显著高于单施无机肥处理.周慧等[20]的研究发现, 在中度盐渍土单施有机肥促进土壤反硝化过程, 显著提高了土壤反硝化势.土壤微生物在土壤反硝化过程中起重要作用, 其多样性和群落结构可作为研究土壤反硝化过程的重要依据.有机肥和生物炭能够改善土壤环境, 为微生物提供良好的环境, 并向微生物提供生长所必须的营养元素[21].姚丽茹等[22]通过长期田间定位试验发现, 适量施用生物炭可以改善土壤理化性质, 提高土壤养分有效性, 改变细菌丰度.王培欣等[11]的研究发现, 单施化肥和有机肥配施化肥均显著影响了nosZ型反硝化细菌的数量和群落结构.王晓辉等[23]的研究发现生物炭能显著提高退化土壤中nirK的基因丰度, 但是对nirS和nosZ基因丰度无显著影响.目前, 关于施用生物炭和有机肥对氮相关功能基因丰度的影响已取得较多的研究成果, 但关于有机肥和生物炭两种有机物联合运用条件下反硝化势的主要驱动功能菌和响应机制的研究还较少.
近年来, 柠檬产业在四川和重庆等地得到大力发展.在实际生产中, 果农盲目追求高产, 其长期不合理施肥行为使土壤氮损失、土壤酸化和土壤质量退化等问题日益严重[24].因此, 本文以尤力克柠檬为研究对象, 通过测定不同施肥处理条件下土壤反硝化势, 并结合分子生物学技术测定了nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物丰度和群落结构, 分析不同施肥处理对土壤反硝化势和反硝化微生物群落的影响, 明确影响土壤反硝化势的主要驱动因子, 阐明有机肥配施生物炭对土壤反硝化势的调控机制, 以期为合理施肥以减少果园中土壤N2O排放提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验区概况盆栽试验位于重庆市北碚区西南大学紫色土试验站(E106°24′ 41″, N29°48′47″), 该地区属于亚热带季风湿润气候, 海拔为242 m, 年平均气温为18.3℃.供试土壤为紫色潮土, 采自重庆市潼南国家农业科技园区柠檬种质资源圃耕层(0~20 cm).柠檬品种为尤力克, 为柏梓镇小岭村的智能化柠檬脱毒育苗中心嫁接7个月的脱毒苗.
1.2 试验设计与样品采集本试验自2019年5月1日布设至2020年6月25日, 共设5个处理, 每个处理4次重复, 采用随机区组设计: 不施肥(CK)、常规施肥(F)、有机肥(P)、化肥+生物炭(FP)和有机肥+生物炭(PP).化肥使用的氮、磷、钾肥品种分别为尿素(46%, 以N计)、过磷酸钙(12%, 以P2O5计)和氯化钾(60%, 以K2O计).供试有机肥和新鲜有机肥分别为腐熟猪粪和新鲜猪粪, 均取自潼南温氏种猪场, 腐熟猪粪含氮量(以N计)为2.3%, 含磷量(以P2O5计)为2.2%, 含钾量(以K2O计)为0.9%, pH为8.9; 新鲜猪粪含氮量(以N计)为2.1%, 含磷量(以P2O5计)为1.5%, 含钾量(以K2O计)为0.8%, pH为8.6.当季猪粪(120 d)碱解氮、速效磷和速效钾的缓释效率为35.3%、34.8%和41.5%[25].微肥来自北美农大集团生产的硼锌锰铁镁钙硅复合微量元素水溶肥料, pH为6.0.
单株柠檬幼苗基肥施入纯氮为2.6 g, 于2019年5月10日定植, 穴施入基肥, 按照所有施肥处理等氮施肥的标准, 将化肥、有机肥和生物炭与过2 cm筛的土壤充分混匀后装入盆口直径22 cm, 高30 cm的PVC圆桶中, 每桶装入土壤15 kg.施用完基肥后放置15 d, 然后选择大小和长势基本一致的柠檬苗移栽, 每个盆钵1株, 移栽定植后浇水灌透, 之后适时浇水, 每次浇水保持各处理表层土壤的湿度一致.生物炭作为基肥一次性施入, 有机肥和无机肥部分作为基肥施入, 之后每2~3个月以三分之一基肥的量进行追肥, 共追肥4次, 具体施肥量如表 1所示.除CK处理外, 各处理保持等氮的施肥原则, 具体的氮、磷、钾投入量见表 2.土壤基本理化性质为: 容重1.48 g·cm-3、pH 5.2、ω(SOM)8.7 g·kg-1、ω(TN)0.7 g·kg-1、ω(TP)0.2g·kg-1、ω(AN)57.3 mg·kg-1、ω(AK)244.1 mg·kg-1、ω(NO3--N)3.5 mg·kg-1、ω(NH4+-N)4.8 mg·kg-1和ω(AP)9.1 mg·kg-1.
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表 1 各施肥处理单株柠檬总施肥量1)/g Table 1 Total amount of fertilizer applied per lemon plant under different fertilization treatments/g |
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表 2 各处理单株柠檬的氮、磷、钾养分投入总量/g Table 2 Properties of biochar, composted pig manure and fresh pig manure/g |
盆栽试验于2020年6月25日进行破坏性取样, 将采集的新鲜土壤带回实验室.一部分置于-20℃的冰箱中保存, 用于测定硝化微生物丰度和群落结构; 一部分自然风干, 去除杂质, 研磨后分别过1 mm和0.25 mm筛, 用于测定土壤理化性质.
1.3 测试方法 1.3.1 土壤基本理化性质和反硝化势的测定pH以土水比1 ∶2.5, 用DMP-2mV酸度计测定; 土壤有机质(soil organic matter, SOM)采用重铬酸钾容量法测定; 土壤含水率(moisture content, WC)采用烘干法测定; 土壤全氮(total nitrogen, TN)采用H2SO4-H2O2消煮-蒸馏滴定法测定, 全磷(total phosphorus, TP)采用NaOH熔融-钼蓝比色法测定, 全钾(total potassium, TK)采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度法测定, 碱解氮(available nitrogen, AN)采用碱解扩散法测定, 速效钾(available potassium, AK)采用NH4Ac溶液浸提-火焰光度法测定, 速效磷(available phosphorus, AP)采用Olsen法测定, 铵态氮(ammonium nitrogen, NH4+-N)采用KCl溶液浸提-靛酚蓝比色法测定, 硝态氮(nitrate nitrogen, NO3--N)采用KCl溶液浸提-紫外分光光度法测定.
反硝化势的测定方法在和文祥等[26]的硝态氮剩余量法的基础上稍作修改.具体操作如下: 称取过1 mm筛的风干土1.00 g于50 mL离心管中, 加入10 mL底物溶液(100 mg·L-1硝酸钾溶液+100 mg·L-1葡萄糖溶液), 用塑料薄膜封口, 置于37℃恒温培养箱中培养48 h, 然后以4 000 r·min-1的转速离心20 min, 用紫外分光光度法测定上清液中硝态氮的含量, 同时设置无土壤、无底物和灭菌土壤处理作为对照.
1.3.2 土壤总DNA提取和Real-Time PCR测定土壤nirS、nirK和nosZ基因拷贝数土壤基因总DNA用Fast DNA Spin Kit for soil(MP Biomedicals公司)试剂盒提取.在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测后用NanoDrop ND-1000UV-Vis分光光度计测定样品总DNA的浓度, 每个样品测3个平行, 计算平均值.剩余的DNA样品置于-20℃冰箱保存, 用于后续测定[27, 28].
Real-Time PCR定量扩增仪型号为ABI7500(Bio-rad, USA), 每个循环中荧光收集在83℃下进行, 以防止由于引物二聚体的存在所引起的误差.溶解曲线程序为65~98℃, 每0.2℃读数, 其间停留6s.Real-Time PCR测定控制软件为ABI 7500 software.
1.3.3 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析利用T-RFLP技术分析不同施肥制度分析土壤中nirS、nirK和nosZ的群落结构[29].将扩增产物分别用HhaⅠ、Taq2Ⅰ和RsaⅠ限制性内切酶进行单酶切, 置于37℃的恒温培养箱中培养14~16 h, HhaⅠ酶还要在80℃的烘箱中灭活30 min, 然后送至生工生物工程股份有限公司(上海)用ABI Prism 3100基因分析仪进行T-RFLP分析[27, 28].
1.4 数据处理采用Microsoft Excel 2010软件进行数据处理, Origin 2022和Microsoft Power Point 2010进行图表绘制.用IBM SPSS 26.0软件对土壤理化性质和基因拷贝数等数据进行ANOVA方差分析和PLS-PM分析, 用Duncan法进行不同处理之间的多重比较(P < 0.05).采用Canoco 5.0软件对不同施肥处理下土壤微生物群落结构和环境因子进行冗余分析(RDA).用Origin 2022对土壤环境因子和反硝化微生物与反硝化势之间的关系进行分析.
2 结果与分析 2.1 不同施肥处理对土壤理化性质和反硝化势的影响由表 3可知, 土壤pH范围为4.6~5.5, 有机肥和生物炭处理(P、FP和PP)的土壤pH显著高于CK处理(P＜0.05), 其中, PP处理最高, 较CK处理提高了0.3个单位; F处理pH最低, 较CK处理下降了0.6个单位.各处理土壤ω(SOC)为7.6~9.5g·kg-1, 有机肥和生物炭处理(P、FP和PP)SOC含量显著高于CK处理, 其中P处理的SOC含量最高, 较CK处理提高了24.3%.C/N范围为5.9~7.7, F处理C/N显著低于其他施肥处理, 且较CK处理降低了21.0%.土壤WC范围为20.8% ~24.4%, 从大到小依次为: P>PP=CK>FP>F, 其中化肥处理(F和FP)较CK处理显著降低了土壤WC.与CK处理相比, 施肥处理均能显著提高土壤全量养分的含量, 其中F和P处理提高土壤TN、TP含量效果最为显著, FP和PP处理提高土壤TK含量效果最为显著.与其他处理相比, F处理能显著提高土壤中速效养分的含量.
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表 3 不同施肥处理对土壤理化性质的影响1) Table 3 Effects of different fertilization treatments on soil physicochemical properties |
由图 1可知, 不同施肥处理下反硝化势的差异显著.土壤反硝化势范围为15.2~230.5 μg·(g·h)-1, 不同施肥处理的土壤反硝化势从大到小依次为: P>PP>CK>FP>F.其中有机肥和生物炭处理(P、FP和PP)的反硝化势显著高于F处理, 较F处理提高了147.8% ~1 445.3%.
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不同小写字母表示不同处理间反硝化势的差异性(P＜0.05) 图 1 不同施肥处理对反硝化势的影响 Fig. 1 Effect of different fertilization treatments on the denitrification potential of soil |
不同施肥处理下土壤nirS、nirK和nosZ基因拷贝数的差异如图 2所示.土壤nirS基因拷贝数范围为8.5×105~3.0×107 copies·g-1, 各处理土壤nirS基因拷贝数从大到小依次为: F>FP>P>PP>CK, F处理的土壤nirS基因拷贝数显著高于其他施肥处理(P＜0.05), P和FP处理的土壤nirS基因拷贝数显著高于CK和PP处理. 土壤nirK基因拷贝数范围为1.1×106~5.5×107 copies·g-1, 其中, CK处理的nirK基因拷贝数最低, P处理的nirK基因拷贝数最高, F、P、FP和PP处理的nirK基因拷贝数均显著高于CK处理.土壤nosZ基因拷贝数范围为2.6×108~4.3×108 copies·g-1, 各处理nosZ基因拷贝数从大到小依次为: CK>P>PP>FP>F.其中, F和FP处理的土壤nosZ基因拷贝数显著低于CK处理.
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不同小写字母表示不同处理间基因丰度的差异性(P＜0.05) 图 2 不同施肥处理对土壤nirS、nirK和nosZ基因拷贝数的影响 Fig. 2 Effects of different fertilization treatments on the copy number of nirS, nirK, and nosZ genes in soil |
由表 4可知, 与CK处理相比, P处理能显著提高土壤nirS基因反硝化微生物群落结构的多样性指数、丰富度指数和均匀度指数(P＜0.05).F、FP和PP处理显著降低了nirK基因反硝化微生物群落结构的多样性指数和均匀度指数, 显著提高了nosZ基因反硝化微生物群落结构的多样性指数, 其中F和P处理下土壤nosZ基因反硝化微生物群落结构的多样性指数、丰富度指数和均匀度指数均显著高于CK处理.
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表 4 不同施肥处理下nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落结构的α-多样性1) Table 4 The α-diversity of denitrifying microbial community structure of nirS, nirK, and nosZ types under different fertilization treatments |
图 3(a)为不同施肥处理下土壤中nirS基因限制性酶切片段相对丰度.各处理土壤nirS基因群落中都存在的T-RFs片段有81、53、77、79、118、144、146、192和233 bp.其中81 bp在各处理中均属于优势T-RFs片段, 相对丰度为51.3% ~78.8%; 79 bp在CK、F和FP处理中属于优势T-RFs片段, 相对丰度分别为13.6%、19.8%和11.7%; 118 bp在P处理中属于优势T-RFs片段, 相对丰度为12.1%; 192 bp在P处理中属于优势T-RFs片段, 相对丰度分别为11.6%.
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图 3 不同施肥处理下nirS、nirK和nosZ基因限制性酶切片段的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of restriction fragments of nirS, nirK, and nosZ genes under different fertilization treatments |
图 3(b)为不同施肥处理下土壤中nirK基因限制性酶切片段的相对丰度.148、264、435和538 bp为主要T-RFs片段, 占全部片段的64.7% ~88.3%.其中, CK、P、FP和PP处理中土壤nirK基因群落的最主要优势T-RFs片段均是264 bp, F处理的最主要优势T-RFs片段是148 bp.435 bp的T-RFs片段在CK、P、FP和PP处理中的相对丰度为10.3% ~16.9%.538 bp的T-RFs片段在CK、F和P处理中的相对丰度为24.9% ~32.9%, 在FP和PP处理中的相对丰度为7.4% ~13.9%.总体上, F处理下土壤的nirK型反硝化微生物群落中的优势种群不同于其他处理, 单施化肥显著改变了土壤nirK型反硝化微生物群落结构.
图 3(c)为不同施肥处理下土壤中nosZ基因限制性酶切片段的相对丰度.其中451 bp在各处理中均属于优势T-RFs片段, 相对丰度为28.0% ~88.7%; 455 bp在F、P、FP和PP处理中属于优势T-RFs片段, 相对丰度为14.3% ~29.6%.F处理中有一个独有的优势T-RFs片段449 bp, 相对丰度为19.2%.总体而言, 各施肥处理的土壤nosZ型反硝化微生物群落较CK处理更复杂.
2.4 nirS、nirK、nosZ型反硝化微生物群落结构与环境因子的RDA分析由图 4(a)可知环境因子对nirS型基因反硝化微生物群落结构的解释率为77.3%, 第一排序轴和第二排序轴的解释率分别为53.6%和23.7%.其中WC解释率为37.0%, P为0.002; C/N解释率为21.3%, P为0.002; AK解释率为16.2%, P为0.002; TK解释率为4.6%, P为0.008, 均达极显著水平(P＜0.01).环境变量对nirS型基因反硝化微生物群落结构的解释率大小顺序为: WC>C/N>AK>TP>TK.
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图 4 不同施肥处理下nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落结构与环境因子的RDA排序 Fig. 4 RDA sequencing of microbial community structure and environmental factors of nirS, nirK, and nosZ denitrification under different fertilization treatments |
由图 4(b)可知环境因子对nirK型基因反硝化微生物群落结构的解释率为73.5%, 第一排序轴和第二排序轴解释率分别为48.2%和25.4%.C/N、AK、NO3--N、TP、WC和NH4+-N都与环境因子关系较密切, 均达显著水平(P＜0.05).其中C/N解释率为45.5%, P为0.002; AK解释率为20.3%, P为0.002; NO3--N解释率为15.1%, P为0.002; TP解释率为8.1%, P为0.002, 均达极显著水平(P＜0.01).环境变量对nirK型基因反硝化微生物群落结构的解释率大小顺序为: C/N>AK>NO3--N>TP.
由图 4(c)可知环境因子对nosZ型基因反硝化微生物群落结构的解释率为77.2%, 第一排序轴和第二排序轴的解释率分别为44.8%和32.5%.AP、SOC、TP、AK和WC都与环境因子关系较密切, 均达显著水平(P＜0.05).其中AP解释率为42.0%, P为0.002; SOC解释率为31.4%, P为0.002; TP解释率为13.5%, P为0.002; AK解释率为5.4%, P为0.002, 均达极显著水平(P＜0.01).环境变量对nosZ型基因反硝化微生物群落结构的解释率大小顺序为: AP>SOC>TP>AK.
2.5 土壤反硝化势与nirS、nirK和nosZ基因丰度和环境因子间的PLS-PM分析PLS-PM结果表明(图 5), 环境因子(pH和NO3--N)和不同土壤反硝化菌丰度(nirS、nirK和nosZ)解释了土壤反硝化势总方差的80.2%, 环境因子(pH和NO3--N)分别解释了nirS、nirK和nosZ型反硝化菌丰度总方差的72.0%、48.3%和61.7%.分析表明, NO3--N含量与nirK和nosZ型反硝化菌丰度分别呈极显著正相关(路径系数=0.7, P＜0.01)和极显著负相关(路径系数=-0.8, P＜0.001), 且对nosZ型反硝化菌丰度的影响大于nirS型; pH与nirS型反硝化菌丰度和土壤反硝化势分别呈极显著负相关(路径系数=-0.9, P＜0.001)和极显著正相关(路径系数=1.0, P＜0.001), 且对土壤反硝化势的影响大于nirS型反硝化菌丰度; nirK型反硝化菌丰度和反硝化势呈极显著正相关(路径系数=0.5, P＜0.01).
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***、**和*分别表示显著性水平为P＜0.001、P＜0.01和P＜0.05; 红色箭头和蓝色箭头分别表示正相关和负相关; 箭头上的数值表示路径系数; 箭头的宽度与路径系数的强度成正比; 实线和虚线分别表示有无显著关系 图 5 土壤反硝化势与土壤反硝化功能菌丰度和环境因子的PLS-PM分析 Fig. 5 PLS-PM analysis of soil denitrifying potential and abundance of soil denitrifying functional bacteria and environmental factors |
反硝化作用是氮循环过程中氮素去除的重要环节, 也是大气中温室气体N2O的主要排放源[30].刘杰云等[31]的研究发现, 不同施肥方式能通过改变土壤性质, 影响微生物的基因丰度、群落结构和活性, 从而影响土壤反硝化作用的强度.本研究结果表明, 施加化肥的处理(F和FP)显著降低了土壤反硝化势, 施加有机肥的处理(P和PP)显著提高了土壤反硝化势, 且施加生物炭和有机肥处理(P、FP和PP)的反硝化势显著高于单施化肥(F)的处理.这与前人的研究结果一致[7, 32].本研究中有机肥配施生物炭(PP)相比单施有机肥(P)显著降低了土壤反硝化势.有研究发现, 有机肥能通过刺激好氧微生物的生长, 降低土壤氧气分压, 为反硝化微生物提供良好的厌氧环境[33], 通过提高土壤的缓冲能力, 降低环境胁迫对反硝化微生物的抑制作用, 促进土壤反硝化作用[34].而生物炭具有较大的比表面积和疏松多孔、孔隙度高的结构特点, 将其施入土壤不仅能吸附土壤中的NO3--N, 从而减少反硝化作用的底物[35], 还会提高土壤的通气性, 降低土壤反硝化微生物的活性[36].Singh等[37]的研究结果也发现添加生物炭能改善土壤通气情况, 从而抑制反硝化反应的发生.因此, 有机肥配施生物炭能够改善单施有机肥造成的土壤反硝化势升高的情况.
3.2 有机肥配施生物炭对土壤反硝化微生物丰度的影响NO2-还原为NO的过程是反硝化过程中最重要的限速步骤, 这个过程由两种不同类型的亚硝酸盐还原酶催化, 两种酶分别由nirS和nirK基因编码.本研究结果显示, 土壤中nosZ基因拷贝数较nirS和nirK基因拷贝数高出1~2个数量级, 这与周慧等[20]研究的结果相符.PLS-PM分析结果表明, nirS基因拷贝数与pH呈极显著负相关, nirK基因拷贝数与NO3--N含量呈极显著正相关.
土壤pH对微生物活性有重要影响.Hofstra等[38]的研究发现, 土壤反硝化微生物最适pH为6.0~8.0.此外, 唐继伟等[39]的研究发现, 在氮投入量过高时施加化肥会显著降低土壤pH.喻江等[7]的研究发现, 有机肥能显著提高NO3--N含量, 为反硝化微生物作用提供更多的底物.土壤有机碳(SOC)的矿化过程在为土壤反硝化微生物提供电子供体的同时, 也为其提供了生长繁殖所必需的碳源[40], 生物炭不仅含有丰富的养分, 还有具有良好通气性和持水性的碳骨架结构, 能在为微生物生存繁殖提供充足营养物质的同时为其提供良好的环境[41].因此, 施加有机肥和生物炭能够提高土壤中SOC含量, 为反硝化细菌提供底物和能源, 促进其生长繁殖, 从而提高土壤中反硝化微生物的数量[42].由于施加化肥能使土壤pH下降, 且nirS型反硝化微生物可能对通气状况更为敏感, 因此, 化肥处理(F)较其他施肥处理显著提高了nirS的基因拷贝数; 施加有机肥和生物炭为nirK型反硝化微生物提供了反应所需的底物NO3--N和能源, 改善其生长环境, 因此, 与不施肥处理(CK)相比, 施肥处理均显著提高了nirK基因拷贝数.本研究结果表明, 与不施肥处理(CK)相比, nosZ基因拷贝数在施加有机肥(P和PP)的处理中没有显著变化, 而在施加化肥(F和FP)的处理中显著下降.PLS-PM分析表明, nosZ基因丰度与NO3--N含量呈极显著负相关关系, 说明NO3--N含量为影响nosZ基因丰度的主要环境因子, 这与前人研究的结果一致[43].
反硝化功能基因丰度对反硝化势的影响尚未明确.王海翠等[13]的研究发现水田的反硝化势与nirS基因丰度呈显著正相关, 而与nirK和nosZ基因丰度没有显著相关性; 王梦娟等[4]的研究发现, 不同林龄杉木人工林土壤中反硝化潜势随 nirK基因丰度的增加而降低.通过PLS-PM分析发现, nirK型反硝化微生物丰度是影响土壤反硝化势的主要微生物因素, 而nirS和nosZ型反硝化菌群落丰度对硝化势无显著影响.以上结果说明在紫色土中, nirK型反硝化微生物群落在果园土壤反硝化过程中起主导作用, 有机肥通过改善土壤pH, 为nirK型反硝化微生物提供反应所需底物NO3--N和良好的生长繁殖环境, 提高了nirK型反硝化微生物丰度, 促进了反硝化反应的进行, 最终提高土壤反硝化势.
3.3 有机肥配施生物炭对土壤反硝化微生物群落结构的影响有研究表明, 不同施肥处理能使土壤微生物群落结构有显著差异[44], 施加生物炭也能通过改变土壤性质进而改变微生物群落结构[45].本研究结果表明, 施肥处理显著提高了nosZ型反硝化微生物的多样性、丰富度和均匀度, 但除单施有机肥处理(P)外, 施肥处理普遍降低了nirS和nirK型反硝化微生物的多样性和均匀度, 这与前人的研究结果相符[22, 46].可能是由于生物炭通过改变土壤微环境, 为某类微生物生长提供有利条件, 从而引起细菌群落个体大小或数量差异增大, 最终降低了群落均匀度和多样性指数.
有机肥配施生物炭还改变了nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落中主要优势T-RFs片段的相对丰度, 影响了反硝化微生物的群落结构组成.RDA结果表明, nirS型反硝化微生物群落结构与土壤WC、C/N、AK、TP和TK呈极显著相关, nirK型反硝化微生物群落结构与C/N、AK、NO3--N和TP呈极显著相关, nosZ型反硝化微生物群落结构与AP、SOC、TP和AK呈极显著相关.王光飞等[47]的研究发现, 土壤AP和AK含量与生物炭施用量呈显著正相关.施用有机肥和生物炭不仅能够提供微生物生长繁殖所必需的养分, 还能改善土壤理化性质, 使微生物的生长环境改变.说明有机肥配施生物炭能通过改变土壤环境因子使nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落结构发生变化.但RDA发现, nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落结构与反硝化势均无显著相关性, 说明施肥处理未能通过改变nirS、nirK和nosZ型反硝化微生物群落结构而对土壤反硝化势产生影响, 这与前人的研究结果相符[48, 49].这说明以上3种类型反硝化菌(nirS、nirK和nosZ)的群落结构可能不是土壤反硝化酶活性的速率限制因素.此外, nirS、nirK和nosZ占整个土壤反硝化菌的比例有限[50], 本研究结果并不代表其他类型反硝化菌群落结构与土壤反硝化势无关.
4 结论施肥有效改善了土壤理化性质, 促进了土壤反硝化菌丰度与群落结构的变化, 并改变了土壤反硝化势.其中, nirK型反硝化菌是果园中反硝化过程的主要驱动者, pH、NO3--N和nirK型反硝化菌丰度是影响土壤反硝化势的关键因子.有机肥配施生物炭较单施有机肥通过改变土壤pH和NO3--N, 降低了nirK型反硝化微生物丰度, 改善了单施有机肥造成的土壤反硝化势提高的情况.因此, 生物炭配施有机肥更适合在该地区果园中推广.
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