2023, Vol. 44
2. 佛山市南海区苏科大环境研究院, 佛山 528225
2. Foshan Nanhai Suzhou University of Science and Technology Environmental Research Institute, Foshan 528225, China
植物修复技术由于环保、经济和易于控制的特点, 在重金属污染修复领域愈来愈受关注.然而在修复过程中, 植物耐性会受到重金属胁迫阈值的制约, 即当环境中重金属浓度较高时, 植物的生长发育会受到严重限制, 导致该技术的时间成本大大增加[1].刘慧芹等[2]研究报道, 在500~1 000 mg ·L-1铅(Pb)胁迫下黑麦草仍具有良好的耐性, 而当ρ(Pb)达到1 500 mg ·L-1时, 抗氧化和渗透调节系统遭到了极其严重的破坏.张静等[3]研究发现10 mg ·L-1 Cd处理对水芹(Oenanthe javanica)生长具有明显的抑制作用, 株高、根数和鲜重都显著减少, 地上生物量和地下生物量比值升高.由此可以看出, 植物的生理耐性普遍具有随着重金属浓度上升而下降的特性.并且这种特性在根部表现得更为明显, 这是由于根系是重金属累积的主要场所, 其受到的负面作用要显著高于地上部分.同时, 根系也是植物矿物质元素吸收和水分获取的重要器官, 其与污染介质直接接触, 对重金属胁迫的响应更加敏感[4, 5].因此, 研究植物根系应答重金属胁迫的耐性生理变化更具有代表性, 对植物修复技术的推广应用及重金属污染场地的生态恢复具有十分重要的意义.
为此, 有学者提出了外源物质诱导强化植物修复的设想, 并初步证实了其可行性[6].该技术的理论基础是通过对植物应用外源生物活性物质, 增强其耐性机制, 提高植物与重金属的共存能力, 达到强化修复的目的[7].亚精胺(spermidine, Spd)属于多胺中的三胺, 是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的小分子活性物质, 在生物生长发育过程中发挥多种重要生理作用.有研究表明, 植物体内Spd水平与其抗胁迫能力密切相关[8~10].对于重金属胁迫, 外源Spd可以有效缓解其对植物的毒害作用, 还可以直接或间接地影响植物对重金属离子的吸收与积累[11, 12].目前关于其调控机制的研究大多是从植物生理学层面进行, 而重金属对植物的胁迫作用是一个具有传递性的过程, 通常最先在分子层面上作出适应性应答, 然后经转录和翻译形成一系列的生理学变化, 最终从形态学上表现出胁迫效应[13].由于植物生理学和形态学上的变化具有滞后性, 使得两者层面上的研究不能清晰准确地阐明Spd调控植物抵御重金属胁迫的机制.
近年来, 转录组学技术的发展为研究植物对非生物胁迫反应的分子机制提供了一种精确方法.其可以研究所有mRNA转录本的丰度, 其样本检测甚至不以完整的基因组序列为前提, 能够发现新的转录本和可变剪接体[14], 而且可以使获得的结果具有更准确的量化、更可靠的分析、更高的重复性和更宽的检测范围.目前该方法已被广泛应用于植物对重金属胁迫反应的研究中, 且从多种植物中发现了大量与重金属胁迫反应有关的基因[15, 16].本研究以黑麦草为受试植物, 在水培试验条件下考察了外源Spd对镉(Cd)胁迫下黑麦草根系生理生化的影响.并利用转录组测序手段, 在分子生物学上进一步探究了Spd的调控机制, 揭示Spd介导Cd胁迫下黑麦草根系的差异基因, 以期完善植物环境修复技术, 以及为基因工程改造提供借鉴参考.
1 材料与方法 1.1 试验材料与试剂主要化学试剂: CdCl2 ·2.5H2 O(分析纯)购自天津化学试剂厂; Spd(纯度99%)购自Sigma公司.用去离子水配制一定浓度的CdCl2和Spd储备母液, 按试验所需的浓度稀释使用.
供试植物及预培养: 宽叶型四倍体一年生黑麦草(Lolium perenne Linn.), 品种为冬牧-70, 种子购自四川惠发牧业有限公司.经3%过氧化氢溶液消毒20 min后, 冲洗晾干用温水浸种2 h, 挑选20粒颗粒饱满, 大小均匀的种子置于水培盒中, 放入恒温培养箱中22℃条件下避光催芽.3~5 d后待幼苗长至4~6 cm时, 将所有试验植株移至植物温室中进行培养, 一周后改用1/2×Hoagland营养液继续培养两周, 营养液每周更换一次.温室室内条件如下: 日温(24±2)℃, 夜温(19±2)℃, 光照强度为5 000~8 000 lx, 光照时间为12 h ·d-1.
1.2 水培试验预培养完成后, 留下水培盒中生长良好、大小和高度一致的幼苗12株, 洗净根系并擦干表面水分后进行水培试验.本试验共设6个处理: ① CK: 1/2×Hoagland营养液; ② Spd: 0.1 mmol ·L-1; ③ 5Cd: 5 mg ·L-1 Cd2+; ④ 5Cd+Spd: 5 mg ·L-1 Cd2++0.1 mmol ·L-1 Spd; ⑤ 10Cd: 10 mg ·L-1Cd2+; ⑥ 10Cd+Spd: 10 mg ·L-1 Cd2++0.1 mmol ·L-1 Spd, 每个处理设3组平行.以上处理培养液均以1/2×Hoagland营养液为基础液配制, pH值均调节为6.5~7.0, 5 d更换一次, 共处理10 d.
1.3 样品处理本试验结束后, 分别将6个处理组植株根系分离, 浸泡在20 mmol ·L-1 EDTA溶液中, 去除附着在表面的Cd2+.再依次用自来水、去离子水冲洗干净.经液氮速冻30 min后保存于-80℃条件下, 用于生理生化指标测定.再取一部分CK、Spd、10Cd和10Cd+Spd组的根系样品剪碎, 分别放入2.5 mL无RNase冻存管中, 随后立即转移至液氮中, 并在-80℃条件下保存至寄送测试.
1.4 根系生理生化指标的测定根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑法[17]; 采用曹建康等[18]的方法测定可溶性蛋白、过氧化氢(H2 O2)和丙二醛(MDA)含量.参考侯福林[17]的氯化硝基氮蓝四唑法和愈创木酚法测定超氧物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性.抗坏血酸(ASA)含量的测定参考陈建勋等[19]的方法, 还原型谷胱甘肽(GSH)含量采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定.
1.5 文库构建和Illumina测序黑麦草总RNA提取、纯化、建库和无参考基因组序列的转录组高通量测序均由上海美吉生物有限公司完成.
1.6 转录组学分析采用RSEM(RNA-seq by expectation-maximization)软件对组装出的Unigene进行定量, 得到每个样品比对到每个基因上的read count数目, 并对其进行FPKM(fragments per kilobases per millionreads)转换分析基因的表达水平.根据得到的基因表达量信息, 使用基于负二项分布的DESeq2软件(v1.24.0)对raw counts进行统计分析, 以Fold change≥2.00和P-adjust < 0.05为筛选条件得出差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs).参照GO数据库, 对差异表达的Unigenes进行GO注释分类, 用Goatools软件(v0.6.5)将DEGs注释到GO数据库中进行富集分析, 最后根据GO富集分析结果完成基因表达热图分析.
2 结果与分析 2.1 外源Spd对Cd胁迫下黑麦草根系耐性生理的影响由于植物根系与环境中的Cd2+直接接触, 其对Cd胁迫的应激最为迅速.图 1显示的是外源Spd对Cd胁迫下黑麦草根系耐性生理的影响, 5 mg ·L-1和10 mg ·L-1 Cd处理下, 黑麦草根系活力、可溶性蛋白含量和SOD活性均显著降低; POD活性的变化趋势略有不同, 仅在5 mg ·L-1 Cd处理时下降了33.24%(P < 0.05).此外, 与上述对应的还有氧化胁迫产物MDA、H2 O2以及内源抗氧化剂ASA和GSH含量的上升(P < 0.05), 其中10 mg ·L-1 Cd处理中四者的上升幅度要明显大于5 mg ·L-1 Cd, 表明黑麦草的Cd毒害效应具有浓度依赖性特征.外源添加0.01 mmol ·L-1 Spd明显缓解了Cd的胁迫效应, 与5 mg ·L-1和10 mg ·L-1 Cd单独处理相比, 可溶性蛋白含量分别显著上升了90.91%和158.35%, POD活性分别显著上升了23.66%和11.13%; MDA含量分别显著下降了40.39%和36.55%, H2 O2含量分别显著下降了16.67%和13.85%, 仅SOD活性与根系活力无显著变化.ASA和GSH含量则只在5 mg ·L-1 Cd联合Spd处理时上升显著.如上所述, 外源Spd调控黑麦草根系响应Cd胁迫主要体现在促进可溶性蛋白合成, 其次是提高抗氧化物质的活性和含量, 降低Cd诱导的氧化胁迫伤害.
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不同小写字母表示处理间的差异显著性(Duncan多重检验, P < 0.05) 图 1 外源Spd对Cd胁迫下黑麦草根系耐性生理的影响 Fig. 1 Effect of exogenous Spd on the root tolerance physiology of ryegrass under Cd stress |
基于Cd胁迫下黑麦草根系生理学指标的变化, 本研究发现10 mg ·L-1 Cd对黑麦草根系的毒害作用更为明显.因此, 选取CK(R-CK-1~3)、Spd(R-Spd-1~3)、10Cd(R-10Cd-1~3)和10Cd+Spd(R-10Cd+Spd-1~3)这4个处理组, 共12个根部样品进行转录组测序.测序结果如表 1所示, Q20均大于97%, Q30均大于93%, GC含量均大于55%, 表明测序结果质量较好, 满足后续分析对测序质量的要求.对所有样本Clean Data进行从头组装, 一共得到125 018条Unigenens, 且长度均大于200 bp, 平均长度为1 022.84 bp, N50的长度为1 636 bp.
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表 1 转录组测序数据统计 Table 1 Transcriptome sequencing data analysis |
2.3 Unigene功能注释及分类
将本次转录组测序获得的所有Unigenes与六大数据库(NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG数据库)进行比对, 获得在各数据库中的注释信息, 并对注释情况进行统计.如表 2所示, 注释到Unigenes最多的为NR数据库, 有81 664条(65.32%).其余的按数目大小依次为COG数据库74 509条(59.60%)、GO数据库64 244条(51.39%)、Pfam数据库57 219条(45.77%)、Swiss-Prot数据库54 853条(43.88%)和KEGG数据库34 737条(27.79%).可被注释到的Unigenes数目为91 167条(72.92%), 然而被全部数据库注释到的仅有24 198条(19.36%), 表明黑麦草中仍有很大一部分Unigenes的功能还没有被明确, 其基因文库的构建亟待完善.
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表 2 Unigenes功能注释统计 Table 2 Unigenes function annotation statistics |
进一步地, 通过Unigens在COG数据库中的注释结果来评估本次研究转录组数据的有效性和完整性, 对所获得的Unigenes进行功能分类, 结果如图 2所示, 共有74 509条Unigenes被划分到23个功能类型, 其中, 数量最多的分布在功能未知类(S: function unknown)(43 176条, 57.95%), 说明黑麦草对Cd胁迫的响应过程中仍存在许多没有被探明的分子机制.其次Unigenes分布较多的功能类型还有翻译后修饰, 蛋白质折叠和伴侣蛋白(O: posttranslational modification, protein turnover, chaperones)和信号转导机制(T: signal transduction mechanisms), 各有4 984和5 018条, 分别占总数的6.69%和6.73%.这些生理过程在植物响应外界胁迫方面发挥着重要的作用[20], 表明该转录组数据比较贴合植物逆境响应胁迫规律, 也为阐明黑麦草对Cd胁迫的响应提供了十分有价值的信息.
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A.RNA加工修饰, B.染色质结构和动力学, C.能量合成和转换D.细胞周期控制、细胞分裂和染色体分裂, E.氨基酸转运代谢, F.核苷酸转运和代谢, G.碳水化合物转运代谢, H.辅酶转运和代谢, I.脂肪转运代谢, J.翻译, 核糖体结构和生物合成, K.转录, L.复制, 重组和修复, M.细胞壁/膜/包膜的生物合成, N.细胞运动, O.翻译后修饰, 蛋白质折叠和伴侣蛋白, P.无机离子转运代谢, Q.次生代谢物生物合成、转运和代谢, S.功能未知, T.信号转导机制, U.胞内转运、分泌和小泡运输, V.抵御机制, Y.核酸结构, Z.细胞骨架 图 2 Unigenes的COG功能分类 Fig. 2 COG function classification of Unigenes |
获得基因的read counts数目后, 可对不同处理样品进行组间基因的差异表达分析, 鉴定出组间DEGs.不同组间的基因差异表达情况如图 3所示(基因数目未标注).与CK组相比, Spd处理上调了1 086个基因和下调了475个基因, 且两者均在0 < log2(FC) < 5内聚集.DEGs数目最高的为10Cd处理组, 共有6 760个, 其中有3 647个基因上调和3 113个基因下调.与Spd处理相比, 基因差异表达显著性出现了明显的上升, 分布区间扩大为0 < log2(FC) < 10.而添加Spd后, DEGs数目下降至3 550个, 其中以上调基因数目的下降为主(仅有1 267个), 下调基因数目为1 886个, 基因差异表达显著性明显降低, 分布区间有所收窄(主要聚集在0 < log2(FC) < 5), 表明外源Spd对黑麦草根系响应Cd胁迫的分子机制具有负调控作用, 即抑制Cd胁迫响应基因的差异表达.
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图 3 不同处理条件下黑麦草根系的差异表达基因 Fig. 3 Differentially expressed genes in ryegrass roots under different treatments |
将不同组间的DEGs分别注释到GO数据库中, 结果如图 4所示.所有处理组DEGs的GO注释结果相似, 主要分布类别均为生物学过程(biological process, BP)中的细胞过程(metabolic process)和代谢过程(cellular process)、细胞组分(cellular component, CC)中的细胞部分(cell part)和膜部分(membrane part), 以及分子功能(molecular function, MF)中的结合(binding)和催化活性(catalytic activity).其中, 10Cd组的DEGs注释到的数目要显著高于其他处理组, 表明黑麦草响应Cd胁迫与上述类别中基因的差异表达有关.杨岚鹏等[21]也持类似观点, 其关于栾树(Koelreuteria paniculata Laxm.)阻止Cd离子的迁移表型的研究结果表明, 栾树转录组响应Cd胁迫强弱先是由生物学过程和细胞组分响应信号传导转录响应, 再依次递减信号或转导给膜组分和催化氧化等生物学功能.与之相比, 施加外源Spd显著降低了各分类中DEGs的数目, 这和上述差异基因表达量分析的结果相吻合, 进一步说明Spd可有效抑制根系对Cd胁迫的分子生物学响应.
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图 4 差异表达基因的GO注释分类 Fig. 4 GO annotation classification of differentially expressed genes |
图 5列出了不同组间DEGs富集程度前20的GO term(筛选阈值为P-asjust≤0.05).如图所示, Spd和CK两组间DEGs富集最显著的部分是BP中的丙酸盐代谢过程(propionate metabolic process)、丙酸盐分解代谢过程(propionate catabolic process)、短链脂肪酸代谢过程(short-chain fatty acid metabolic process)、丙酸盐分解代谢过程, 2-甲基柠檬酸循环(propionate catabolic process, 2-methylcitrate cycle)和短链脂肪酸分解代谢过程(short-chain fatty acid catabolic process).10Cd和CK两组间DEGs主要显著富集在BP中的响应有机环状化合物(response to organic cyclic compound)和MF中的醛基/酮基转移酶活性(transferase activity, transferring aldehyde or ketonic groups).而添加Spd后, DEGs富集程度最高的部分变为BP中的响应三价铁离子[response to iron (Ⅲ) ion]和MF中的2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性(2′-deoxymugineic-acid 2′-dioxygenase activity).
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a1.光合系统, a2.光合系统Ⅱ, a3.光合系统Ⅰ, a4.丙酸盐-CoA连接酶活性, a5.FMN结合, a6.过氧化物酶活性, a7.酸硫醇连接酶, a8.CoA连接酶活性, a9.响应氧化胁迫, a10.活性氧代谢过程, a11.硫化合物生物合成过程, a12.乙酸盐代谢过程, a13.来自乙酸的乙酰辅酶A生物合成过程, a14.光合作用, 光合系统Ⅰ的光捕获, a15.光合作用, 光捕获, a16.短链脂肪酸的分解代谢过程, a17.丙酸盐分解代谢过程, 2甲基柠檬酸盐循环, a18.短链脂肪酸的代谢过程, a19.丙酸盐分解代谢过程, a20.丙酸盐代谢过程; b1.多糖代谢过程, b2.细胞壁组织, b3.活性氧代谢过程, b4.过氧化氢代谢过程, b5.过氧化氢分解代谢过程, b6.响应有机环状化合物, b7.细胞壁, b8.质膜锚定成分, b9.质膜固有成分, b10.质外体, b11.膜锚定成分, b12.植物型细胞壁, b13.羧酸结合, b14.有机酸结合, b15.过氧化物酶活性, b16.N-酰基磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶D活性, b17.磷脂酶D活性, b18.谷胱甘肽转移酶活性, b19.酶抑制剂活性, b20.醛基/酮基转移酶活性; c1.外部封装结构, c2.细胞壁, c3.植物型细胞壁, c4.过渡金属离子跨膜转运蛋白活性, c5.锌离子跨膜转运蛋白活性, c6.磷酸二酯水解酶活性, c7.N-酰基磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶D活性, c8.磷脂酶D活性, c9.脂肪酶活性, c10.2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性, c11.脂肪酸生物合成过程, c12.脂肪酸代谢过程, c13.甘油脂分解代谢过程, c14.活性氧代谢过程, c15.脂质分解代谢过程, c16.响应铁离子, c17.脂氧化脂肪酸代谢过程, c18.脂氧化物生物合成过程, c19.磷脂酰胆碱代谢过程, c20.响应三价铁离子 图 5 差异表达基因的GO富集分析 Fig. 5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes |
植物响应重金属胁迫的基因表达研究已取得不少成果, 鉴定和推测出不少关于重金属响应的基因, 包括ABC转运家族、锌铁转运蛋白ZIP家族、重金属ATP酶家族和金属硫蛋白基因等, 这些基因对于植物细胞内重金属离子的固定以及自由基的清除具有十分重要的作用[22].值得关注的是, 本研究中也发现了金属转运蛋白相关基因对Cd胁迫的响应, 即10Cd+Spd组差异表达基因显著富集的锌离子跨膜转运蛋白活性(zinc ion transmembrane transporter activity)和响应三价铁离子, 而两者在Spd和Cd单独处理时的富集并不显著, 这说明Spd和Cd的共存可以诱导其中基因的差异表达, 或者说外源Spd存在通过上调/下调金属转运蛋白基因表达来干预植物响应Cd胁迫的可能.为了验证这一推测, 本研究进一步对两类别中的单基因进行了基因表达热图分析(为了确保结果的可靠性, 过滤掉FPKM小于1的基因).
锌离子跨膜转运蛋白活性中所涉及到的基因属于锌铁转运蛋白ZIP基因家族, 可以参与锌铁转运蛋白的合成[23].基因表达热图分析结果如图 6(a)所示, 该类别包括锌转运蛋白基因、二价铁转运蛋白基因和镉/锌转运ATP酶HMA3在内的16个基因, 表达量从高到低依次均为: R-10Cd+Spd>R-10Cd>R-CK>R-Spd.响应三价铁离子中共包括7个单基因, 主要为2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶的相关基因, 该物质是合成铁载体蛋白2′-脱氧麦根酸(2′-deoxymugineic acid, DMA)的关键酶, 与植物铁吸收和响应重金属胁迫存在密切联系[24~26].从图 6(b)可以看出, 7个基因的表达量从高到低依次同样为: R-10Cd+Spd>R-10Cd>R-CK>R-Spd.由此可知, Spd单独添加和与Cd共同添加时情况会有所不同, 只添加Spd大幅下调了两种基因的表达, 而与Cd共同添加时却表现为大幅度上调两种基因的表达, 这表明外源Spd的生理调控作用会因应用环境的不同而不同.
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(a)锌离子跨膜转运蛋白活性, (b)响应三价铁离子; 1.R-CK, 2.R-Spd, 3.R-10Cd, 4.R-10Cd+Spd; TRINITY_DN2290_c0_g1表示锌转运蛋白ZTP29-like [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN8165_c0_g1表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum], TRINITY_DN120_c0_g3表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum], TRINITY_DN2258_c0_g2表示预测蛋白[Hordeum vulgare subsp. vulgare], TRINITY_DN30520_c0_g2表示锌转运蛋白ZTP9-like [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN354_c0_g3表示二价铁转运蛋白IRT1-like [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN120_c0_g2表示锌转运蛋白ZTP10-like [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN1904_c0_g1表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum], TRINITY_DN117808_c0_g2表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum], TRINITY_DN12364_c0_g1表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum], TRINITY_DN2258_c0_g1表示锌转运蛋白ZTP10-like [Hordeum vulgare], TRINITY_DN13047_c0_g1表示假定非活性镉/锌转运ATP酶HMA3 [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN1916_c0_g1表示未命名蛋白产物[Triticum aestivum], TRINITY_DN8071_c0_g1表示锌转运蛋白ZTP3-like [Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN120_c0_g1表示预测蛋白[Hordeum vulgare subsp.vulgare], TRINITY_DN21780_c0_g1表示未命名蛋白产物[Triticum turgidum subsp. durum]; TRINITY_DN88050_c0_g1表示2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶[Hordeum vulgare], TRINITY_DN2479_c0_g1表示2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶[Brachypodium distachyon], TRINITY_DN4983_c0_g1表示FAR1蛋白相关序列3-like[Aegilops tauschii subsp. tauschii], TRINITY_DN55457_c0_g1表示2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶[Hordeum vulgare], TRINITY_DN55457_c0_g2表示2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶[Hordeum vulgare], TRINITY_DN21129_c0_g1表示缺铁特异性基因Ids3 [Hordeum vulgare subsp. vulgare], TRINITY_DN21129_c0_g2表示缺铁特异性基因Ids3 [Hordeum vulgare subsp. vulgare] 图 6 差异表达基因的热图分析 Fig. 6 Heat map analysis of differentially expressed genes |
由于人类生产活动, 大量的重金属进入环境中, 并随着食物链逐级在生物体内过量积累, 对人体健康乃至生态系统的安全和稳定造成潜在威胁.其中, 植物作为食物链最底层的“生产者”, 对重金属的响应特征尤为明显, 其根系是抵御重金属胁迫的“第一道防线”, 它的生理学变化用来反映重金属毒害作用的强弱更具有代表性.本研究发现, Cd胁迫引起了黑麦草根系耐性生理的显著变化, 主要包括MDA、H2 O2、ASA、GSH含量的上升, 以及根系活力、可溶性蛋白含量和抗氧化酶(POD、SOD)活性的下降.这是由于环境中Cd2+通过细胞渗透作用进入根部细胞, 与细胞内酶活性中心或蛋白质中巯基结合, 抑制蛋白质合成和酶的活性[27], 此时活性氧物质的生成速率超过清除速率, 植物生理代谢活动受到干扰.而外源添加Spd有效缓解了上述变化的进程, 根系可溶性蛋白含量、抗氧化指标参数均有所提升, 这可能是由于Spd在生理pH下以多聚阳离子存在, 直接与自由基结合, 清除由重金属诱导产生的·O2-, 降低植物组织细胞内的H2 O2和MDA含量, 维持植物组织细胞结构和细胞膜的相对稳定[28, 29].Spd可以参与蛋白质的合成, 刺激蛋白质合成的中间步骤, 增加酶的数量从而提高了总酶活性和非酶抗氧化剂含量, 还可抑制酸性和中性蛋白酶活性的提高, 具有促进蛋白质合成和阻止蛋白水解的双重功能[30, 31].
植物响应重金属胁迫的机制与植物种类、植物组织和胁迫强度等多种因素有关.但从根本上来说, 重金属胁迫对植物生理产生的一系列负面作用, 都是植物在分子层面上响应胁迫的体现.如Kovalchuk等[32]通过分析50 μmol ·L-1 Cd胁迫下植物基因组表达谱, 发现有65个基因表达上调和338个基因表达下调.张泽锦等[33]研究发现Cd胁迫下番茄(Lycopersicon esculentum Miller)根系主要通过上调基因表达的模式来应答Cd胁迫.因此, 研究外源Spd介导Cd胁迫下植物的转录组变化也十分有意义, 可以进一步探究外源Spd的分子调控机制.本研究与前人研究的结果相似, 10 mg ·L-1Cd胁迫时黑麦草根中均检测出大量的差异表达基因, 分别有3 647个基因显著上调和3 113个基因显著下调.添加Spd后, 上调基因降至1 267个, 下调基因降至1 886个.GO富集分析结果表明, Cd对黑麦草根部的胁迫机制与响应有机环状化合物和醛基/酮基转移酶活性联系最为密切.这可能与Cd胁迫诱导了黄酮类、酚类和苯丙烷类化合物等有机环状化合物的合成有关[34~36], 这些次生代谢物质的出现往往伴随植物根系生长环境的变化, 可以视为植物为了适应环境变化的物质基础, 往往作为胁迫指标性物质发挥重要作用[37].醛基/酮基转移酶则是磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶, 调节着磷酸戊糖途径的氧化阶段和非氧化阶段的平衡, 已被证明参与植物生长发育以及对各种环境胁迫的响应[38].与之相比, 应用外源Spd处理后富集最显著的类别为响应三价铁离子和2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性.两者均与植物对铁的吸收有关, 2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶可以催化DMA合成底物尼克酰胺(NA)氨基转移和酮酸还原后的羟基化或脱氧反应[39~41], 当DMA合成功能受到抑制时, 植物会由于无法螯合获取铁离子而造成植物缺铁[42, 43].由此可以推断, Spd可以通过影响植物对铁的吸收, 更详细地说是通过影响DMA的合成, 来缓解Cd对植物的毒害进程.
根据GO富集分析结果, 进一步研究发现, 与铁吸收相关的16个锌铁转运蛋白相关基因和7个2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性相关基因的表达量从高到低依次均为: R-10Cd+Spd>R-10Cd>R-CK>R-Spd.Cd胁迫诱导了根部锌铁转运蛋白基因和2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性基因的过表达, 可以解释为植物面临Cd胁迫时, 大量的Cd2+占用了Zn2+和Fe2+等必需元素离子转运通道并与锌铁转运蛋白结合, 抑制了其它营养元素的吸收[44].为了应对这种竞争性抑制作用, 植物一方面促进根系分泌DMA, 加强对环境中铁离子的获取[45], 也可通过螯合Cd2+来限制其在植物体内的移动性.另一方面, 产生多余的锌铁转运蛋白使根系获取的铁离子得以充分利用, 增强植物与体内Cd2+共存的能力.外施Spd处理进一步上调了这些基因的表达, 且表达量远高于10 mg ·L-1 Cd处理组.由此验证了外源Spd可通过影响金属转运蛋白基因的表达来缓解Cd对植物的毒害作用, 具体体现为大幅上调DMA和锌铁转运蛋白相关基因的表达水平.从生理学上看是Spd促进了DMA和锌铁转运蛋白的合成, 提高了植物对铁的吸收利用, 从而间接影响植物的耐性生理.Shevyakova等[46]也持类似观点, 其研究发现外施适量浓度的腐胺(多胺的一种)可以有效缓解镍的胁迫作用, 同时提高垂鞭绣绒球(Amaranthus hybrids)体内铁的含量.
4 结论(1) Cd胁迫致使黑麦草根系耐性生理功能下降.应用外源Spd后一定程度上减轻了Cd对黑麦草根系的负面效应, 主要是通过提高可溶性蛋白、ASA和GSH含量以及POD的活性来实现, 同时也降低了氧化胁迫产物MDA和H2 O2的含量, 仅对SOD和根系活力的影响不显著.
(2) 转录组测序结果表明, 外源Spd对黑麦草根部基因表达产生了显著影响.其可以抑制黑麦草根系Cd胁迫响应基因的差异表达, 具体表现为降低差异表达基因的数目、差异显著性和差异倍数.
(3) GO富集结果显示, Spd调控黑麦草根系响应Cd胁迫主要与“响应三价铁离子”和“2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶活性”两个类别基因的差异表达有关.进一步探究发现, Spd处理上调了根部中锌铁转运蛋白和2′-脱氧麦根酸2′-双加氧酶相关基因的表达, 进而促进根系对铁的吸收利用, 降低植物体内Cd2+的生理毒性.
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