2023, Vol. 44
2. 中国科学院南京土壤研究所, 南京 210008
, CUI Hong-biao1,2
, LIU Xiao-sheng1 , ZHANG Xue1 , DONG Ting-ting1 , ZHANG Teng1 , ZHOU Jing2
2. Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China
生物炭是通过热解技术将废弃生物质在厌氧或限氧条件下加热直至各种纤维素和木质素分解, 生成富含碳的高度芳香化固体材料[1].由于其丰富的孔隙结构、较大的比表面积和大量的有机官能团, 生物炭的应用不仅可以提高土壤持水性能、增加阳离子交换量, 还可以吸附固定各种污染物[2, 3].虽然生物炭具有良好的环境效益, 但近年来的一些研究发现生物炭中存在一定量的潜在污染物[4~6].Koppolu等[7]研究表明, 生物质原料中的重金属(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn)在裂解后会以4~6倍浓缩倍数富集在生物炭中, 使得生物炭具有较高水平的内源重金属.此外, Liao等[8]研究表明, 在生物质原料中存在过渡金属的情况下, 热解过程中会产生持久性自由基(persistent free radicals, PFRs).这些PFRs在水相中诱导的高活性羟基自由基(·OH), 对种子萌发和植物生长产生显著的负面影响.生物炭中内源污染物具有一定的环境毒性, 在使用过程中可能会造成二次污染.例如, Liu等[9]发现玉米芯生物炭释放的重金属对土壤微生物活性具有一定的抑制作用; Oh等[10]观察到生物炭上的PFRs会破坏细胞膜并抑制种子萌发和幼苗生长.因此, 生物炭规模化应用前, 有必要关注其内源污染物潜在的环境风险.
为了限制生物炭内源污染物可能产生的潜在风险, 国际上一些机构对生物炭内源污染物限值作出了规定, 但对同一污染物的限值标准并未统一, 例如：国际生物炭协会(Internet Biochar Initiative, IBI)规定生物炭中ω(Cd)范围为1.40~39.0 mg·kg-1, 美国国家环保署(Environmental Protection Agency, EPA)对用于土地处理的生物性固体废弃物中Cd所规定的安全限值为10.0 mg·kg-1, 而欧洲生物炭认证(European biochar certificate, EBC)要求生物炭中ω(Cd)小于1.50 mg·kg-1.在我国, 农业农村部发布的《耕地污染治理效果评价准则》(NY/T 3343-2018)规定：治理所使用的有机肥、土壤调理剂等耕地投入品中镉、汞、铅、铬和砷这5种重金属含量, 不能超过GB 15618-2018规定的筛选值, 或者治理区域耕地土壤中对应元素的含量, 但是该准则未限定修复产品的使用量.如果将含有较高内源污染物的生物炭长期应用于土壤, 极有可能产生新的环境问题.因此, 在当前我国尚未有生物炭内源污染物限值标准的背景下, 关注不同来源生物炭内源污染物的分布特征及其生物毒性具有重要的现实意义.
基于此, 本研究采集清洁区和2个不同污染区土壤生长的巨菌草, 制备具有不同内源污染物含量的生物炭, 考察3种生物炭中内源重金属及PFRs的分布, 分析生物炭浸出液对小麦种子根伸长及抗氧化酶活性的影响, 评估其潜在生物毒性, 以期为生物炭的安全应用提供理论指导.
1 材料与方法 1.1 生物炭制备供试巨菌草茎分别采集自江西省鹰潭市中国科学院红壤生态实验站(28°12′N, 116°55″E, 清洁区)、鹰潭市贵溪市滨江乡水泉村和九牛岗村(28°19′N, 117°12″E; 28°10′N, 117°12″E, 污染区).因为污染区的主要污染物是铜(Cu)和镉(Cd)[11], 所以本研究中生物炭内源重金属仅关注Cu和Cd.巨菌草茎用去离子水洗净并烘干, 剪至1~1.5 cm的小段备用; 将剪碎后的巨菌草茎放入陶瓷坩埚并加盖, 置于马弗炉中以5℃·min-1的升温速率于400℃下热解2 h, 并通入氮气进行保护; 冷却后取出, 研磨过100目筛, 室温下于干燥器中储存备用, 并分别记为水泉、九牛和红壤生物炭.由于低温(≤300℃)下生物炭芳香化效果不佳, 吸附固定能力低, 而高温(≥500℃)热解下生物炭吸附固定效果好但产率较低, 400℃时生物炭的产率较高, 故选取400℃为热解温度[12~14].
1.2 生物炭主要性质及内源重金属分析生物炭pH在固液比为1 ∶20的条件下测定[15]; 采用元素分析仪(Vario macrocube, Elementar, 德国)分析生物炭的元素组成; 采用表面积分析仪(Auto-sorb-iQA3200-4, QUANTATECH, 美国)测定生物炭比表面积.
生物炭重金属全量的分析采用HNO3-HF-HClO4三酸(2∶1∶1)消解, 酸溶态Cu和Cd分析采用BCR连续提取方法：称取0.5 g生物炭置于50 mL聚乙烯离心管中, 加入20 mL 0.11 mol·L-1冰乙酸, 于恒温振荡器(20℃)中振荡16 h后, 以3 000 r·min-1转速离心40 min, 取上清液待测.实验中土壤、巨菌草和生物炭消解液采用原子吸收分光光度法(北京普析通用仪器有限公司, A3, 配备石墨炉)测定Cu和Cd全量及酸溶态含量.
1.3 生物炭中自由基的表征采用电子顺磁共振波谱仪(型号E500-9.5/12 E5010003)分析生物炭粉末自由基, 微波功率为27 dBm(0.5 W), 扫描时间为80 ms.由Xepr软件内置标线Quantitative EPR得到自旋数, 采用自旋数/质量定量自由基, 并通过Xepr软件转化得到g-factor值.
1.4 小麦根伸长实验采用王苑樱[16]的方案提取生物炭浸出液, 称取1.0 g生物炭于50 mL离心管中, 加入25 mL去离子水, 于恒温振荡器(25℃, 100 r·min-1)中振荡20 h后, 以4 000 r·min-1转速离心20 min, 取上清液用0.45 μm滤膜(玻璃纤维) 过滤后冷藏保存(4℃).
小麦根伸长实验：取健康小麦种子若干, 浸入1%的NaClO溶液中约30 min, 然后用去离子水彻底冲洗种子.每组取20粒种子置于玻璃培养皿(直径90 mm)中的滤纸上, 加入5 mL生物炭浸出液润湿(对照组用5 mL去离子水), 盖好玻璃培养皿[17].种子在25℃黑暗中培养48 h, 用游标卡尺量取小麦种子的主根长, 并计算根伸长抑制率：
根长抑制率=(对照组平均根长-处理组平均根长)/对照组平均根长×100%
1.5 小麦幼苗中抗氧化酶测定称取0.2 g用去离子水洗净的小麦根, 置于研钵(预冷)中, 分3次加入1.6 mL的50 mmol·L-1磷酸缓冲液(预冷, pH=7.8)并研磨成匀浆, 转移至离心管中, 用高速冷冻离心机在4℃下以12 000 r·min-1转速离心20 min, 取出上清液, 即为酶粗提液.
超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT) 法[18], 以抑制NBT光化学还原50%为一个酶活性单位(U); 过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[19], 以每分钟D值增加0.01为一个酶活性单位(U); 过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法[20]测定, 以每分钟D值减少0.01为一个酶活性单位(U).
1.6 数据分析采用Excel 2019软件整理数据; Origin 2021进行绘图; SPSS 16.0统计软件对数据进行方差分析.
2 结果与讨论 2.1 生物炭理化性质由于生物质原料均为巨菌草茎, 因此3种生物炭pH未有显著性差异(10~10.5, 表 1).九牛生物炭的比表面积(SBET)最高(61 m2·g-1), 是水泉生物炭SBET的1.74倍.3种生物炭中碳元素含量最高(63.1% ~69.6%), 其次是氧元素(25.3% ~31.4%), 氢、氮及硫元素相对含量最低(< 4%), 这与Usman等[21]研究的结果相同.H/C、O/C和(O+N)/C可以用来衡量生物炭芳香性、亲水性和极性[22], 因此, 与水泉和九牛生物炭相比, 红壤生物炭具有更高的芳香性和更低的亲水性与极性.
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表 1 生物炭的pH、元素组成及原子比 Table 1 Biochar pH, element composition, and atomic ratios |
2.2 生物炭内源污染物分布特性 2.2.1 生物炭内源全量和酸溶态重金属分布
由图 1可知, 水泉村和九牛岗村土壤中Cu和Cd含量显著高于红壤站土壤重金属, 分别为《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准》(GB 15618-2018)中Cu风险筛选值[5.5 < pH≤6.5, ω(Cu)=50 mg·kg-1]的3.04倍和16.32倍, Cd风险筛选值[ω(Cd)=0.3 mg·kg-1]的3.67倍和3.27倍.本研究中规定, 污染物含量未超过筛选值的为无污染; 1~2倍(含)之间的, 为轻微污染; 2~3倍(含)之间的, 为轻度污染; 3~5倍(含)之间的, 为中度污染; 5倍以上的, 为重度污染; 且土壤污染程度以土壤中单个重金属超标倍数最高的为准.因此, 红壤站、水泉村和九牛岗村土壤分别为清洁、中度污染和重度污染.
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相同小写字母表示不同处理间无显著差异(P>0.05), 不同小写字母表示处理间存在显著差异(P < 0.05) 图 1 土壤、秸秆和生物炭Cu和Cd全量及生物炭酸溶态Cu和Cd含量 Fig. 1 Total Cu and Cd in soil, straw, and biochar and acid-soluble Cu and Cd in biochar |
与土壤中Cu和Cd全量分布规律相同, 巨菌草秸秆及其制备的生物炭中Cu和Cd含量分别表现为：九牛>水泉>红壤和水泉>九牛>红壤.其中九牛生物炭Cu和水泉生物炭Cd含量分别是红壤生物炭的3.73倍和4.43倍, 且3种生物炭中Cd含量均超过了EBC标准中规定的限值(1.5 mg·kg-1), 可能会造成环境的二次污染.这主要是由于热解过程中有机组分易被分解挥发, 导致其与重金属之间的结合位点被破坏[23], 大量的重金属被保留在生物炭中.此外, 3种生物炭中Cu和Cd含量分别是生物质原料中的2.64~5.19倍和1.43~3.75倍.与本研究相似, Yang等[24]研究表明, 生物质原料中的重金属(Cu、Cd和Zn)会以1.18~3.30倍浓缩在生物炭中.酸溶态重金属是最具迁移性的部分, 具有较高的生物有效性[25], 因此本研究进一步分析了生物炭中酸溶态Cu和Cd的分布特征.结果显示, 九牛生物炭中酸溶态ω(Cu)达到0.98 mg·kg-1, 是水泉和红壤生物炭的3.32倍和2.84倍; 水泉生物炭中酸溶态ω(Cd)达到0.64 mg·kg-1, 是九牛和红壤生物炭的1.56倍和7.95倍, 这与生物炭中重金属总量表现出相似的规律.以上研究表明, 来源于污染区土壤生物炭含有的重金属具有较高的生物有效性, 具有潜在的环境风险, 需要科学评估其应用中可能产生的二次污染问题.
2.2.2 生物炭自由基分析生物炭中PFRs的种类可以根据g-factor值判断[26]：① g-factor>2.004 0, 以氧原子为中心的自由基(其中g-factor>2.004 5时为半醌自由基); ② 2.003 0 < g-factor < 2.004 0, 具有相邻氧原子以碳为中心的自由基; ③ g-factor < 2.003 0, 以碳原子为中心的自由基.由图 2可知, 水泉、九牛和红壤生物炭粉末g-factor分别为2.003 035、2.003 000和2.003 005.因此, 本研究3种生物炭中形成的PFRs均是具有相邻氧原子以碳为中心的自由基.与该研究相似, Zhang等[27]研究表明在400℃热解温度下不同热解时间制备的生物炭中产生的PFRs均是具有相邻氧原子以碳为中心的自由基.
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(a)、(b)和(c)依次为水泉、九牛和红壤生物炭粉末EPR图谱, (d)为持久性自由基含量(spins·g-1表示自旋数/质量) 图 2 水泉、九牛和红壤生物炭粉末EPR图谱及持久性自由基含量 Fig. 2 EPR spectrum and persistent free radical concentration of Shuiquan, Jiuniu, and Hongrang biochar powder |
如图 2(d)所示, 红壤生物炭中PFRs含量最高(1.51×1019 spins·g-1), 较九牛和水泉分别增加了12.7%和20.8%. 由于本研究中制备3种生物炭的原材料种类及热解条件一致, 推测由于土壤污染导致生物炭内源重金属含量不同是上述PFRs含量存在差异的主要原因.如Fang等[28]研究表明, 适宜浓度的过渡金属离子(如Fe3+、Cu2+、Ni2+和Zn2+等)负载于生物质后进行高温热解处理, 增加了生物炭中的PFRs含量.这个过程中PFRs的形成主要是由于过渡金属(金属氧化物)能够介导有机物表面的电子转移：在热解过程中通过化学吸附转移到生物质上, 然后将电子从聚合物转移到金属中心, 促进PFRs的形成[29].然而红壤生物炭(重金属含量最低)中PFRs含量最高, 这可能是因为生物炭内源重金属与通过外源添加负载重金属对生物炭PFRs的形成具有不同的作用.尽管如此, 目前关于内源重金属含量对PFRs含量的影响机制暂不明确, 还有待于进一步研究.此外, 生物炭中木质素、纤维素和半纤维素是生物炭中PFRs形成的主要前体[30], 在热解过程中可能分解形成芳香族分子前体, 暴露于空气后转化为PFRs.如Liao等[8]研究表明, 木质素衍生的生物炭比纤维素生物炭产生更高的EPR信号.Fang等[31]研究同样表明, 松针生物炭PFRs含量是小麦秸秆生物炭的两倍.因此, 不同区域的巨菌草中木质素和纤维素等组成比例也可能是导致3种生物炭中PFRs含量差异的原因.
2.3 生物炭生物毒性分析由图 3(a)可知, 九牛和红壤生物炭浸出液对小麦根伸长均表现出显著的抑制作用.九牛生物炭浸出液对小麦根伸长抑制率最高, 分别较水泉和红壤生物炭增加了12.14倍和1.11倍.与本文的研究结果相同, Liao等[8]和Fang等[31]研究表明, 水稻秸秆等生物炭可以在液相环境中激发活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生, 损伤种子萌发, 抑制幼苗生长.
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相同小写字母表示不同处理间无显著差异(P>0.05), 不同小写字母表示处理间存在显著差异(P < 0.05) 图 3 生物炭浸出液对小麦根长、根伸长抑制率及幼苗SOD、POD和CAT活性的影响 Fig. 3 Wheat root length, root elongation inhibition rate, and SOD, POD, and CAT activities of wheat seedlings affected by biochar leaching solutions |
植物在生长过程中受到逆境胁迫时, 会直接或间接形成过量的活性氧(ROS), 其对细胞膜系统、脂质、蛋白质和核酸等大分子具有很强的破坏作用[32].此时, 植物体内存在的保护酶系统, 如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)等为了清除植物体内多余的ROS, 减少ROS对根系的损害[32, 33], 会通过提高酶活性的方式来防御逆境胁迫.因此, 抗氧化酶活性的大小体现了植物膜质过氧化的程度, 可以用来反映生物炭浸出液对小麦幼苗的生物毒性.由图 3可知, 3种生物炭浸出液处理的小麦幼苗中SOD、POD和CAT活性均较对照有不同程度地提高(8.0% ~603.7%).其中, 九牛和红壤生物炭浸出液处理的小麦幼苗中SOD、POD和CAT活性均显著高于对照组, 九牛处理组中POD和CAT活性较对照分别增加了603.7%和109.4%, 红壤处理组中SOD活性较对照增加了104.6%. 有研究表明, 重金属对植物酶活性的影响大多表现为“低促高抑”的现象, 如万永吉等[34]研究发现, 秋茄幼苗根系和叶片SOD活性随着生境Cr(Ⅲ)胁迫浓度的提高均呈现出先上升后下降的变化趋势, 表明当植物遇到胁迫时会采取各种措施提高自身抗性以抵御不良环境; 但当胁迫增强并超过植物忍受极限时, 其防御措施会相应减弱, 脂质和生物大分子发生强过氧化反应, 破坏细胞的膜结构, 导致凋亡.因此, 本研究中3种生物炭浸出液均导致小麦体内出现氧化胁迫, 但抗氧化酶仍处于对胁迫的正常应激反应中.这是由于本研究中生物炭内源重金属的生物活性总体上处于较低的水平, 因此对小麦幼苗酶活性表现为促进作用.
另外, 生物炭中的PFRs可以在环境介质中诱导具有高植物毒性和细胞毒性的ROS的形成, 产生潜在的环境风险[35].如Liao等[8]的研究表明, 生物炭的浸出液中检测出·OH, 且PFRs对小麦根和芽产生质膜损伤.Zhang等[27]研究发现松针生物炭中的PFRs不仅诱导水中非细胞ROS(例如·OH)的产生, 而且诱导水生藻类细胞ROS和SOD活性上调, 导致氧化损伤.因此, 本文推测虽然水泉生物炭比红壤生物炭的重金属含量高, 但由于红壤生物炭中存在较多含量的PFRs, 导致其对小麦幼苗酶活性的影响比水泉生物炭要高.但在实际土壤中, 生物炭释放的重金属可能与土壤中的黏土矿物(如铁氧化物、蒙脱石和高岭石等)发生强烈的吸附作用[36~38], 与土壤有机质中的官能团结合形成有机碳-金属配合物[39~41].生物炭释放的自由基也可能会与土壤中矿物和有机质发生猝灭反应, 如羟基自由基会与溶解性有机质(DOM)反应, 改变DOM的分子组成等[42~44].虽然土壤可以降低生物炭的内源污染物的生物有效性, 但先前的研究表明高内源污染物(重金属和PFRs等)添加到土壤后, EPR信号或重金属活性均有所提高[9, 45].因此, 后期有待于进一步研究生物炭添加土壤后, 其内源污染物的潜在环境风险及生物毒性.
本研究表明不同污染区原料制备生物炭中内源污染物存在显著差异, 生物炭内源重金属和PFRs共同作用, 抑制了小麦的根伸长, 提高了小麦幼苗抗氧化酶活性, 对小麦幼苗生长产生一定的生物毒性.因此, 未来需要进一步评估生物炭内源重金属和PFRs对小麦幼苗抗氧化酶活性的抑制机制, 明确其潜在的环境风险.此外, 生物炭中存在的多环芳烃、挥发性有机物和焦油等污染物也可能对植物的生长造成胁迫损伤[5, 46, 47].因此, 未来需要关注不同原料制备生物炭内源污染物的分布特征, 明确不同生物炭的用量及施用方式对环境微生物与动植物的生物毒性, 全面评估生物炭内源污染物可能产生的环境风险, 为生物炭安全应用提供理论支撑.
3 结论最高含量的内源全Cu、全Cd及其酸溶态Cu和Cd分别来自于污染区九牛和水泉生物炭, 但是来自于清洁区红壤生物炭含有最高含量的PFRs; 3种生物炭浸出液对小麦根伸长抑制率、POD和CAT活性均表现为：九牛>红壤>水泉; 对小麦幼苗SOD活性表现为：红壤>九牛>水泉.本研究结果表明, 不同污染区生物炭中内源重金属和PFRs共同作用, 抑制了小麦的根伸长, 提高了小麦幼苗抗氧化酶活性.因此, 未来有必要加强生物炭内源污染物环境风险的研究, 全面认识其潜在生物毒性.
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