2023, Vol. 44
随着工业化的飞速发展, 矿山开采伴随着大量废弃物的堆积, 不但占用了大量的土地资源, 而且对周边生态环境带来了难以修复甚至不可修复的严重后果[1, 2].尾矿作为矿山开采过程中的废弃堆积物, 尾矿区作为矿区废弃物的主要储存点, 其种类复杂多样、分布广泛且数量繁多.目前, 尽管对矿区土壤的修复治理研究进行了几十年, 但尾矿和其周边污染治理仍然是一个巨大的挑战[3].2019年重点调查工业企业显示, 目前我国尾矿产生废物量高达10.3亿t[4], 尾矿中含有的废气、废水、固体废弃物等污染物易渗入土壤造成污染, 并对人类健康构成潜在危害[5~7].土壤作为植物生长发育的养分供给站, 土壤微生物作为土壤中最为活跃的生命组分之一, 在有机质分解、养分循环和土壤肥力维持等方面有着重要的作用[8~10], 同时被认为是评价土壤质量和指示生产力的重要指标[11].因此, 关于土壤微生物群落变化以及环境因子对其调控机制的研究是当前生态学家重点研究的方向之一.
土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分[12].土壤中含有地球上最丰富的微生物群落, 参与多种重要的生态功能, 在调节地球生物化学过程中往往对土壤环境因子变化十分敏感[13, 14].有研究指出, 特定生境中的微生物群落结构能够在一定程度上反映出环境的健康状态, 地上植被通过代谢过程也能侧面响应微生物丰富度变化, 最终影响生态系统[15~17].景炬辉等[18]对中条山十八河尾矿废弃地不同恢复阶段(1~45 a)的土壤细菌群落结构进行研究, 发现不同恢复年限的土壤中微生物群落结构差异显著, 而土壤理化因子和重金属含量是群落结构变化的关键因素; 李艺等[19]发现土壤钾、钙和钠含量变化影响了矿区剖层土固氮微生物群落结构和多样性; 目前, 已有研究关注扰动矿区土壤微生物群落及多样性的影响, 但是关于尾矿对周边土壤微生物群落和功能特征的系统性研究较少.因此, 研究尾矿不同污染程度土壤微生物群落结构变化以及了解生态功能特征对后期尾矿生态环境恢复和可持续经营具有重要意义.
本文选择山西省大同支家地铅锌矿区尾矿作为研究对象, 以尾矿作为污染源, 采集重度污染区(W1)、中度污染区(W2)、轻度污染区(W3)和清洁区(CK)0~20 cm表层土壤, 通过Illumina高通量测序技术[20], 探究不同污染程度土壤细菌多样性及群落结构的影响, 揭示尾矿污染源周边功能变化以及预测其生态学功能分析, 以期为尾矿恢复治理以及后期可持续经营提供基础数据和理论支持, 并为尾矿环境管理政策的制定奠定基础.
1 材料与方法 1.1 研究区概况支家地铅锌矿位于山西省灵丘县城南高家庄乡(114°12′41″E、39°21′30″N).该地区属于温带季风大陆性气候, 气候特征为冬长夏短, 寒冷期长, 雨热同季、气温变化较大, 昼夜温差大.年平均气温7℃, 年降水量432.4 mm, 蒸发量1 500~2 000 mm, 无霜冻期平均在145 d左右.大部分降雨集中在6~9月, 但分布不均匀.矿区地形海拔高度为1 577~1 892 m, 相对高差315 m.土壤以褐土为主, 呈中性或弱碱性.
1.2 实验设计本研究以尾矿为污染源, 将尾矿边缘作为起点, 分别采集尾矿坡上(离尾矿边缘直线距离5 m)、坡中(离尾矿边缘直线距离45 m)、坡底(离尾矿边缘直线距离90 m), 并以未受扰动土壤为背景点, 分别取0~20 cm表层土壤, 每个地块面积为5 m×10 m, 每个区3个重复地块, 共12个地块.并对每个坡位地块进行重金属污染风险程度评定.
1.3 土壤取样取样时间为2021年10月, 在各个区使用内径7 cm的根钻在每个地块以“S”形五点混合采样法收集0~20 cm土层的土壤并装入自封袋, 每个地块取土混合作为一个样, 共采取12分样, 筛选土壤样品分成2份保存, 一份放在4℃冰盒中带回实验室用于土壤生物高通量测定, 另一份风干后用于土壤理化性质指标的测定.
1.4 土壤微生物DNA提取及测序DNA提取和高通量测序参考文献[21]报道进行, 可简述为：采用PowerSoil DNA分离试剂盒(MO BIO, CA, USA)提取土壤样品DNA; 为减少土壤异质性对测试结果的影响, 避免单次DNA提取的偏差, 并避免样品中DNA含量较低对测试结果的影响, 每个采样点土壤样品多次提取DNA混合后开展后续检测.采用NanoDrop 1000分光光度计法(Thermo Scientific, DE, USA)、Picogreen法(Quan-tus, PA, USA)和琼脂糖凝胶电泳方法[22]分别检测DNA的纯度、浓度和完整性.通过测试后, 以提取的基因组DNA为模板, 以338F(5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3′)为引物, 扩增16S rDNA序列的V3和V4区域, 经PCR扩增后, 进行Illumina HiSeq高通量测序[23].测序完成后, 对原始数据进行剪切、过滤、拼接得到有效数据用于后续分析, 在97%水平下将优质序列聚类成为OTU(operational taxonomic unit), 然后对OTU序列进行物种注释.计算Chao1、ACE和Shannon指数用于评估土壤细菌群落丰富度和均匀度[24].
1.5 土壤理化性质测定土壤pH值用电位法测定; 土壤有机质使用重铬酸钾容量法测定; 土壤全氮使用元素分析仪测定; 土壤全磷采用钼锑抗比色法测定; 土壤全钾采用NaOH碱熔-火焰光度计法测定; 土壤碱解氮含量用碱解扩散法测定; 有效磷含量用钼锑抗比色-紫外分光光度法测定; 速效钾含量经乙酸铵提取后用火焰光度法测定.以上指标均严格按照土壤农化分析手册中的实验步骤测定[25].
1.6 土壤重金属污染风险程度评定Nemerow综合污染指数法(PN)是指对土壤中多种重金属的污染情况进行综合评定的方法, 计算公式如下：
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式中, PN为土壤重金属综合污染指数值, Ci为第i种土壤重金属的实测浓度值(mg ·kg-1), Di为第i种土壤重金属对应的大同市土壤背景值(mg ·kg-1)[26].根据PN值的大小可将土壤重金属污染水平分为5级, PN≤0.7 (清洁)、0.7 < PN≤1 (警戒值)、1 < PN≤2 (轻度污染)、2 < PN≤3(中度污染)和PN>3(重度污染).
1.7 数据分析使用Excel 2019初步整理数据, 使用SPSS 20.0对实验数据进行正态分布检验和方差齐性检验样本实验, 数据均符合正态分布且通过了方差齐性检验, 对数据进行差异显著性检验(Duncan法, α=0.05), 使用Origin 2019作图, 使用canoco 5.0软件进行冗余分析.土壤细菌群落结构和功能预测分析借助广州基迪奥科技服务公司开发的Omicsmart软件.
2 结果与分析 2.1 重金属污染风险程度评定由表 1可知, CK的PN值为0.68, 为清洁区; W3的PN值为1.82, 为轻度污染区; W2的PN值为2.23, 为中度污染区; W1的PN值为4.45, 为重度污染区.
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表 1 大同尾矿不同坡位土壤重金属污染风险评定1) Table 1 Risk assessment of heavy metal pollution in different slope positions of Datong tailings |
2.2 土壤理化性质
由表 2可以看出, 受尾矿影响的污染区对土壤养分有显著影响, 与CK相比, 污染区显著降低了土壤TN、AN、TP、AP、AK和OM含量, 显著增加了土壤TK含量和pH值(P < 0.05).同时, 随着污染程度的减缓, 土壤TN、AN、TP、AP、AK和OM含量表现逐步上升的变化趋势, W1与CK相比分别降低了1.22g ·kg-1、103.73 mg ·kg-1、0.57 g ·kg-1、141.68 mg ·kg-1、408.80 mg ·kg-1和14.52 g ·kg-1.说明受尾矿影响的污染区严重影响土壤养分的积累, 是导致土壤养分的流失的原因之一.
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表 2 不同污染区土壤理化性质1) Table 2 Physical and chemical properties of soil in different pollution areas |
2.3 OTU数量分析
根据尾矿不同污染区土壤细菌OTU数量绘制Venn和Upset图.由图 1可知, W1、W2、W3和CK的OTU总数均值分别为3 240、3 330、3 813和3 870个, 随着污染程度加剧, OTU值呈逐渐减少的趋势; 同时, 从表 3可以看出, W1、W2与CK相比OTU总数差异性显著(P < 0.05), W3与CK差异性不显著, 说明受尾矿污染越大对土壤细菌群落影响越大, 尤其是中度污染程度以上的污染区能显著影响土壤细菌数量(P < 0.05).此外, 不同污染区土壤细菌特有OTU数也不同.W1、W2、W3和CK特有OTU数分别为456、544、601和1 291个, 且污染区与CK相比差异性显著(P < 0.05), 可以看出尾矿对周边土壤细菌影响呈逐级减弱的线性关系, 离尾矿越近, 污染风险程度越大, 土壤特有的细菌群落越少.可以看出, CK土壤细菌OTU数和特有细菌OTU数最大, 而W1土壤细菌OTU数和特有细菌OTU最小, 说明土壤细菌数的多少与土壤污染程度有关.
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图 1 土壤样品细菌OTU Venn图和Upset图 Fig. 1 Venn diagram and Upset diagram of OTU number of soil bacteria |
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表 3 不同污染区土壤细菌OTU数与特有OTU数 Table 3 OTU number and unique OTU number of soil bacteria in different polluted areas |
2.4 不同污染区土壤细菌多样性比较
通过对尾矿12份样品的16S rRNA基因V3+V4区序列进行测定, 每个样品均获得65 190条高质量的序列, 每个样品至少产生60 125条高质量的有效序列, 这些有效序列的长度大都分布在200~490 bp, 且所有检测样品的数据饱和度都在0.93以上, 证明测序结果有效且准确.
本研究通过分析α多样性, 比较ACE、Chao1和Shannon指数, 反映尾矿污染区土壤细菌群落多样性的变化趋势.从图 2可以看出, Chao1、ACE和Shannon指数的变化趋势一致, 随着远离尾矿土壤细菌群落丰富度逐渐增加.与CK相比, 污染区降低了土壤细菌群落的ACE、Chao1和Shannon指数, W1分别降低了16.03%、15.54%和20.98%, W2分别降低了15.14%、14.11%和3.59%, W1与CK相比土壤细菌α多样性差异性极显著(P < 0.01), W2中ACE指数和Chao1指数与CK相比差异性极显著(P < 0.01).从Shannon指数来看, 只有W1与CK呈极显著差异(P < 0.01), W2、W3与CK相比差异性不显著.总体来说, 受尾矿污染程度越大对土壤细菌群落丰富度和均匀度的影响较大, 随着远离尾矿, 对土壤细菌α多样性的影响逐渐减小.
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Chao1指数和ACE指数反映土壤物种丰度程度, 即数值越大, 土壤物种丰度程度越高; Shannon指数重点反映土壤物种均匀度, 即数值越大, 物种越均匀; ns表示差异性不显著(P>0.05), *表示差异性显著P < 0.05, **表示差异极较显著P < 0.01, ***表示差异性极显著P < 0.001 图 2 尾矿不同污染区土壤细菌α多样性(Chao1、ACE和Shannon指数)比较 Fig. 2 Comparison of bacterial α diversity (Chao1, ACE, and Shannon index) in soils with different pollution areas of tailings |
不同污染区土壤细菌群落相对丰度在门水平上排名前3的菌群依次为：放线菌门(β-Actinobacteria)、变形菌门(β-Proteobacteria)和绿弯菌门(β-Chloroflexi), 占土壤细菌总OUT数的68%以上, 因此, 只针对土壤细菌相对丰度在门、目、科排名前3的细菌进行Tukey HSD差异性分析.
从图 3可以看出, 在土壤细菌门水平上, 污染区中放线菌门和变形菌门的相对丰度均高于CK.与CK相比, W1极显著提高了放线菌门的相对丰度(P < 0.01), 极显著降低了绿弯菌门的相对丰度(P < 0.01), 但对变形菌门的相对丰度影响不显著.W1中放线菌门相对丰度最高为51.95%, 与CK相比丰度增加了63.41%, 为W1的优势菌种; 变形菌门次之.相反, 绿弯菌门在W1丰度最低, 在CK中的丰度为19.08%仅低于放线菌门.与CK相比, W3极显著降低了绿弯菌门的相对丰度(P < 0.01), 显著提高了变形菌门的相对丰度(P < 0.05), 但对放线菌门的影响不大.整体来看, 污染区显著影响了放线菌门和绿弯菌门的相对丰度, 且污染程度越大对其相对丰度的影响越大, 但污染程度对放线菌门和绿弯菌门相对丰度的影响表现出相反的趋势; 相反, 对变形菌门的影响不显著.在目水平上排名前3的菌群为微球菌目(γ-Micrococcales)、根瘤菌目(γ-Rhizobiales)、热微生物目(γ-Thermomicrobiales), 分别属于放线菌门、变形菌门、绿弯菌门.W1和W2中微球菌目和根瘤菌目相对丰度均高于CK; 与CK相比, W1中微球菌目、根瘤菌目和热微生物目差异性极显著(P < 0.01), 其中微球菌目与CK相比相对丰度增加了26.6%.土壤微球菌目相对丰度与污染程度呈正相关, 热微生物目与污染程度呈负相关.污染区中热微生物与CK差异性极显著(P < 0.01).在科水平上排名前3的菌群为微球菌科(δ-Micrococcaceae)、贝耶林科(δ-Beijerinckiaceae)、JG30-KF-CM45, 分别属于微球菌目、根瘤菌目和热微生物目.污染区中微球菌科和贝耶林科的相对丰度高于对照组CK; 其中, W1中微球菌科相对丰度极显著高于CK(P < 0.01), 其相对丰度增加了25.2%; W1中贝耶林科相对丰度显著高于CK(P < 0.05).相反, 随着污染程度加剧, 污染区中JG30-KF-CM45相对丰度差异性极显著(P < 0.01).
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ns表示差异性不显著(P>0.05), *表示差异性显著P < 0.05, **表示差异性极显著P < 0.01, ***表示差异性极显著P < 0.001 图 3 不同污染区土壤细菌门、目和科水平相对丰度方差分析 Fig. 3 Variance analysis of relative abundance of main bacteria at the levels of phylum, order, and family in different polluted areas |
为了进一步分析土壤理化性质对不同污染区土壤细菌群落结构的影响, 土壤细菌群落与土壤理化性质的RDA分析前两个轴分别解释了总方差的83.58%和9.77%, 共同解释土壤细菌群落结构总变异数的93.35%, 表明RDA分析结果可靠.从图 4(a)可以看出, W1、W2、W3和CK质心明显分开, 说明土壤受不同污染程度影响导致土壤细菌群落结构出现明显变化.CK中土壤细菌群落主要与TN、AN、TP、AP、AK和OM正相关, 且CK质心落在其环境因子主线上, 说明CK与其环境因子有较强的相关性; 污染区与AK和pH呈正相关, 与AK、pH的相关性大小顺序为：W3>W2>W1.
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(a)1.AP, 2.AK, 3.TP, 4.AN, 5.TN和OM; (b)X轴和Y轴分别为环境因子和门水平菌群, 通过计算获得P值; *表示差异性显著P < 0.05, **表示差异性极显著P < 0.01, ***表示差异性极显著P < 0.001 图 4 在门水平上土壤理化性质与土壤细菌群落之间的RDA分析和Spearman分析 Fig. 4 RDA analysis and Spearman analysis of soil bacterial community and soil physicochemical properties |
为进一步明确土壤细菌群落与土壤理化因子间的关系, 本研究进行了Spearman相关分析.因微球菌科和微球菌目属于放线菌门, 贝耶林科和根瘤菌目属于变形菌门, JG30-KFCM45和热微生物目属于绿弯菌门, 因此, 只对土壤细菌门水平上进行分析.从图 4(b)可以看出, 放线菌门与pH呈显著正相关(P < 0.05), 与TN、AN和OM呈显著负相关(P < 0.05); 变形菌门与pH、TK呈显著正相关(P < 0.05), 与TN、AN、TP、AK和OM呈显著负相关(P < 0.05); 绿弯菌门与TN、AN、TP、AK和OM呈极显著正相关(P < 0.01), 与pH呈极显著负相关(P < 0.01).
2.7 基于Tax4 Fun的生物代谢通路分析基于Tax4 Fun对图 5进行了行归一化处理, 以便分析不同污染区土壤细菌群落的生物代谢通路.从Tax4 Fun的预测结果来看, 随着土壤重金属污染加剧, 土壤细菌群落所参与的生物代谢呈现显著变化.W1主要参与碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、辅助因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)、核苷酸代谢(nucleotide metabolism)、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢(metabolism of terpenoids and polyketides)、复制和修复(replication and repair)、转化(translation)、其他氨基酸的代谢(metabolism of other amino acids)、折叠、分类和降解(folding, sorting, and degradation)和内分泌系统(endocrine system)等生物代谢过程；氨基酸代谢(amino acid metabolism)和膜转运(membrane transport)为W2中主要代谢过程；脂质代谢(lipid metabolism)为W3中主要代谢过程；CK主要参与能量代谢(energy metabolism)、信号传导(signal transduction)、多糖生物合成和代谢(glycan biosynthesis and metabollism)、细胞生长与死亡(cell growth and death)、细胞运动(cell motility)和其他次生代谢物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)等代谢过程.整体而言, 土壤细菌群落参与的代谢过程受土壤重金属变化的影响.土壤受不同程度污染, 各区主导的生物代谢的基因丰度差异性显著(P＜0.05), 且主导的代谢功能发生了明显的变化.以上结果进一步表明, 尾矿影响下土壤细菌群落在生物地球化学循环或代谢过程中发挥着重要作用.
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X轴和Y轴分别为不同风险区和生物代谢功能, 通过计算获得相关性R值, 色柱表示R值 图 5 基于Tax4 Fun的尾矿不同污染区土壤细菌主要生物代谢通路 Fig. 5 Main metabolic pathways of soil bacteria in different areas of tailings based on Tax4 Fun |
基于FAPROTAX对图 6进行了行归一化处理, 以便分析不同污染区土壤细菌的主要功能模式.从预测结果来看, 塑性降解(plastic-degradation)、尿素分解(ureolysis)和木质素分解(ligninolysis)是W1的主要代谢模式；亚硝酸呼吸作用(nitrite respiration)、氮呼吸作用(nitrogen respiration)、光合营养作用(phototrophy)、叶绿体合成(chloroplasts synthesis)和亚硝酸盐呼吸作用(nitrate respiration)是W2的主要代谢模式；而CK的参与的主要代谢模式较为丰富, 分别硝化作用(nitrification)、好氧亚硝酸盐氧化作用(aerobic nitrite oxidation)、锰氧化(manganese oxidation)、木聚糖分解(xylanolysis)、几丁质分解(chitinolysis)、固氮作用(nitrogen fixation)、纤维素水解(cellulolysis)和硝酸盐还原(nitrate reduction).可以看出, 受尾矿污染影响, 各区参与主要代谢模式功能基因相对丰度是不同的.与CK相比, W1功能基因主要参与了一系列降解等代谢过程, 而CK不仅参与降解的代谢过程, 在土壤中还检测到一些参与有关养分代谢等生态功能的功能基因.以上结果进一步表明, 受尾矿不同污染程度影响, 土壤细菌微生物所参与的主要代谢过程不同, 但在生物地球化学循环中发挥着重要作用.
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图 6 基于FAPROTAX的尾矿不同污染区土壤细菌生态学功能预测 Fig. 6 Prediction of soil bacterial function in different areas of tailings based on FAPROTAX |
土壤理化性质是表征土壤养分的基本指标, 土壤养分决定土壤整体肥力水平, 先前研究表明, 土壤养分中速效养分易受环境影响导致养分流失, 速效养分含量的多少直接反映土壤质量状况[27].本研究发现, 随着污染程度加剧, 土壤中AN、AK、AP和OM均呈现逐渐减少的趋势, 表明土壤养分贫瘠和土壤质量状况越来越弱, 这也与刘军等[28]和魏卫东等[29]研究的结果一致, 其原因可能是尾矿废弃物常年堆积导致地表植被与土壤结构遭受破坏, 使地表植被凋落物减少, 同时地表植物受尾矿中有害物质的毒害, 土壤稳定性降低对已凋落物残体的分解速度降低, 导致地表向地下输送的有效养分的速率降低, 土壤养分不足[30]; 另一方面尾矿有害废弃物常年堆积加上无休止地向内输送, 增加了有害物质与壤下有效养分发生钝化现象, 破坏了壤下养分平衡, 同时也是导致地表植被难以生存的原因之一.这与潘嘉雯等[31]和刘军等[32]研究的结果一致.
此外, 随着污染程度加剧伴随着土壤OM含量降低, 污染区中OM含量显著低于CK, 这与Soussana等[33]在草地-作物轮作下土壤养分变化的实验结果一致, 土壤OM含量降低主要是通过低养分条件供应和高养分条件储存机制发挥缓冲作用, 通过这种缓冲机制维持小区域生态系统的碳、氮循环, 但W1中土壤OM含量显著降低主要是极端污染胁迫导致碳、氮循坏失衡, 短时间难以维持区域碳、氮循环.本研究还发现, W1土壤pH含量显著高于CK, 其原因可能是CK土壤环境受尾矿影响较小, 地表植被相对丰度和壤下微生物丰富增加导致根系分泌物和土壤呼吸产生更多的碳酸和有机酸等酸性物质, 导致土壤酸化, 这与Evans等[30]研究的结果一致.污染条件下土壤养分损失可能会导致土壤微生物丰度和群落结构发生改变.
3.2 土壤理化因子对土壤细菌群落结构影响本研究中, 尾矿污染程度加剧显著减少了土壤细菌OTU数和改变土壤细菌群落丰度, 一方面可能是尾矿污染引起土壤理化因子的变化, 使得土壤细菌群落生长代谢所需要的养分发生改变, 尤其是碳源、氮源和磷源含量的减少, 导致土壤细菌种间竞争加剧, 这也与郑佳华等[24]研究的结果一致.不同污染程度土壤细菌群落α多样性存在差异, 土壤细菌群落相对丰度对尾矿不同污染区响应可能不一样.本研究发现, 污染区中α多样性低于CK, 其中W1土壤细菌α多样性指数均极显著低于CK, 这与付琳等[34]研究不同石油污染程度土壤细菌多样性实验的结果一致, 其原因一方面可能是由于清洁区中土壤细菌微环境的异质性更高, 使得土壤细菌多样性也更高; 另一方面受尾矿污染程度加剧, 地表原生植被逐渐消失, 植被群落结构功能趋于单一, 相应输送到土壤的腐殖质和根系分泌物多样性也会相应降低[35].Klappenbach等[36]研究发现, 绿弯菌门中很大一部分细菌可以通过光合作用获取能量并固定CO2, 意味着其丰度与固碳能力有关.本研究发现, 受尾矿污染的影响, CK中绿弯菌门相对丰度要显著高于污染区, 且Spearman分析结果也表明, 土壤有机碳含量与绿弯菌门呈正相关关系, 说明绿弯菌门在有机物分解和养分循环中发挥重要作用, 这也与Pierson等[37]研究的结果一致.相反, Avidano等[38]研究表明, 随着污染程度地加剧, 个别微生物丰度要比清洁区高, 可能是因为土壤微生物对污染环境的长期适应的结果.本研究中, 污染区中土壤放线菌门的相对丰度均高于清洁区, 且W1中放线菌门比CK相对丰度增加了63.41%, 说明外界污染胁迫可能加剧土壤细菌种间竞争并出现一些适应环境变化的优势菌种, 这一结果与先前的研究结果一致, 同时也为后期尾矿污染修复以及耐受性菌种提供一定帮助.
3.3 土壤细菌群落功能类群和潜在功能途径对尾矿不同风险区的响应参与土壤养分转化过程的微生物都是通过基因连接的[39~41].目前针对不同尾矿污染程度对土壤微生物群落功能的研究开展较少, 土壤污染加剧导致地表植物和土壤环境的变化不可避免地会引起土壤微生物群落的变化, 进而影响微生物群落主导的生物代谢功能的改变[42].有研究发现, 由于矿区开采影响了土壤养分输入, 迫切要求参与代谢功能相关的基因丰度改变, 从而影响区域微生物主导的代谢功能, 这也体现了土壤微生物对逆境胁迫和干扰环境的适应性[43~45].在本文中, W1显著提高了碳水化合物代谢、脂质代谢和其他氨基酸代谢等代谢相关途径基因丰度, 这表明受尾矿重度污染的土壤细菌参与了植物氨基酸和碳水化合物等代谢的合成, 同时土壤污染导致土壤养分流失难以维持地上植被和土壤细菌群落的生长, 从而提高土壤细菌代谢功能的基因丰度, 这一结论与张瑞海等[42]研究的结果一致.本文发现, CK中细胞生长与死亡、细胞活性、信息传导的相关基因丰度高于污染区, 这可能是清洁区受污染影响较小, 影响了土壤细菌群落活力从而提高了代谢功能基因丰度, 促使地表植物和壤下微生物生长所需养分增加, 加快了地表与壤下间的物质交换和信息传递, 驱动了区域的物质循环[46].结果表明重金属污染胁迫降低了土壤细菌群落多样性, 导致主导代谢功能的基因丰度发生改变.
通过FAPROTAX功能预测揭示了土壤细菌群落功能对不同污染区的响应特性.有研究表明, 尿素分解和木质素分解功能与土壤氮循环相关[47].在本文中, W1提高了塑性降解、尿素分解和木质素分解功能类群丰度, 且这些功能与放线菌门呈正相关, 这与Rivett等[48]研究的结果类似, 可能是放线菌门中的部分细菌群落参与了土壤氮循环, 执行了尿素分解和木质素分解功能种群的功能.随着污染程度减弱, 清洁区土壤功能类群丰度显著高于污染区, 包括硝化作用、好氧亚硝酸盐氧化、锰氧化、木聚糖分解、几丁质分解、固氮、纤维素水解和硝酸还原作用, 这可能是因为土壤养分的增加, 提高了土壤微生物群落丰度, 提高了功能性类群微生物利用光、水、热等自然资源, 增加了碳、氮的固持.同时, Zhou等[49]研究发现, 土壤中大多数细菌可以降解碳氮化合物, 提高了参与氮循环功能类群的丰度, 这也印证了本研究清洁区土壤细菌群落丰度增加的可靠性.综上所述, 受尾矿污染影响显著改变了土壤细菌群落和功能多样性, 土壤细菌群落多样性在参与地球生物生化功能方面发挥着重要作用.
4 结论(1) 随着重金属污染程度加剧, 不同污染区土壤理化性质存在显著差异(P < 0.05), 重度污染区与清洁区相比, 土壤TN、AN、TP、AP、AK和OM分别降低了1.22g ·kg-1、103.73 mg ·kg-1、0.57 g ·kg-1、141.68 mg ·kg-1、408.80 mg ·kg-1和14.52 g ·kg-1, 土壤养分流失严重.
(2) Illumina测序表明, 重金属污染显著减少了土壤细菌OUT数和特有OUT数, 污染区(W1~W3)降低了土壤细菌群落的ACE、Chao1和Shannon指数, 重度污染区与清洁相比极显著降低了ACE、Chao1和Shannon指数(P < 0.01).
(3) 土壤细菌群落优势菌门为放线菌门、变形菌门和绿弯菌门.重度污染区极显著提高了放线菌门和变形菌门的相对丰度(P < 0.01), 极显著降低了绿弯菌门的相对丰度(P < 0.01).Spearman分析表明, 放线菌门与pH呈显著正相关(P < 0.05), 变形菌门与pH、TK呈显著正相关(P < 0.05), 绿弯菌门与TN、AN、TP、AK和OM呈极显著正相关(P < 0.01).
(4) Tax4 Fun功能预测结果表明, 土壤重金属污染影响土壤细菌群落, 改变了其参与的主要生物代谢类型, 各区主导的生物代谢的基因丰度差异性显著(P < 0.05).FAPROTAX功能预测分析表明, 重度污染区显著提高了与塑性降解、尿素分解和木质素分解代谢相关的基因丰度, 随着污染减缓其相对丰度显著降低.
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