2022, Vol. 43
2. 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室, 北京 100085;
3. 北京市南水北调大宁管理处, 北京 100442
2. State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. Daning Management Office of Beijing South to North Water Diversion, Beijing 100442, China
浮游植物作为物质循环和能量流动的主要参与者, 是水生群落中重要的分类群, 在湖泊生态系统中发挥着至关重要的作用, 具有重要的生态功能[1~3].作为水体主要的初级生产力, 浮游植物的产量占全球初级净产量的近50%[4, 5], 其群落种类组成能在一定程度上反映水环境的变化规律, 因此, 浮游植物群落结构及其变化规律常被用于监测水体环境状况[6, 7].丹江口水库是南水北调中线工程的水源地, 为沿线20多座城市供水, 其水质安全保障具有重要意义.
有学者对库区浮游植物群落结构及其影响因子进行了研究, 采样主要集中在水深0.5 m处.王英华等[8]在库区共采集到浮游植物66种, 隶属于7门38种, 发现硅藻为春、秋和冬季的优势门类, 溶解氧、pH值和磷浓度是影响浮游植物群落组成的主要环境因子; 郑保海等[9]对丹江口水库着生藻类进行了6次连续监测, 共检出着生藻类6门46属, 发现硅藻为优势种, 着生藻类群落存在时空差异性; 贾海燕等[10]对丹江口库湾监测, 共鉴定出浮游植物7门57属, 发现浮游植物群落组成以硅藻和绿藻为主, 影响浮游植物群落组成的主要环境因子为温度、二氧化硅浓度、电导率和氮、磷浓度.贺玉晓等[11]共检测到库区浮游植物6门57属, 硅藻和绿藻为早春季节的优势门类, 浮游植物样品分别于1.5、5和10 m采集后混合, 缺乏库区浮游植物垂直分布特征的研究.
以上研究在方法上主要采用显微镜观察法, 这种传统方法存在受取样条件限制、需一定的保存技术、工作量大及鉴定时会有较大的差异和分歧等不足[12].与浮游植物显微检测方法相比, 高通量测序技术因能获得特定的DNA片段和高效地研究浮游生物群落组成, 在水生生态系统生物多样性研究中得到应用[13].贺玉晓等[11]通过高通量测序技术发现了前人通过显微镜观察法未发现的绿藻门麦可属(Mychonastes); 王靖淇等[14]通过高通量测序和显微镜观察法对比研究了辽河真核浮游植物多样性, 利用高通量测序技术弥补了显微镜观察中丢失的物种信息.
上述研究内容主要集中于浅层水体浮游植物群落组成, 库区深水水体浮游植物群落结构和分布尚未明确.库区浮游植物在垂直方向上如何变化、影响浮游植物群落组成的水环境因子等成为库区水质保护亟待解决的重要科学问题.本研究采用高通量测序测定浮游植物群落结构, 分析浮游植物群落在水平和垂向上的分布特征, 采用冗余分析判断浮游植物主要类群与环境因子的关系, 以期为丹江口水库水质保护工作积累基础数据, 并为水环境进一步提升提供科技支撑.
1 材料与方法 1.1 研究区概况丹江口水库分布于湖北省丹江口市和河南省南阳市淅川县之间(小部分涉及湖北省郧县和张湾区等), 由湖北境内的汉江库区和河南境内的丹江库区两大部分组成.淅川库区(32°39′0.595″~32°48′0.892″N, 111°30′0.833″~111°37′0.645″E)属于丹江库区下游(图 1), 面积为546 km2, 占水库总面积的52%, 属北亚热带季风气候, 四季分明, 光照充足, 日照率达44%.春秋季凉爽, 夏季炎热且降雨集中, 冬季寒冷少雨雪.库区多年平均气温15.8℃, 降雨量充沛, 年降雨量为800~1 000 mm, 多年平均降雨量为808 mm, 相对湿度为67%[15].
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图 1 丹江口水库采样点分布示意 Fig. 1 Location map of sampling sites in Danjiangkou Reservoir area |
采样时间为2021年6月20日, 根据淅川库区整体结构特点, 依据典型性和代表性等原则, 在参照前人研究方法的基础上[14, 16~19], 于库区设立了7个采样点(图 1), 分别为宋岗(SG)、土门(TM)、黑鸡嘴(HJZ)、库心(KX)、党子口(DZK)、五龙泉(WLQ)和渠首(QS).在每个采样点0.5、5、10和20 m(对应标记为1、2、3和4)处分别采样.每层取3组混合后经浮游植物网浓缩, 再过0.22 μm的滤膜, 并将滤膜转移到1.5 mL无菌离心管中放于液氮中保存.采样和分析参照文献[20, 21]的方法.
采用便携式多功能水质参数仪现场测定水温(WT)、pH、溶解氧(DO)和电导率(Cond.), 每层取0.5 L水样放入聚乙烯瓶中带回实验室, 按照文献[22]对水体中的总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)和硝氮(NO3--N)等理化指标进行测定.
1.3 浮游植物DNA提取、扩增和测序样品中总DNA先用Mo Bio/QIAGEN公司的DNeasy PowerWater Kit进行抽提, 提取的DNA采用荧光分光光度计(Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090; Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589)和1%琼脂糖凝胶电泳分析, 确定浓度和纯度.选取547F-CCAGCASCYGCG GTAATTCC和V4R-ACTTTCGTTCTTGATYRA作为真核浮游植物PCR扩增的引物[23].扩增体系为：Q5® High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶, 20 μL反应系统.扩增程序为：98℃预变性2 min, 30个循环(98℃变性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s), 最后72℃延伸10 min(PCR仪：ABI 2720型). PCR产物经AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒分离纯化后采用Illumina NovaSeq-PE250高通量测序, 通过与Silva 132 rRNA数据库比对获得浮游植物种类及相对丰度.测序所得原始数据上传至NCBI, 序列号为PRJNA(782248).
1.4 数据分析采用QIIME2(quantitative insights into microbial ecology)软件对获得的原始序列进行质控、去噪、拼接和去嵌合体后, 对高质量序列在相似性≥97%(默认为种水平的相似度)的划分标准进行最佳分类单元(operational taxonomic units, OTUs)的划分.将测序的OTUs结果与Silva 132 rRNA数据库进行比对, 采用QIIME2的Classify-sklearn算法[24] (https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier)对每个OTUs的代表序列, 在QIIME2软件中使用默认参数, 使用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释.
使用QIIME2和R语言软件分析真核浮游植物群落的α多样性(within-habitat diversity)和β多样性(between-habitat diversity). α多样性是指生境内多样性, 可表征浮游植物丰度、多样性和均匀度的变化.以Chao指数[25]和Observed-Species指数表征丰富度; 以Shannon-Wiener指数[26]和Simpson指数[27]表征多样性; Pielou-evenness指数表征均匀度[28]; 以Good's coverage指数表征覆盖度[29]. β多样性是指沿着环境梯度变化的不同群落之间, 物种组成的相异性.通过主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)和物种组成热图(heatmap)展示浮游植物垂直变化的主要趋势.
使用Canoco5.0软件进行冗余分析(RDA), 相关图件采用Excel和Origin 9.0绘制.
2 结果与分析 2.1 水环境因子库区7个采样点水环境因子监测结果如表 1所示.从中可知, DO和WT随水深增加而降低, NO3--N浓度随水深增加而升高.对照《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002), 丹江口水库水质优良.
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表 1 各采样点理化性质参数 Table 1 Physical and chemical properties in different sampling sites |
2.2 测序结果
对库区0.5~20 m共28个样品的18S rDNA V4可变区DNA扩增后, 采用Illumina进行高通量测序分析库区浮游植物群落的组成结构.共获得1 972 914条原始序列, 长度平均值为420 bp, 去除非目标序列和嵌合体后, 所有样品共获得1 646 862条高质量序列, 占原始序列的83.5%.当测序读数达到20 000时, 稀疏曲线逐渐趋于稳定, 表明测序数量充足, 分类群丰富度足够高(图 2).
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图 2 各采样点稀疏曲线 Fig. 2 Rarefaction indices of phytoplankton in different sampling sites |
28个样品共获得3 135个OTUs, 属于12门68属.水平方向上浮游植物群落α多样性分析结果如表 2所示, 从中可知, 每个样本的Good's coverage指数均超过了0.99, 可充分覆盖库区浮游植物类群.Observed-Species指数和Chao指数表征浮游植物丰度, 物种丰富程度在0.5 m处排序为：TM＞SG＞QS＞DZK＞HJZ＞KX＞WLQ; 在5 m处排序为：WLQ＞SG＞QS＞TM＞DZK＞KX＞HJZ; 在10 m处排序为：HJZ＞DZK＞KX＞WLQ＞QS＞TM＞SG; 在20 m处排序为：QS＞HJZ＞WLQ＞TM＞KX＞DZK＞SG.Simpson指数和Shannon-Wiener指数表征浮游植物多样性程度, 最大值分别出现在SG1、WLQ2、QS3和QS4, 表明0.5 m处SG和5 m处WLQ的浮游植物多样性最高, 10 m和20 m处QS浮游植物多样性最高.每层Pielou-evenness指数变化范围较大, 表明水平方向上各采样点浮游植物群落差异较大, 分布不均匀.
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表 2 浮游植物α多样性指数 Table 2 The α diversity indices of phytoplankton in different samples |
7个采样点同一采样水深浮游植物相对丰度排名前10的群落如图 3所示, 库区浮游植物群落0.5 m处甲藻占优, 其中TM浮游植物群落丰富度最高, 以甲藻门(Dinophyceae, 41.1%)为主; SG群落多样性最高, 分别为甲藻门(Dinophyceae, 22.9%)、绿藻门(Chlorophyta, 7.9%)、定鞭藻门(Haptophyceae, 5.4%)、金藻门(Chrysophyceae, 1.7%)和硅藻门(Bacillariophyta, 0.8%)等. 5 m处以甲藻为主, 其中WLQ浮游植物群落丰度和多样性最高, 包括甲藻门(Dinophyceae, 39.7%)、硅藻门(Bacillariophyta, 6.5%)和定鞭藻门(Haptophyceae, 3.7%)等. 10 m处除HJZ甲藻门(Dinophyceae, 4.2%)占优外, 其他采样点以硅藻门为主. 20 m处大多数样点以硅藻门为主, WLQ绿藻门(Chlorophyta, 13.6%)为优势门类, HJZ甲藻门(Dinophyceae, 4.2%)占优.库区物种组成表现为甲藻-硅藻-绿藻型结构.
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图 3 水平方向上浮游植物相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of phytoplankton in different samples at the phyla level of classification |
水平方向上浮游植物群落β多样性如图 4所示, 0.5 m处KX、WLQ和QS浮游植物组成比较一致, 均以甲藻门(Dinophyceae)、硅藻门(Bacillariophyta)和绿藻门(Chlorophyta)为主, SG含有9门浮游植物, 群落组成最为复杂, 所以自成一组, TM、HJZ和DZK因浮游植物群落丰度差异也各为一组; 5 m处HJZ、KX和DZK的浮游植物以甲藻门(Dinophyceae)、硅藻门(Bacillariophyta)和绿藻门(Chlorophyta)为主, 其余4点各为一组; 10 m处KX、DZK和HJZ相似度较高为一组, 主要包含甲藻门(Dinophyceae)、硅藻门(Bacillariophyta)、绿藻门(Chlorophyta)和定鞭藻门(Haptophyceae), TM和WLQ都由甲藻门(Dinophyceae)、硅藻门(Bacillariophyta)、定鞭藻门(Haptophyceae)、金藻门(Chrysophyceae)和绿藻门(Chlorophyta)组成, SG除金藻门(Chrysophyceae)外浮游植物群落结构和QS完全一致; 20 m处KX、WLQ、TM和QS相似度较高为一组, 主要包含硅藻门(Bacillariophyta)、绿藻门(Chlorophyta)和甲藻门(Dinophyceae), DZK与HJZ群落结构相同, SG为一组.
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横纵坐标括号中的百分数表示对应的坐标轴所能解释的样本差异数据的比例, 两点在坐标轴上的距离越近, 表明这两个样本的群落组成越相似 图 4 浮游植物群落多样性的PCoA分析 Fig. 4 PCoA analysis of phytoplankton community diversity |
各采样点垂直方向上浮游植物群落α多样性分析结果如图 5所示.SG、TM和DZK处浮游植物群落丰度(Observed-Species指数、Chao指数)和多样性(Simpson指数、Shannon-Wiener指数)随水深增加而下降.HJZ、WLQ和QS这3个采样点α多样性指数变化范围较大, 浮游植物群落垂向分布不均, 随水深变化无明显规律.KX处Pielou-evenness指数变化范围较小, 在垂直方向上浮游植物群落分布较均匀.
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图 5 各采样点垂直方向上浮游植物群落α多样性 Fig. 5 The α diversity indices of phytoplankton in different sampling sites |
为进一步比较各采样点0.5~20 m间物种组成的差异, 利用浮游植物群落组成热图(β多样性)对所有样本进行物种组成差异分析(图 6), 将高丰度和低丰度的物种分块聚集, 通过颜色梯度来反映浮游植物群落组成的相似性和差异性.从上到下, 物种对样本的重要性依次递减, 可认为这些重要性靠前的物种是组间差异的标志物种.横向可比较各采样点浮游植物群落不同水深之间的差异, SG硅藻门(Bacillariophyta)丰度随水深递增, 金藻门(Chrysophyceae)、真眼点藻门(Eustigmatophyceae)和定鞭藻门(Haptophyceae)等群落丰度随水深递减; TM甲藻门(Dinophyceae)丰度随水深递减.WLQ绿藻丰度在20 m处最高.造成各采样点浮游植物群落垂直分布差异的标志物种依次为硅藻门(Bacillariophyta)、甲藻门(Dinophyceae)、绿藻门(Chlorophyta)和金藻门(Chrysophyceae)等.
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色柱表示浮游植物在各样本中的丰度变化范围; 黑色线段长度表示物种对样本的重要性, 从上到下依次递减 图 6 浮游植物物种差异性分析 Fig. 6 Heatmap of phytoplankton |
选取水温(WT)、水深、溶解氧(DO)、电导率(Cond.)、pH、总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)和硝氮(NO3--N)这8个理化因子与硅藻门(Bacillariophyta)、甲藻门(Dinophyceae)、绿藻门(Chlorophyta)、金藻门(Chrysophyceae)、隐藻门(Katablepharidophyta)和定鞭藻门(Haptophyceae)这前6个差异标志物种进行RDA分析(图 7).分析前经过DCA(去趋势对应分析)第一轴梯度＜3, 选择RDA方法分析浮游植物与环境因子的相关性, 结果如图 7.第一和第二轴解释的方差百分比分别为23.30%和13.26%, NO3--N是影响库区浮游植物群落结构和组成最重要的环境因子, 其次是水深、DO、pH、WT、Cond.、NH4+-N和TN.硅藻与NO3--N、水深、Cond.和NH4+-N呈正相关, 与WT、pH、DO和TN呈负相关.甲藻与NO3--N和水深呈负相关, 与其他环境因子呈正相关.绿藻与Cond.、NH4+-N、TN和NO3--N呈正相关, 与DO、pH和WT呈负相关, 与水深无明显相关性.
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紫色箭头连线表示浮游植物物种, 红色箭头连线表示理化因子 图 7 浮游植物与环境因子RDA分析 Fig. 7 RDA ordination biplot of planktonic taxa and environmental factors |
近年来, 研究丹江口水库真核浮游生物群落主要采用显微镜观察法, 而高通量测序技术可以鉴定出显微镜观察法不能直接鉴别的新物种, 本研究通过对18S V4区进行测序发现金藻门金色藻属(Chrysochromulina)和甲藻纲新属(Asulcocephalium)等丹江口水库新记录种, 而前人发现的冠盘藻属(Stephanodiscus)和小环藻属(Cyclotella)未在测序结果中发现, 可能与18S V4区引物的特异性有关, 后期将结合其他条形码基因进一步深入研究[11].
丹江口水库淅川库区浮游植物群落组成为甲藻-硅藻-绿藻型结构, 水质、水温和水文因子共同影响了浮游植物群落结构[30].前期调查丹江口水库浮游植物群落, 发现水库处于贫营养型和中营养型水体之间[31, 32], 有研究指出甲藻门比硅藻门更适合生活在贫营养型水体中[33], 硅藻是中营养型水体的优势种[34], 库区优良的水质使甲藻和硅藻成为优势类群.水温是影响浮游植物群落结构组成的重要环境因子, 在大多数水库水体中均发现浮游植物群落结构受水温影响[35~37].硅藻最适生长温度为10~25℃, 比绿藻低[38], 库区水体温度有利于硅藻生产繁殖(表 1).硅藻与水位、流速和流量呈负相关, 绿藻与水文因子无显著相关性[30].本次调查库区水位、流量和流速较低.优良的水质、适宜水温和适合水文状况造就了库区甲藻-硅藻-绿藻型结构的浮游植物群落.
库区水平方向上浮游植物组成存在差异(图 3), 每层各采样点浮游植物群落结构聚类结果不同(图 4).有研究发现丹江口库区季节、环境因子和采样点等生态因子共解释了浮游植物结构变化的39%, 其中地理位置占12%[30].不同的地理条件使水生环境特征发生变化, 导致浮游植物主要类群的空间差异, 这种差异在水生态系统中较为常见, 例如, 厦门和青岛等地区各采样点真核微生物群落结构存在差异[39]; 美国黄石公园各采样点真核微生物群落相似度较低[40]. KX位于丹库中心, 人为干扰因素较少, 更接近自然状态; QS和WLQ地理位置靠近水库南边丘陵地带, 为库区上游; HJZ在下游支流处附近; TM靠近北部旱田地带; DZK在汉江排水口附近; SG离水田比较近, 人类活动比较频繁.采样点所处的位置的差异导致的环境因子不同和水文状况差别是造成库区浮游植物群落组成水平方向上差异的原因.
SG、TM和DZK浮游植物群落多样性和丰度随水深增加呈下降趋势(图 6), 其他采样点浮游植物群落与水深关系趋势不明显. 2008年8月有研究发现丹江口水库大部分站点浮游植物丰度呈现随水深增加而下降的趋势, 但在其他采样月份没有明显的规律[21]; 三峡水库在0~50 m范围内, 浮游植物丰富度和多样性也没有明显的分布规律[41].有研究发现环境变化仅解释了微生物群季节性变化的30%[42]; 湖泊中微生物群的组成与环境条件之间的关系仍不清楚[43].
在深水水体中, 随着光照、温度和营养盐等环境因素梯度的变化, 浮游植物群落的生物量峰值出现在不同水深[44, 45].不同水深浮游植物群落的差异归因于不同环境因素的协同作用[46].由于分层现象, 上层水具有养分浓度和温度的优势.相比之下, 较深的水层具有极端的环境条件, 例如较高的营养浓度、低温和低光照[47], 导致浮游植物丰度和物种多样性存在较大差异.库区各采样点浮游植物群落α多样性指数(图 5)和浮游植物群落组成热图(图 6)也说明浮游植物群落在垂向上的异质性.前期研究发现丹江口水库垂直方向上浮游植物群落丰度无明显差异[21], 本研究结果与前期研究结果有一定差异, 究其原因一是与水库扩容有关, 前期调查时间为2007~2008年, 水库于2012年扩容, 扩容后库区水文条件和理化参数发生改变, 导致库区浮游植物群落组成发生相应变化[48]; 其二与鉴定方法有关, 高通量测序技术得到的浮游植物特征的研究结果, 与前人使用的显微镜观察的结果相比, 提供的群落组成图更为全面[49].
丹江口水库淅川库区生态环境存在一定空间异质性, 浮游植物组成与环境因子之间有密切的关系[50~52], 由RDA分析可知, NO3--N、水深、DO、pH和WT是影响库区浮游植物群落分布的重要环境因子, 其中NO3--N是主要影响因子(图 7).有研究发现, 由于下沉使营养物质浓度随水深上升[53]和初级生产者对营养物质的吸收[54]等原因, 导致表层的NO3--N浓度较低, 深层的NO3--N浓度较高.在深水水体中, 营养物质浓度会随水深发生变化, 从而导致浮游植物群落结构相应改变[55].这一现象在本研究中得到了验证, 图 7表明NO3--N浓度与水深呈正相关.表 2显示20 m处浮游植物群落丰度和多样性(OTUs均值为399)高于0.5~10 m处(OTUs均值为270~381), NO3--N作为水生态系统中重要的氮源, 由于营养盐随水深增加, 浮游植物的最大生物量出现在深水区[56].NO3--N浓度的升高虽然可以增强浮游植物的生长、生理和代谢过程, 但不同水深的浮游植物群落组成结构取决于营养盐和WT等环境因子的共同作用[57].有研究表明WT是影响浮游植物群落分布的重要环境因子, 温度通过控制浮游植物呼吸作用和光反应过程中酶促反应的强度直接影响浮游植物的生长状态[58], 与浮游植物的相对丰度关系密切[59].WT是影响库区浮游植物群落分布的主要环境因子之一, 各采样点0.5 m处WT明显高于20 m处, 又因硅藻门与WT呈负相关以及甲藻门与WT呈正相关, 导致表层甲藻占优, 深层硅藻丰度高.证明WT的变化是0.5~20 m水深之间浮游植物相对丰度差异的重要因素.
4 结论(1) 库区真核浮游植物共12门68属, 物种为甲藻-硅藻-绿藻型结构.水平方向上浮游植物群落差异较大, 各采样点垂直方向上浮游植物丰度和多样性存在较大差异.宋岗、土门和党子口浮游植物群落多样性和丰度随水深增加呈下降趋势, 而其他采样点的浮游植物群落与水深关系趋势不明显.
(2) 硝氮(NO3--N)、水深、溶解氧(DO)、pH和水温(WT)是影响库区浮游植物垂直分布的重要环境因子.环境因子对浮游植物门类影响各异, 甲藻与NO3--N和水深呈负相关, 与其他环境因子呈正相关; 硅藻与NO3--N和水深呈正相关, 与其他环境因子呈负相关; 绿藻与WT、pH和DO呈负相关, 与水深无明显相关性.
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