2022, Vol. 43
氧苄啶对活性污泥的影响: ARGs及其潜在宿主[J]. 环境科学, 2022, 43(10): 4536-4544.
氧苄啶对活性污泥的影响: ARGs及其潜在宿主
唑（SMX）和甲氧苄啶（TMP）作为历史接触胁迫条件，探究SMX和TMP复合污染对ARGs、细菌群落及其交互作用的短期影响.基于高通量荧光定量PCR，共检测出13种ARGs，它们的绝对丰度介于2.21~5.42 copies ·μL-1（对数值，以DNA计，下同），其中sul2、ermB、mefA和tetM-01是样品中最主要的亚型，绝对丰度在2.95~5.40 copies ·μL-1之间；SMX和TMP复合污染会引起ARGs和可移动基因元件（MGEs）的富集，但其对各亚型的影响不同，且SMX的历史遗留效应高于TMP；不同接触史的复合污染下，ARGs间的共现与互斥模式均存在；MGEs（尤其是intI-1）与磺胺类（sul1、sul2）、四环素类[tet（32）]和大环内酯-林可酰胺-链霉菌素类抗性基因（ermB）均呈显著正相关性；基于微生物全尺度分类发现各类群微生物群落结构对复合污染的响应不同，且条件丰富菌属（CAT）得到了显著富集；陶厄氏菌属（Thauera）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）和副球菌属（Paracoccus）是优势的抗性菌属；网络分析共发现31个ARGs的潜在宿主，以条件稀有菌属（CRT）为主，尤其是Candidatus_Alysiosphaera和纺锤状菌属（Fusibacter）与多种ARGs呈现正相关，是多种ARGs的潜在公共细菌宿主；部分稀有菌属[RT，变异杆菌属（Variibacter）、气单胞菌属（Aeromonas）和管道杆菌属（Cloacibacterium）等]是转座子IS 613的潜在宿主，在ARGs的增殖传播中发挥重要作用.综上，研究揭示了污水处理系统中抗生素历史胁迫对ARGs赋存特征和及其宿主细胞的遗留效应，可为削减抗生素复合污染引起的ARGs污染提供新思路与理论依据.
抗生素被广泛用于人类疾病的治疗以及畜牧业和水产养殖业[1], 其排放到水体中对生态系统和人类健康均构成了极大的威胁.抗生素引起的抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)污染已成为亟需解决的公共卫生安全问题[2].抗生素在生物体内的代谢率较低, 大部分经人类及动物排泄, 进入污水处理厂(wastewater treatment plants, WWTPs), 导致WWTPs中耐药基因迅速增加.目前, 磺胺类, 大环内酯类和甲氧苄啶类在WWTPs进出水中的检出频率最高[2].多种抗生素在WWTPs中往往并存, 其复合污染已成为水环境领域的研究热点.其中, 磺胺甲
抗生素可以杀死或者抑制敏感细菌的生长, 使少数耐药菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)获得生存空间而大量繁殖, 是ARGs传播的直接压力源[3].目前, 已在WWTPs中发现众多不同类型ARGs的存在, 如四环素类(tetA和tetC), 磺胺类(sul1和sul2)以及甲氧苄啶类(drfA1和drfA13)等均被检出[4].此外, 不同ARG亚型及可移动基因元件(movable genetic elements, MGEs)与活性污泥细菌群落之间存在显著的非随机共现关系, 也会影响ARGs的传播[5~7].不同微生物群落的组装会受到特定环境或外界胁迫条件的选择, 当过去的环境条件或冲击事件产生的影响持续存在时, 历史条件会影响当下微生物群落的构建, 即历史遗留效应[8].但是, 不同抗生素接触史下抗生素复合污染对ARGs的传播增殖及活性污泥系统微生物群落演替尚不可知.需要指出的是, 目前研究人员对活性污泥微生物群落及ARGs宿主的研究聚焦于高相对丰度的优势菌属[9, 10], 而忽略了大量存在的低相对丰度菌属或稀有菌属.近期, 研究人员提出了微生物菌群的全尺度分类法[9], 将微生物菌群分为6类：丰富菌属(abundant taxa, AT)、中丰度菌属(moderate taxa, MT)、稀有菌属(rare taxa, RT)、条件丰富菌属(conditionally abundant taxa, CAT)、条件丰富或稀有菌属(conditionally rare or abundant taxa, CRAT)和条件稀有菌属(conditionally rare taxa, CRT).但是, 不同抗生素接触史下各类型细菌的响应及其对ARGs传播的贡献需要进行深入研究.
选择SMX和TMP为研究对象, 分别以SMX和TMP单独存在对活性污泥系统的胁迫作为不同抗生素接触史, 来探讨SMX和TMP复合污染胁迫对活性污泥系统ARGs赋存特征和细菌群落(六类菌)的影响, 解析ARGs的共现模式, 并确定ARGs的潜在宿主, 揭示不同类型细菌在ARGs传播中的重要性.本研究为探究抗生素复合污染提供了新的视角, 以期控制ARGs的传播提供一定的理论基础.
1 材料与方法 1.1 活性污泥批次试验设计本研究分两个阶段.第Ⅰ阶段是构建不同抗生素暴露的历史条件, 使用单一SMX或TMP进行胁迫, 运行8个周期.由于高浓度(high concentration, H)可放大抗生素历史暴露过程对活性污泥微生物的遗留效应, 先前的文献表明, 通过间歇法测定SMX对微生物的最大半抑制浓度为32 mg·L-1 [11]胁迫浓度控制在临界值附近, 以免对活性污泥造成不可逆影响, 因此抗生素浓度选择30 mg·L-1.第Ⅱ阶段为探究不同抗生素接触史下SMX和TMP的复合污染, 其中以SMX和TMP为历史胁迫条件的复合污染分别称为SAT和TAS模式.阶段Ⅱ中投加30 mg·L-1的SMX和TMP复合抗生素(SMX∶TMP=1∶1), 在相同操作条件下运行8个周期.磺胺甲
以500 mL的锥形瓶为反应器, 工作体积为250 mL, 包括125 mL活性污泥和125 mL人工配水, 污泥浓度控制在5 000 mg·L-1.活性污泥取自北京市某城市污水处理厂曝气池中.人工配水组成如下：葡萄糖0.560 g·L-1、氯化铵0.268 g·L-1、碳酸氢钠1.68 g·L-1、磷酸二氢钾0.100 g·L-1、氯化钠1.18 g·L-1、氯化钾0.160 g·L-1和微量元素1 mL·L-1.两种暴露模式下, 均设置3个平行, 反应装置分别命名为SAT_H(SAT_H1、SAT_H2、SAT_H3)和TAS_H(TAS_H1、TAS_H2、TAS_H3), 以氨氮完全去除或氨氮去除达到平衡作为循环结束的标志(每周期3~21 h).溶解氧控制在2 mg·L-1以上, 维持pH在7.5~8.5和温度在(25±0.5)℃.
1.2 基因组DNA提取和测序在第16周期末, 从反应器中收集活性污泥样品, 含种泥(seed, S)在内, 共得到7个样品：S、3个SAT_H和3个TAS_H胁迫样品.对不同模式下的3个平行样品进行混合, 经冻干处理后, 称取0.05~0.10 g干污泥, 利用E.Z.N.A.@Soil DNA试剂盒(Omega Bio-tek, USA)提取基因组DNA, 并用NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, USA)测定DNA浓度.使用lllumina MiSeq PE300测序仪(lllumina, USA)进行细菌16S rRNA基因(V3~V4区)测序(北京奥维森科技有限公司).
1.3 微生物序列分析与全尺度分类利用Trimmomatic和Pear对Fastq数据进行质控, 利用Flash、Pear根据overlap关系对两端序列进行拼接处理, 得到Fasta序列; 用uchime方法比对去除嵌合体.将有效序列按照相似度>97%划分到相同的操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs).通过RDP数据库对OTUs进行物种注释.采取全尺度分类方法对细菌进行分类[9], 该分类方法共分为6个类群.根据细菌菌属在所属模式下活性污泥样品中的相对丰度, 将其划分为6个类群, 包括：菌属在所有样品中的相对丰度均在1%以上定义为AT, 菌属在部分样品中相对丰度在1%以上, 但均不低于0.1%定义为CAT; 菌属在所有样品中的相对丰度在0.1%~1%之间定义为MT; 菌属在所有样品中相对丰度均低于1%, 在部分样品中低于0.1%定义为CRT; 菌属在所有样品中相对丰度均低于0.1%定义为RT; 菌属在样品的相对丰度从低于0.1%到高于1%都存在定义为CRAT.
1.4 高通量荧光定量PCR采用高通量荧光定量PCR(HT-qPCR)对SAT和TAS模式下的35个ARGs和16S rRNA进行定量检测, HT-qPCR在Wafergen SmartChip实时PCR系统(Wafergen, Fremont, CA)中完成.选择的ARGs涵盖9类抗生素：氨基糖苷类(aac、aph、strA、strB、adeA)、β-内酰胺类(ampC-01、blaCTX-M-01、blaSHV-01、blaTEM、fox5)、氯霉素[cmx(A)]、大环内酯-林可酰胺-链霉菌素(macrolide-lincosamide-streptogramin, MLSB, ereA、ermA、ermB、mefA、mphA-01)、多药类(floR、mexA)、磺胺类(sul1、sul2)、四环素[tet(32)、tetA-01、tetB-01、tetG-01、tetM-01、tetO-01]、万古霉素(vanA)、甲氧苄啶(dfrA12)和其他类(catA1、qnrA); 4种转座子：IS613、tnpA-01、tnpA-07和Tp614; Ⅰ类整合子：intI-1.用于HT-qPCR分析的引物与前人的研究结果保持一致[10]. qPCR溶解曲线分析由SmartChip qPCR软件(V 2.7.0.1)自动生成, 多峰/扩增效率超过范围(1.8~2.2)或R2低于0.99的被定义为不合格.循环临界值(cycle threshold, CT)31为检出阈, 仅重复扩增2次以上的ARGs为阳性.根据先前研究中的公式计算基因拷贝数[10, 12].
1.5 统计分析采用OriginPro(2022)对ARGs数据进行处理, 并按照AT、CAT、MT、CRT、RT和CRAT的定义, 对6种类群在2种模式下的相对丰度进行了可视化.使用Python(3.7.0)计算了活性污泥样品中ARGs之间的Spearman等级相关系数(SRCCs), 进一步使用R(V4.0.5)建立热图分析.计算了2种模式下微生物菌属(6类)与ARGs之间的SRCCs, 构建它们之间的相关矩阵.如果P≤0.05和r≥0.6或r≤-0.6, 则ARGs与微生物菌属之间的相关性被认为是统计学上显著的[2], 使用Gephi(V 0.92)来展示微生物菌属(6类)与ARGs之间的网络关系, 以探究其交互作用.
2 结果与讨论 2.1 SAT和TAS模式对ARGs丰度的影响如图 1所示, 样品中共检测出4类抗生素抗性基因(氨基糖苷类、MLSB类、磺胺类和四环素类).其中, 四环素(23.13 copies·μL-1, 为对数值, 以DNA计, 下同)和MLSB(22.90 copies·μL-1)的ARGs在3个样品中的绝对丰度最高[图 1(a)], 说明四环素和MLSB的抗性基因在环境中更容易发生, 这两类ARGs在其他环境中也广泛存在[13].同时, 与种泥相比, SAT和TAS模式均导致了这两类ARGs绝对丰度的增加, 尤其是在SAT_H样品中.此外, 在SAT模式下导致了磺胺类抗性基因(9.85 copies·μL-1)和氨基糖苷类ARGs(4.37 copies·μL-1)的出现与增殖.上述结果表明：两种模式均导致ARGs绝对丰度的增加, 但高浓度SMX历史遗留效应对ARGs的影响更为明显.进一步的, MGEs主要以转座子(17.47 copies·μL-1)为主, 且SAT和TAS模式下的绝对丰度略有增加, 而整合子在SAT模式中绝对丰度最高(4.05 copies·μL-1), 表明转座子的富集基本不受SAT和TAS模式的影响, 整合子是ARGs传播的主要因素.
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(a)不同类型ARGs和MGEs丰度; (b)ARGs和MGEs总丰度 图 1 不同活性污泥样品中ARGs和MGEs的绝对丰度变化 Fig. 1 Variations in abundance of ARGs and MGEs in different activated sludge samples |
图 1(b)展示了不同样品中ARGs和MGEs总绝对丰度的差异.S中检测出的ARGs总绝对丰度为12.94 copies·μL-1, 而SAT和TAS模式下得到明显的富集, ARGs总绝对丰度分别为30.36 copies·μL-1和18.71 copies·μL-1.ARGs的富集程度在SAT模式胁迫下显著高于TAS模式, 先前的研究也表明磺胺类抗生素胁迫对ARGs含量的增加高于甲氧苄啶[14, 15].同样, MGEs在SAT模式胁迫下绝对丰度最高为10.12 copies·μL-1, 高于TAS模式(5.94 copies·μL-1), 但均高于S(5.02 copies·μL-1).结果表明即使ARGs和MGEs受到相同的复合抗生素胁迫, 不同历史抗生素接触胁迫会影响其响应, 且进一步表明SMX的历史遗留效应高于TMP.
2.2 SAT和TAS模式对ARGs亚型赋存特征的影响不同样品中ARGs的赋存特征及比值变化如图 2所示. 35个ARGs中共检测到13个ARGs, 其含量在2.21~5.42 copies·μL-1之间, sul2、ermB、mefA和tetM-01是样品中最主要的亚型, 含量在3.1 copies·μL-1以上[图 2(a)].与S[ermB、mefA、tet(32)和tetM-01]相比, SAT_H中新出现了4种ARGs[sul1、sul2、strB和tetO-01, 图 2(a)], 其中sul1和sul2属于磺胺类.TAS_H中发现了2个新ARGs(dfrA12和tetO-01), 其中dfrA12属于甲氧苄啶类.上述结果表明了SMX/TMP的胁迫会促进同类型ARGs的富集, 并且也会伴随非对应ARGs的出现, 这可能是SMX/TMP胁迫使得附带耐药性发生变化, 先前的研究表明水平转移也可能伴随附带效应[16].
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(a) 13个ARGs亚型分布; (b)SAT_H/S; (c)TAS_H/S; (d)SAT_H/TAS_H; 1. intI-1; 2. Tp614; 3. tnpA-07; 4. IS613; 5. strB; 6. dfrA12; 7. sul1; 8. sul2; 9. ermB; 10. mefA; 11. tet(32); 12. tetM-01; 13. tetO-01 图 2 不同活性污泥中ARGs的赋存特征及比值变化 Fig. 2 Occurrence characteristics and ratios of ARGs in different activated sludge |
如图 2(b)~2(d)所示, SAT_H模式下大多数抗性基因含量均得到增加[sul2(5.4倍)], 而TAS_H模式下仅drfA12增加最多(3.6倍), 且SAT_H/TAS_H条件下, sul1、sul2和strB的比值均远高于1.结果说明了SMX和TMP不同的历史胁迫使ARGs对SMX和TMP复合胁迫的响应存在差异, 并且磺胺类和甲氧苄啶类受历史胁迫条件影响最为显著.研究表明磺胺类抗性基因绝对丰度与磺胺的添加浓度呈显著关系[17, 18]. sul1、sul2和ermB等耐药基因的高发生率和高富集可能是因为他们与MGEs中的I类整合子存在非随机共现关系, 这些整合子往往会嵌入到MGEs中, 如质粒和转座子, 使它们成为水平转移ARGs的主要参与者[15, 19].另外, mefA和tetM-01在SAT_H/S(0.04倍和0.06倍)和TAS_H/S(降低20%和18%)中均没有明显增加, 甚至发生下降, 表明了SMX/TMP的胁迫对mefA和tetM-01的丰度贡献较小.
此外, 不同抗生素胁迫对MGEs的赋存特征也有影响(图 2).S中仅存在tnpA-07和IS613, 而在SAT模式和TAS模式胁迫下, IS613的绝对丰度明显下降.在SAT模式下, intI-1和Tp614的丰度显著上升, 而TAS模式下却没有检测到intI-1的存在, 且Tp614与SAT的含量基本一致(SAT_H/TAS_H=0.98).两种模式下tnpA-07相较于S有小幅度增加(1.08~1.13倍).上述结果表明SMX/TMP的胁迫主要促进了Tp614和intI-1的富集, 而历史抗生素胁迫的不同仅对intI-1的存在有较明显的影响.综上, 不同历史抗生素胁迫会影响ARGs和MRGs对后续复合抗生素胁迫的响应.
2.3 SAT和TAS模式对ARGs和MGEs共现关系的影响SAT和TAS模式下不同ARG亚型之间的相关性分析如图 3所示.一方面, 同类型ARGs亚型之间存在显著的共线关系, 如sul1与sul2(r=1), tet(32)与tetM-01和tetO-01(r为0.74和0.75), 但磺胺类ARGs之间的相关性高于其他ARGs, 表明磺胺类抗生素的胁迫强化了同类型ARGs之间的非随机共现关系.另一方面, 不同类型的ARGs亚型也表现出明显的非随机共现关联.如氨基糖苷类ARGs(strB)与四环素类[tet(32)和tetM-01]、磺胺类(sul1和sul2)和MLSB类(mefA)均有明显的非随机共现关系(r均大于0.71), MLSB类耐药基因(mefA)与strB(r=0.82)、sul1(r=0.82)、sul2(r=0.82)和tetM-01(r=1)等.此外, 不同耐药机制的ARGs亚型之间也表现出了显著的非随机共现关系, 如通过抗生素外排产生耐药性的mefA以及tetM-01(核糖体保护)和strB(抗生素失活)等.以上结果表明, 同类型或不同类型的ARGs亚型之间存在非随机的共现关系, 这与前人的研究结果一致[6, 20].
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Spearman's, P < 0.01; 1. intl-1; 2. Tp614; 3. tnpA-07; 4. IS613; 5. strB; 6. dfrA12; 7. sull; 8. sul2; 9. ermB; 10. mefA; 11. tet(32); 12. tetM-O1; 13. tetO-01 图 3 不同样品中ARGs之间的相关性热图 Fig. 3 Heatmap of ARGs correlations in different activated sludge |
值得注意的是, intI-1与不同类型的ARGs[sul1(r=1)、tet(32)(r=1)和strB(r=1)等]均具有高度的非随机共现关系. sul1基因一般与整合子携带其他抗性基因共存, 而sul2基因通常位于小的非接合质粒或大的可传递多抗质粒上[21], 这正好说明了sul1和sul2与MGEs有很强的正相关, 表明了整合子可能与sul1、sul2和tet(32)等耐药基因进行了重新结合并携带.前人的研究也表明intI-1与磺胺类抗性基因具有正相关性, 且容易促进其迁移和转化[22].转座子Tp614和tnpA-07则与tetO-01(r=0.95, P < 0.01)和ermB(r=0.96, P < 0.01)存在显著非随机相关性.有研究也表明Tp614和tnpA-07与多种ARGs有很强的关联[23], 并且tnpA-07与tetM(32)(r=0.85, P < 0.01)、sul1 (r=0.82, P < 0.01)和sul2(r=0.82, P < 0.01)也存在显著正相关性.上述结果可能解释了tetO-01在SAT_H和TAS_H胁迫下产生的原因, 可能由于在tnpA-07和Tp614上携带tetO-01基因, 进而发生了对该基因的间接选择[23].结果进一步证实SAT和TAS模式下intI-1在ARGs传播中的重要性, 且不同转座子所携带的ARGs也存在较大差异.
2.4 SAT和TAS模式下微生物群落组成特征 2.4.1 SAT和TAS模式对属水平微生物组成的影响基于微生物全尺度分类方法, 共筛选得到5类细菌菌群(CART、CAT、CRT、MT和RT).如图 4(a)所示, 相比于S, 经SAT和TAS模式处理后, CART在整个细菌菌群中占主导地位, 占比高达63.23%和56.89%, 其次是CAT(20.80%, 17.15%), 表明了SMX/TMP的历史胁迫进程对CART和CAT起到了富集作用, 甚至更容易对抗生素产生抗性.相反, CRT、MT和RT却在SAT和TAS模式胁迫下发生下降, 甚至趋近于消失.而有趣的是, 3种类群被SAT模式抑制的程度高于TAS模式, 表明CRT、MT和RT对TAS模式更为敏感.上述结果也表明了不同抗生素种类历史胁迫, 会对当下细菌菌群的组成产生明显影响, 甚至起到主导作用.
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图 4 SAT和TAS模式下微生物类群相对丰度的变化 Fig. 4 Changes in relative abundance of microbial groups under SAT and TAS modes |
如图 4(b)所示, CAT所含菌属在SMX和TMP历史胁迫下, 对SMX和TMP复合污染的响应也存在一定差异.例如, 陶厄氏菌属(Thauera)在SAT_H模式下相对丰度增加到10.84%, 而在TAS_H中仅为3.87%, 说明Thauera在SMX历史胁迫下明显得到了富集, 但铁基芽孢杆菌属(Ferruginibacter)却被SMX/TMP明显抑制.假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)和副球菌属(Paracoccus)在SAT模式下的相对丰度为2.22%和1.15%, 且在TAS(2.02% 和2.4%)模式下也得到了富集, 这两个菌属均具有在好氧条件下, 将NH4+-N转化为N2的功能, 是被广泛报道的好氧反硝化菌属[2], 同时也表明这些菌属能够在一定浓度的抗生素复合污染下稳定生存[24].假丝酵母菌属(Candidatus_Microthrix)属于丝状菌, 可能导致丝状菌膨胀和恶化污泥沉降[25], 但其在SAT(0.155%)和TAS(0.175%)模式胁迫下的相对丰度低于S(1.003%), 这也表明经过复合污染的胁迫可能会促进了污泥沉降性能的改善.而在MT中[图 4(c)], 脱氯单胞菌属(Dechloromonas)和Bellilinea均在TAS模式下表现出相对丰度增加, 而其他菌属有所下降.同样在CRT和RT中[图 4(d)和4(e)], 大部分菌属的相对丰度变化也存在一定差异, 例如木洞菌属(Woodsholea)和Reyranella在S中的相对丰度为0.507%和0.672%, 但在SAT_H和TAS_H中含量下降到0.1%以下, 而RT中的浮游球衣菌属(Sphaerotilus), Piscinibacter, 沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)等在S中存在, 但经SMX/TMP胁迫后, 均都消失.值得注意的是, CART是受抗生素胁迫变化最大的菌群.利德贝特氏菌属(Leadbetterella)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)和假单胞菌属(Pseudomonas)在S中相对丰度仅在0.001%~0.018%之间[图 4(f)], 3种菌属在受SMX/TMP胁迫后, 相对丰度均得到明显提高, 其中Leadbetterella在TAS_H中丰度达到19.33%, 远高于SAT_H (11.12%), 而Brevundimonas和Pseudomonas则被以SMX为历史胁迫条件明显富集, 丰度达到16.62%和13.86%, 其中Brevundimonas和Pseudomonas是被广泛报道的反硝化菌属[26], 同样还有氢噬菌属(Hydrogenophaga)和金黄杆菌属(Chryseobacterium)被发现.结果表明了抗生素的历史遗留效应对RT和CRT的影响较小, 而主要集中在相对丰度较高的类群(CART和CAT).
2.4.2 SAT和TAS模式对潜在ARB的影响在本研究中, 抗生素胁迫后相对丰度增加的细菌被认为是潜在ARB[27].在属水平, 最值得注意的是, 潜在ARB主要存在于CAT [Thauera和黄杆菌属(Flavobacterium)]和CART (Leadbetterella、Brevundimonas、Pseudomonas、Chryseobacterium和Hydrogenophaga)中.在两种不同的抗生素历史胁迫进程下, 对ARB的富集程度也造成了差异.例如, 在SAT模式下, Thauera (10.84%)、Brevundimonas(16.62%)和Pseudomonas(13.86%)含量很高, 而TAS_H模式下, CART中的Leadbetterella (19.33%)最高. Thauera和Pseudomonas等被发现不止对一种抗生素存在耐药性[28], 因为它可以适应抗生素的压力和具有抗生素降解的能力[29].一些在S中相对丰度极低的菌属[例如寡养单胞菌(Stenotrophomonas), 0.006%]在与2种模式的抗生素接触后, 相对丰度分别增加到1.30%和0.46%, 也可能是ARB在抗生素耐药性起着重要作用, 需要引起重视.
2.5 SAT和TAS模式对ARGs潜在宿主的影响通过网络分析探究了不同类群细菌与ARGs间的交互作用(图 5).SAT/TAS模式下, 细菌菌落可能是耐药基因产生和转移的驱动因子.在本研究中, 共发现31个细菌菌属与检测到的13个ARGs呈现明显的正相关, 是其潜在宿主.但在5种细菌类群中的宿主数量和关联程度存在一定差异.在CRT中, 包含最多潜在宿主菌属(12种), Candidatus_Alysiosphaera与sul2、strB和IS613均表现出显著共现关系, 纺锤状菌属(Fusibacter)与ermB和tetO-01显著相关, 而其余宿主细胞只与一个ARGs亚型存在正显著关系.上述结果表明Candidatus_Alysiospaera和Fusibacter是SAT/TAS模式下的主要潜在宿主.而CAT中没有发现潜在宿主, 微生物与ARGs呈现负相关.在MT中仅有脱氯单胞菌属(Dechloromonas)与dfrA12表现出共现关系, 是其潜在宿主.但RT的10个细菌菌属[如湖水水杆状菌属(Aquabacterium)、Fluviicola和水库杆菌属(Piscinbacter)等]与不同ARGs(strB、mefA、ermB和sul2等)存在显著共现关系.上述结果表明：相较于丰富菌属(CAT和MT), 稀有菌属(CRT和RT)在ARGs的富集与传播中具有重要的作用.先前的研究结果已证实活性污泥中的稀有菌属(RT)在抗生素和重金属胁迫效应中处于重要的生态位[2]
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红色连接线代表正相关, 绿色连接线代表负相关, Spearman's, P < 0.01 图 5 ARGs与不同类型微生物的共现关系 Fig. 5 Co-occurrence relationships between ARGs and microorganisms |
需要注意的是, 转座子IS613与CART[硝化螺旋菌(Nitrospira)、Dokdonella)]、CRT[亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)]、RT[变异杆菌属(Variibacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、管道杆菌属(Cloacibacterium)]均存在一定的共现关系. 其中, Nitrospira和Nitrosomonas属于硝化细菌[29], 这也说明参与氮代谢的功能菌属也可能是ARGs的潜在宿主, 先前的研究也证明了这一点[30].而Tp614的关联度为16, 却仅与CRT(Persicitalea)存在一条正相关性.上述结果表明：相比于Tp614, IS613可能具有广泛共现性.总的来说, SMX和TMP的胁迫下, 宿主主要集中在RT和CRT.因此, 未来研究中需要对活性污泥系统中的稀有菌属给予更多的关注并开展系统深入的研究.
3 结论(1) 共检测出13种ARGs, 它们的绝对丰度介于2.21~5.42 copies·μL-1, 其中, sul2、ermB、mefA和tetM-01是样品中最主要的亚型, 绝对丰度在2.95~5.40 copies·μL-1之间; SMX和TMP复合污染的两种模式均会引起ARGs和MGEs绝对丰度的增加, 但其对各亚型的影响存在差异, 且SMX的历史遗留效应高于TMP.
(2) SAT和TAS模式下ARGs间的共现与互斥模式均存在; MGEs与氨基糖苷类、磺胺类、四环素类和MLSB类抗性基因均呈显著正相关性, 尤其是intI-1、sul1、sul2和drfA12受历史胁迫条件影响最为显著.
(3) CART在整个细菌菌群中占主导地位, SMX/TMP的历史胁迫进程对CART和CAT起到了富集作用; 抗生素的历史遗留效应对丰富类群(CART和CAT)影响要明显于稀有类群(RT和CRT); Thauera、Pseudoxanthomonas和Paracoccus是优势的抗性菌属.
(4) 共发现31个潜在宿主, CRT中最多, 其中Candidatus_Alysiosphaera和Fusibacter是多种ARGs的潜在细菌宿主; 部分稀有菌属(RT和CRT)是转座子IS613的潜在宿主, 在ARGs的传播中具有重要作用.
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