2021, Vol. 42
2. 青海省人工影响天气办公室, 西宁 810000;
3. 青海民族大学生态环境与资源学院, 西宁 810007;
4. 青海省草原总站, 西宁 810008
, LI Xi-lai1
, ZHANG Yu-xin2 , SUN Hua-fang1 , LI Cheng-yi1 , JIN Li-qun1 , YANG Xin-guang3 , LIU Kai4
2. Qinghai Province Weather Modification Office, Xining 810000, China;
3. College of Ecological Environment and Resources, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China;
4. Qinghai Provincial Grassland Station, Xining 810008, China
高寒沼泽湿地指海拔高、温度低的湿地, 是湿地类型中较为特殊的一种[1], 主要分布在青藏高原.其作为青藏高原上最重要和独特的自然生态系统, 在涵养水源、调节气候和碳储存等方面发挥着重要的作用.冻融丘是一种高出积水面几十厘米以藏嵩草(Kobresia tibetica)为主的草丘, 是高寒沼泽湿地的典型特征.冻融丘之间的凹槽称为丘间[2], 优势种为苔草(Carex moorcroftii).近年来, 随着气候变暖和人为因素干扰, 使高寒沼泽湿地的退化速度加快, 青藏高原高寒湿地的面积比原来减少了10%[3], 并逐渐向高寒草甸演替, 导致湿地生态系统的结构破坏、功能衰退、优势种减少、土壤养分下降以及湿地资源逐渐丧失.土壤退化特征表现为土壤干旱化和有机质减少, 植被特征表现为系统生产力下降、生物群落及结构改变等方面[4].此外, 冻融丘的特征对高寒沼泽湿地退化具有指示性[2], 随着退化程度的加剧, 冻融丘明显减小, 直到重度退化(heavy degradation, HD) 冻融丘完全消失.
土壤微生物参与生态系统的物质循环和能量流动, 对维持生态功能具有重要作用[5].湿地土壤微生物作为土壤养分状况的重要指标, 能够敏感地反映湿地土壤质量及湿地生态系统功能的演变[6].其群落功能多样性可以反映微生物分解代谢活动[7], 群落结构的变化在有机质分解、腐殖质合成和土壤养分转化等方面作用明显[6].有研究表明, 高寒湿地的退化过程中, 土壤微生物对其生存的微环境变化敏感, 并对碳源利用率增加[8], 其群落的变化可作为表征生境与生物演变的重要指标.目前, 高寒湿地的研究主要集中在湿地类型、湿地退化机制及有机碳氮变化的研究[2, 9], 而对于高寒沼泽湿地退化对土壤微生物群落结构的影响程度了解甚少.有学者指出, 土壤微生物群落的组成和多样性是由土壤的理化性质以及各种环境因素决定[10], 退化使植被类型和土壤理化性质发生变化, 而导致土壤微生物主要优势种群结构发生变化[11, 12].因此, 研究高寒沼泽湿地退化过程中冻融丘和丘间土壤微生物群落的变化规律, 揭示微生物群落与生境的关系, 对阐明高寒沼泽湿地退化机制有重大意义.本文选取不同退化高寒沼泽湿地的冻融丘和丘间土壤微生物为研究对象, 采用MiSeq高通量测序方法, 分析土壤微生物多样性及群落结构, 探讨退化对土壤微生物多样性的影响, 以期为高寒沼泽湿地退化机制研究和恢复提供参考依据.
1 材料与方法 1.1 土样采集2019年8月, 土壤样品采集于黄河源区青海省果洛州玛沁县大武滩境内.样地选择和植被调查方法详见文献[2].不同退化程度土壤样品分冻融丘和丘间采集0~10 cm土壤样品, 未退化(undegradation, UD)和轻度退化(light degradation, LD)土壤样品为未退化冻融丘(UD_A)、未退化丘间(UD_W)、轻度退化冻融丘(LD_A)、轻度退化丘间(LD_W), 因重度退化为高寒草甸, 无冻融丘, 故统一采样, 土壤样品为重度退化(HD), 重复3次, 共15个土样.采用多点混合法采取土样, 去除地表植物部分, 取上层10 cm土样用无菌的铲子采集, 每份土壤样品分为3份, 一份自然风干后用于测定土壤有机碳、总氮, 一份鲜样装到无菌的密封袋(在-80℃的条件下储存)用于土壤微生物的测定, 一份鲜样(在4℃的条件下储存)用于土壤微生物碳、氮测定.
1.2 测定方法 1.2.1 主要试剂和仪器PCR扩增仪、ABI Qpcr仪, ABI公司; MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit(100), QIAGEN公司; KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, KAPA公司; Agencourt® AMPure® XP(核酸纯化试剂盒), Beckman Coulter公司; Agilent 2100生物分析仪, Agilent公司; Labchip GX生物大分子分析仪, PerkinElmer公司; 高通量二代测序仪、MiSeq® Reagent Kit v3 (600 cycle)(PE300)和MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle), Illumina公司.
1.2.2 土壤理化性质测定土壤pH采用pH计法测定; 土壤容重采用环刀法测定; 土壤含水量用便携式土壤水分测定仪TDR350测定; 土壤有机碳和总氮含量采用vario MACRO cube元素分析仪测定; 土壤微生物碳和氮含量用TOC测定.
1.2.3 土壤微生物DNA提取及测序使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)提取土壤样品微生物基因组DNA, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因DNA的质量. PCR扩增指定测序区域(土壤细菌16S V4-V5, 真菌ITS 1区), 合成带有barcode的特异引物, 或合成带有错位碱基的融合引物. PCR采用TransGen AP221- 02, 全部样本按照实验条件进行, 每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物.此过程委托北京奥维森基因科技有限公司完成.
1.3 数据分析使用R语言, 制作细菌和真菌OTUs的韦恩图和网络互作图, 并将聚类结果与各样品在门和属水平上的物种相对丰度整合展示.使用Canoco 4.5软件对土壤理化性质和细菌、真菌在门和属水平多样性进行冗余分析(RDA).利用Origin2018绘制细菌和真菌在门和属水平的相对丰度.使用Microsoft Excel 2010对土壤理化性质、植被特征和多样性指数数据进行处理, 并用SPSS19.0统计软件进行方差分析(one-way analysis)和相关性分析.
2 结果与分析 2.1 高寒沼泽湿地退化过程土壤理化性质及植被特征从表 1中可以看出, 土壤有机碳(soil organic carbon, SOC)和总氮(total nitrogen, TN)含量在未退化的冻融丘、丘间的含量分别为(169.25±18.57)g ·kg-1、(163.04±19.08)g ·kg-1和(12.83±1.44)g ·kg-1、(12.36±0.79)g ·kg-1, 显著高于轻度退化和重度退化(P < 0.05).冻融丘和丘间土壤含水量(soil water content, SWC)、微生物碳(microbial biomass carbon, MBC)和微生物氮(microbial biomass nitrogen, MBN)随着退化程度加剧呈减少趋势, 且含水量UD_A和LD_A与HD差异显著, UD_W和LD_W与HD差异显著(P < 0.05), MBC与MBN冻融丘和丘间不同退化阶段差异显著(P < 0.05), 而土壤容重(bulk density, BD)随着退化程度加剧呈增加趋势, 且UD_A和UD_W与HD差异显著(P < 0.05), pH变化不明显.
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表 1 土壤的理化性质1) Table 1 Physical and chemical properties of the soils |
从表 2中可以看出高寒沼泽湿地随着退化程度的加剧莎草科的盖度、平均株高和地上生物量呈减少趋势, 其中莎草科的盖度和平均株高在未退化、轻度退化、重度退化之间差异显著(P < 0.05), 禾本科和杂类草的盖度呈增加趋势, 且未退化与重度退化之间差异显著(P < 0.05).
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表 2 不同退化程度高寒沼泽湿地植被特征 Table 2 Vegetation characteristics of wetlands in different degradation stages |
2.2 样品中所含OTU数目分析
由图 1看出, UD_A、LD_A、UD_W、LD_W和HD土壤样品中分别含有细菌种类3 299、3 026、3 303、3 311和3 365个, 冻融丘和丘间中共有的细菌OTUs数量分别为2 135和2 428, 共有细菌OTUs种类占22.42%和25.13%;未退化、轻度退化、重度退化各自特有的OTUs种类分别占33. 09%、33.13%、33.74%和31.19%、34.13%、34.68%; 真菌为1 209、1 210、1 537、1 332和1 277, 冻融丘和丘间中共有的真菌OTUs数量为411和457, 共有细菌OTUs种类占10.22%和11.97%;未退化、轻度退化、重度退化各自特有的OTUs种类分别占30.05%、40.25%、83.64%和31.69%、34.49%、88.11%.经分析, 未退化冻融丘和丘间土壤细菌和真菌OTUs比值约为2.73和2.14, 轻度退化为2.50和2.48, 重度退化土为2.63.说明退化改变了高寒沼泽湿地土壤细菌、真菌在OTUs水平上的物种组成, 丘间较冻融丘OTUs种类变化明显, 且土壤真菌OTUs种类变化更为显著.
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图 1 土壤样品微生物OTUs数量的16S(细菌)和ITS(真菌)韦恩图 Fig. 1 Venne diagram of OTUs number of bacteria and fungi |
综合样本α多样性指数(表 3), 可以看出：细菌微生物的Shannon指数均高于真菌微生物, 冻融丘和丘间细菌微生物Shannon未退化与轻度退化之间差异显著(P < 0.05), 对于真菌微生物的Shannon指数而言, 未退化丘间最高, 为6.83, 重度退化最小, 为5.20, 退化后冻融丘和丘间Shannon指数发生下降.不同退化程度高寒沼泽湿地微生物Simpson指数变化不大, 均在1左右, 但细菌和真菌微生物的Chao1指数差异较大, 细菌Chao1指数均大于真菌微生物(约3~4倍), 且细菌和真菌Chao1指数在冻融丘和丘间未退化高于轻度退化和重度退化, 且细菌UD_A与LD_A、HD, UD_W与HD差异显著(P < 0.05), 对于真菌差异不显著.细菌和真菌覆Coverage均大于95%, 说明此次测序结果比较真实地反映不同退化程度高寒沼泽湿地土壤样品中的细菌和真菌群.
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表 3 土壤样品的微生物多样性指数分析 Table 3 Analysis of microbial diversity indexes in the soil samples |
2.4 高寒沼泽湿地退化过程中土壤微生物群落结构
不同退化高寒沼泽湿地土壤微生物多样性十分丰富, 其中细菌共有50个门、128个纲、167个目、311个科和510个属, 真菌共有19个门、45个纲、113个目、238个科和452个属.根据注释结果, 将分别选取门的分类单元和大多数序列可以注释最低分类单元(属)的结果进行统计分析.
2.4.1 不同退化程度高寒沼泽湿地土壤细菌群落结构对于细菌的注释分析(16S), 供试不同退化程度高寒沼泽湿地土壤共检测到细菌微生物类群50个门, 不同样本的物种组成基本一致, 物种百分比变化趋势有所不同.将所有土壤样品的细菌群落在门水平上进行聚类分析(图 2), 未退化(UD_A、UD_W)、轻度退化(LD_A、LD_W)和重度退化(HD)中划分不是十分清晰, 交互在一起, 无明显差异.
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图 2 细菌门水平下的聚类分析 Fig. 2 Cluster analysis of bacteria at the phylum level |
如图 3所示, 平均相对丰度超过1%的门有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes).其中, 变形菌门为主导菌门, 与未退化相比, 轻度退化、重度退化在冻融丘和丘间变形菌门相对丰度降低了0.42%、6.23%和4.05%、7.17%, 且冻融丘UD_A和LD_A与HD之间差异显著(P < 0.05).放线菌门在冻融丘和丘间随着退化程度的加剧先减少后增加, 且在丘间UD_W和LD_W与HD差异显著(P < 0.05); 酸杆菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门在冻融丘和丘间随着退化程度的加剧增加, 其中芽单胞菌门在丘间UD_W与LD_W差异显著(P < 0.05).
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Pro表示变形菌门(Proteobacteria); Act表示放线菌门(Actinobacteria); Aci表示酸杆菌门(Acidobacteria); Chl表示绿弯菌门(Chloroflexi); Gem表示芽单胞菌门(Gemmatimonadetes); Nit表示硝化螺旋菌门(Nitrospirae); Fir表示厚壁菌门(Firmicutes); Bac表示拟杆菌门(Bacteroidetes); 不同大写字母表示不同退化程度间均值差异显著(P < 0.05) 图 3 细菌门水平下的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of bacteria at the phylum level |
将15个土壤样品的细菌群落在属水平上进行聚类分析, 如图 4所示, 未退化(UD_A、UD_W)、轻度退化(LD_A、LD_W)和重度退化(HD)中土壤的划分不在同一条分支上, 且交互在一起, 无明显差异.
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图 4 细菌属水平下的聚类分析 Fig. 4 Cluster analysis of bacteria at the genus level |
对16S测序在属的分类单元进行分析(图 5), 除去未识别(unidentified) 的细菌类群(相对丰度为37.43% ~67.07%), 平均相对丰度超过1%的菌属有Defluviicoccus、RB41、土微菌属(Pedomicrobium)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、Roseiflexus、红游动菌属(Rhodoplanes)、Hyphomicrobium和Candidatus_Solibacter.随着退化程度的加剧, Defluviicoccus在冻融丘减少, 丘间变化不明显; RB41、硝化螺旋菌属和Roseiflexus在冻融丘和丘间增加, 且Roseiflexus在丘间UD_W和LD_W与HD差异显著(P < 0.05); 土微菌属、假诺卡氏菌属和Hyphomicrobium在冻融丘和丘间减少, 且Hyphomicrobium在丘间UD_W与HD差异显著(P < 0.05); Candidatus_Solibacter在冻融丘和丘间的变化不明显.此外, 未识别的细菌类群, 其相对丰度高于黄媛等[13]对于杭州西溪湿地和韩晶等[14]对于新疆艾比湖湿地的研究, 说明高寒沼泽湿地相比其它类型湿地存在更多潜在的新菌种, 需要进一步鉴定.
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Def表示Defluviicoccus; Ped表示土微菌属(Pedomicrobium); Nit表示硝化螺旋菌属(Nitrospira); Pse表示假诺卡氏菌属(Pseudonocardia); Ros表示Roseiflexus; Rho表示Rhodoplanes; Hyp表示Hyphomicrobium; Can表示Candidatus_Solibacter; 不同大写字母表示不同退化程度间均值差异显著(P < 0.05) 图 5 细菌属水平下的相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of bacteria at the genus level |
将真菌群落在门水平下进行聚类分析, 如图 6结果所示, 在遗传距离为0.05处时, 重度退化土壤样品与轻度退化、未退化产生了分支, 未退化和轻度退化聚为一支, 重度退化聚为一支, 差异明显, 而未退化与轻度退化差异较小.
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图 6 真菌门水平下的聚类分析 Fig. 6 Cluster analysis of fungi at the phylum level |
对于真菌的注释分析(ITS)中, 在门水平上相对丰度均超过1%的门有4种(图 7), 其中含量最多的为子囊菌门(Ascomycota), 与未退化相比, 子囊菌门的轻度退化、重度退化在冻融丘和丘间子囊菌门相对丰度降低了0.42%、27.70%和25.35%、30.01%, 在冻融丘UD_A和LD_A与HD差异显著, 丘间各阶段之间差异显著(P < 0.05).接下来为担子菌门(Basidiomycota)、隐真菌门(Rozellomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota), 其中担子菌门和被孢霉门随着退化程度的加剧在冻融丘和丘间均增加, 被孢霉门UD_A和LD_A与HD差异显著, UD_W和LD_W与HD差异显著(P < 0.05); 隐真菌门在冻融丘减少, 在丘间先增加后减少, 且LD_W与HD差异显著(P < 0.05).
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Asc表示子囊菌门(Ascomycota); Roz表示隐真菌门(Rozellomycota); Bas表示担子菌门(Basidiomycota); Mor表示被孢霉门(Mortierellomycota, 不同大写字母表示不同退化程度间均值差异显著(P < 0.05) 图 7 真菌门水平下的相对丰度 Fig. 7 Relative abundance of fungi at the phylum level |
将所有样品的真菌群落在属水平下进行聚类分析(图 8), 在遗传距离为0.1处时, 重度退化土壤样品就与轻度退化、未退化产生了分支, 表明重度退化与未退化、轻度退化差异明显.同时, 3个重度退化中的土壤也各成一个支, 差异明显, 未退化与轻度退化差异较小.
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图 8 真菌属水平下的聚类分析 Fig. 8 Cluster analysis of fungi at the genus level |
对于ITS测序在属的分类单元进行分析中(图 9), 平均相对丰度超过1%的菌属有：假丝酵母菌属(Pseudeurotium)、Tetracladium、Articulospora、湿伞属(Hygrocybe)、Wardomyces、珊瑚菌(Clavaria)、壳多孢属(Stagonospora)、蒜孢属(Rachicladosporium)、被孢霉属(Mortierella)和Dactylonectria.随着高寒沼泽退化程度的加剧, Pseudeurotium、Tetracladium、Dactylonectria和壳多孢属在冻融丘和丘间减少, 且壳多孢属在丘间LD_W与HD差异显著(P < 0.05); 被孢霉属和珊瑚菌属在冻融丘和丘间增加, 且被孢霉属在冻融丘UD_A和LD_A与HD差异显著, 在丘间UD_W和LD_W与HD差异显著(P < 0.05), 与未退化相比, 轻度退化、重度退化冻融丘和丘间分别增加了1.48%、16.93%和1.92%、16.66%; 而Articulospora、湿伞属、Wardomyces和蒜孢属变化不明显.此外, 还存在大量(22.47% ~86.09%)真菌微生物未鉴定出的属, 所以高寒沼泽湿地演替过程中土壤真菌微生物结构和功能还需更深入的研究.
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Pse表示假丝酵母菌属(Pseudeurotium); Tet表示Tetracladium; Art表示Articulospora; Hyg表示湿伞属(Hygrocybe); War表示Wardomyces; Cla表示珊瑚菌(Clavaria); Sta表示壳多孢属(Stagonospora); Rac表示蒜孢属(Rachicladosporium); Mor表示被孢霉属(Mortierella); Dac表示Dactylonectria; 不同大写字母表示不同退化程度间均值差异显著(P < 0.05) 图 9 真菌属水平下的相对丰度 Fig. 9 Relative abundance of fungi at the genus level |
微生物网络图整体上表现了属间高度联系组成的复杂关系, 点的颜色代表所属门, 点的大小代表丰度的大小, 线的粗细代表相关性大小, 线为红色表示呈正相关, 蓝色表示呈负相关.细菌形成2个不同的模块, 其中边数是16, 顶点数是16, 网络直径是5, 平均路径长度是2.42[图 10(a)].网络分析中的节点来自优势菌门, Defluviicoccus、Variibacter、红游动菌属、Hyphomicrobium、土微菌属和Bradyrhizobium属于变形菌门, Solirubrobacter、Gaiella和Pseudonocardia属于放线菌门, Roseiflexus属于绿弯菌门, 硝化螺旋菌属属于硝化螺旋菌门, Terrimonas属于拟杆菌门, RB41、11-24、Bryobacter和Candidatus_Solibacter属于酸杆菌门.第一模块仅由Solirubrobacter、红游动菌属和Gaiella构成, 这些菌属在高寒沼泽湿地的碳代谢中具有重要作用.第二模块由Defluviicoccus、Variibacter、Hyphomicrobium、土微菌属、Bradyrhizobium、Solirubrobacter、Pseudonocardia、Roseiflexus、硝化螺旋菌属、Terrimonas、RB41、11-24、Bryobacter和Candidatus_Solibacter构成, 其中假诺卡氏菌属和11-24、Candidatus_Solibacter呈负相关外, 其余各属之间呈正相关, 真菌形成2个不同的模块, 边数是14, 顶点数是12, 网络直径是3, 平均路径长度是1.48[图 10(b)].网络分析中的节点来自优势菌门, Guehomyces和Pseudeurotium属于担子菌门, 其余的属于子囊菌门.第一模块由Tetracladium、湿伞属和Cadophora构成, 各属之间呈正相关.第二模块由蒜孢属、Papiliotrema、珊瑚菌、Pseudeurotium、Humicola、Dactylonectria、Peziza、Tetracladium和Cuehomyces构成, 9种属之间呈正相关.
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g_表示属, p_表示门 图 10 微生物属间共现性关系网络 Fig. 10 Network of co-occurrence among microbial genera |
为了探讨土壤环境因子对微生物群落组成的影响, 本研究将土壤理化性质分别于门和属分类水平下与细菌和真菌的群落组成关系进行典型对应分析, 分析结果如图 11所示, 细菌门水平下MBC、MBN和BD的射线较长, 表明其对门水平细菌群落结构影响较大.SOC、TN、MBC、MBN和SWC与主导菌门变形菌门、放线菌门和拟杆菌门呈显著正相关, 与绿弯菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门呈显著负相关.细菌属水平下MBN和pH的射线较长, 表明其对细菌属水平群落结构影响较大.SOC、TN、MBC、MBN和SWC与假诺卡氏菌属、Defluviicoccus、Hyphomicrobium和土微菌属呈显著正相关, 与硝化螺旋菌属、红游动菌属、RB11、Roseiflexus和Candidatus_Solibacter负显著相关.真菌门水平下, MBC、MBN和SOC的射线较长, 表明其对真菌门水平群落结构影响较大.SOC、TN、MBC、MBN、SWC与主导菌门子囊菌门、隐真菌门呈显著正相关, 与担子菌门和被孢霉门呈负相关.属水平下真菌MBN、SOC的射线较长, 表明其对真菌门水平群落结构影响较大, SOC、TN、MBC、MBN、SWC和BD与假丝酵母菌属、Tetracladium、Dactylonectria、Articulospora、Wardomyces、蒜孢属和壳多孢属正相关, 与被孢霉属、珊瑚菌和湿伞属负相关.可见, 不同退化程度的高寒沼泽湿地土壤细菌、真菌群落结构与其土壤理化性质存在一定的相互影响关系.
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SOC表示有机碳, TN表示全氮, MBC表示微生物碳, MBN表示微生物氮, BD表示容重; SWC表示土壤含水量; pH表示酸碱度; 蓝色箭头表示土壤微生物细菌和真菌门水平和属水平下种群分布, 红色箭头表示土壤环境因子 图 11 土壤微生物群落结构与土壤理化性质的RDA分析 Fig. 11 Result from RDA to explore the relationship between the bacterial diversity and soil properties |
选取前4种土壤优势微生物门和属, 分析植被特征与其相关性(表 4和表 5).高寒沼泽湿地莎草科盖度、杂草盖度和植被高度与细菌的变形菌门显著相关(0.707、0.735和0.870; P < 0.05), 杂草盖度与细菌的绿弯菌门和真菌的被孢霉门显著相关(0.860, P < 0.01; 0.750, P < 0.05).通过分析植物特征与细菌、真菌微生物优势属的相关性发现：除RB41与禾本科盖度显著相关(P < 0.05)外, 高寒沼泽湿地植被特征与细菌微生物属的相对丰度之间相关性不显著, 但植被高度与真菌微生物优势属假丝酵母菌属、被孢霉属和Dactylonectria显著相关(0.751, P < 0.05; 0.834, P < 0.01; 0.740, P < 0.05), 杂草盖度与Tetracladium显著相关(0.753, P < 0.05).
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表 4 不同退化程度植被特征与主要微生物门水平相对丰度相关性分析1) Table 4 Correlation analysis of vegetation characteristics and main microorganisms |
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表 5 不同退化程度植被特征与主要属水平微生物相对丰度相关性分析1) Table 5 Correlation analysis of vegetation characteristics and main microorganisms |
3 讨论 3.1 不同退化程度高寒沼泽湿地微生物多样性变化
本研究中, 在不同退化程度高寒沼泽湿地土壤细菌和真菌群落中, 重度退化土壤细菌和真菌群落的多样性低于轻度退化和未退化.也就是说, 高寒沼泽湿地退化影响了土壤细菌和真菌群落的组成, 降低了湿地微生物生态环境稳定性, 这与邵颖等[15]的研究结果基本一致.有研究发现变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门是不同退化高寒沼泽湿地的细菌主要群类, 子囊菌门、担子菌门、隐真菌门和被孢霉门是真菌主要群类, 这与其它类型湿地土壤中发现基本一致[15~19], 说明在湿地环境中微生物类群的分布具有一定的相似性.本研究中变形菌门是高寒沼泽湿地土壤细菌的优势菌群, 随着退化程度的加剧呈减少趋势, 说明变形菌门更加适宜在未退化及退化程度低的湿地环境中生存, 高寒沼泽湿地退化加重会影响变形菌门在高寒湿地的生存使其数量减少.随着退化程度的加剧, 冻融丘和丘间的拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和酸杆菌呈增加的趋势, 这是因为除酸杆菌门外, 其它作为有机物的主要降解者, 能够降解复杂有机物[20], 酸杆菌胞外多糖的产生和补偿溶质的累积使其能适应湿地退化干旱环境并具有存活的能力[21].子囊菌门随着退化程度的加剧呈减少趋势, 这是因为其为腐生菌, 能降解土壤有机质[22, 23], 随着退化程度的加剧, 有机碳在减少[2], 土壤通气性的改善从而导致子囊菌门的减少.冻融丘和丘间的担子菌门和被孢霉门呈增加的趋势, 这是因为担子菌门对难分解碳的利用能力较强, 对低养分环境的适应能力比较强[24]; 被孢霉门喜欢通气性较好的土壤条件, 能分解木质素和纤维素、半纤维素, 并利用土壤中的糖类物质进行生长代谢, 增加土壤有机质和养分含量[25].此外, 冻融丘和丘间的优势微生物多样性对退化的响应程度不同.本研究发现, 随着退化程度的加剧, 丘间的土壤优势微生物相对丰度下降的速度较冻融丘快, 一方面是因为丘间以苔草(Carex moorcroftii)为主[2], 随着退化程度的加剧, 丘间杂类草和禾草等植物种增多, 种内竞争加剧, 群落优势种更替, 植被盖度、高度和地上生物量下降得较冻融丘快, 从而导致凋落物的来源减少快, 致使微生物碳源减少.另一方面, 丘间的土壤含水量较冻融丘高(表 1), 随着退化程度的加剧, 丘间土壤含水量下降速率大于冻融丘, 致使土壤有机碳等养分下降, 从而影响土壤微生物的生长和繁殖.
网络分析中细菌和真菌大多数的节点来自优势菌门, 这与已有的研究发现的规律一致[18, 26~28].本研究中细菌的优势菌群变形菌门和绿弯菌门属于固碳微生物[29], 变形菌门中包含许多与碳循环有关的菌属[30], 与土壤有机碳含量显著相关.拟杆菌门中的Terrimonas是碳循环的主要参与者, 硝化螺旋菌门中的硝化螺旋菌属可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐, 酸杆菌门中Bryobacter和Candidatus_Solibacter是分解有机质, 促进碳循环的菌属[29].真菌中子囊菌门和担子菌门能够快速代谢植物根际沉积的有机底物, 加快土壤碳循环[31].被孢霉属能促进有效磷浓度的增加, 在有机碳累积中发挥重要作用[32, 33].由此可知, 高寒沼泽湿地的细菌和真菌中绝大部分菌属与碳氮循环功能有关.本研究表明, 随着退化程度的加剧, 细菌和真菌中绝大部分菌属相对丰度减少(图 3、5、7和9).湿地退化过程中土壤C/N比降低[34], 促使土壤微生物活动更加频繁, 加速有机碳分解[30].同时, 通过植物残体等生物途径进入土壤中的有机质也减少, 导致微生物碳源减少, 使细菌和真菌中绝大部分菌属相对丰度下降, 由此推断湿地退化导致微生物碳氮循环功能减弱.
此外, 不同退化程度的高寒沼泽湿地土壤细菌和真菌群落丰度具有差异性, 多样性并无太大差异.随着退化程度的加剧, 细菌和真菌微生物优势属丰度也在变化, 但真菌微生物差异较细菌大, 因此真菌微生物恢复至稳定结构所需要的时间可能会更长.
3.2 土壤理化性质对湿地微生物多样性的影响土壤理化性质是影响土壤微生物群落结构变化的关键因子.高寒沼泽湿地的退化由气候变化和冻土消融引起, 而过度放牧则加剧了其进程, 土壤水分的减少是高寒沼泽湿地退化最直接的响应[2], 这也是造成湿地土壤理化性质变化的主要因素.有研究发现[35~38], 土壤微生物多样性主要受pH、有机碳、全氮、含水量和容重等因素的影响.本研究RDA分析表明, SOC、TN、SWC、MBC和MBN与大部分优势菌门呈显著正相关, 而土壤pH呈显著负相关(P＜0.05), 这与李飞等[8]的研究结果基本一致.高寒沼泽湿地退化后容重增大(表 1), 土壤容重通过影响土壤孔隙度、通气状况直接对土壤微生物产生影响.与此同时含水量也会下降, 而土壤含水量通过影响土壤有机碳[2], 进而对土壤微生物活动尤其是碳循环产生影响[39, 40].Hu等[41]的研究表明, 土壤有机碳的变化与微生物变化密切相关, 可促进土壤有益微生物增长, 通常土壤有机碳含量越高, 土壤微生物丰度越高.未退化高寒沼泽湿地中有较高的有机碳含量, 能够给予微生物更多的养分, 促进微生物的生长发育和滋生, 新陈代谢的效率也有所增加[42].而随着高寒沼泽湿地退化的加剧, 土壤中的含水量降低[2], 养分不多, 仅能满足植物生长所需, 阻碍微生物养分的获取, 从而使微生物减少了参与有机质分解活动, 缺乏代谢活性, 影响其生长发育和繁殖, 进而影响微生物碳、氮含量.由此可知, 高寒沼泽湿地土壤优势菌群对土壤主要理化性质的响应存在差异, 土壤理化性质调控着土壤细菌、真菌群落多样性.这与赵国慧等[43]的研究认为土壤理化性质与土壤微生物群落构成具有一定的相关性的结果基本一致.本研究发现, 在门和属水平上, SOC、SWC和MBN是影响微生物优势菌门的关键因子, 可以通过施加有机肥、引水灌溉和人工增雨等措施来提高退化湿地土壤微生物丰度.
3.3 植被对高寒沼泽湿地土壤微生物多样性的影响有研究表明, 微生物分布的异质性很大程度取决于周围环境[44, 45].植物通过其凋落物和根系分泌物为土壤微生物提供营养, 在一定空间尺度上相似的环境条件下, 随着植被类型的不同, 土壤微生物群落结构表现出一定的差异[46], 植物类型初步决定了微生物群落的组成, 而植物群落组成的差异导致输入土壤中凋落物的不同, 影响养分循环速率, 改变土壤肥力, 进而影响微生物类群[47].本研究中未退化和轻度退化样地冻融丘以藏嵩草(Kobresia tibetica)为优势种, 丘间以苔草(Carex moorcroftii)和矮嵩草(Kobresia humilis)为主; 重度退化样地无冻融丘, 植被以矮嵩草为主, 毒杂类草和禾草等植物种增多.本研究表明, 莎草科盖度和植物高度等植被特征与细菌主要优势门如变形菌门呈显著正相关.变形菌门下的许多微生物在各类环境下都能生存[48, 49], 但优良的环境更有利于变形菌大量积累[50], 随着高寒沼泽湿地退化, 变形菌门微生物丰度的减少也验证了这一观点.土壤微生物的营养来源是凋落物, Harrop-Archibald等[51]和龙健等[52]的研究发现植被能够通过凋落物影响微生物的分布, 凋落物增加使微生物的生物量增加, 并使微生物的活性得到刺激.本研究中, 随着退化程度的加剧, 植被盖度、地上生物量和高度都在降低[2], 凋落物在减少, 对土壤微生物群落结构产生了影响, 在门水平上优势菌门丰度明显减少, 其对应的优势属丰度也在明显减少.植物根系分泌物是刺激微生物繁殖的重要能源和养分源, 其含有的有机酸、糖、氨基酸及次级代谢产物可为其提供碳源[53], 从而影响不同类型植物土壤微生物多样性.本研究未退化和轻度退化的湿地中存在数量巨大的根系分泌物, 提高了土壤中的有机质含量, 能够给予微生物更多的养分, 促进微生物的滋生和生长发育, 增加了新陈代谢的效率[54], 而重度退化以禾本科和杂草类为主, 其根系分泌物及土壤养分较少, 微生物代谢速率缓慢.通过进一步分析植被和主要微生物的关系发现, 植被特征与细菌和真菌相关(表 4和表 5), 尤其莎草科盖度和植物高度与变形菌门关系密切, 因此, 可以通过保护高寒沼泽湿地优势种莎草科植物(重点保护冻融丘)来防止变形菌门的丰度的减少.
本研究通过检测分析高寒沼泽湿地不同退化程度土壤中的微生物种类、数量及分布, 对高寒湿地相关微生物群落多样性有了一定的了解, 对高寒沼泽湿地退化影响土壤微生物群落结构有了进一步认识, 而高寒沼泽湿地退化过程中土壤微生物生态学功能的研究是下一步工作方向.
4 结论(1) 不同退化程度高寒沼泽湿地细菌和真菌主要优势门和属一致, 细菌为变形菌门和RB41, 真菌为子囊菌门和被孢霉属, 其相对丰度具有一定差异, 其中细菌相对丰度差异小, 真菌相对丰度差异大.
(2) 冻融丘优势微生物菌门属的相对丰度高于丘间, 丘间的优势微生物对退化较冻融丘敏感.高寒沼泽湿地退化, 不利于促进优势种微生物多样性.
(3) 莎草科盖度、土壤有机碳、土壤含水量、微生物碳和微生物氮是影响土壤微生物群落结构的主要因素, 在湿地恢复中应加强湿地冻融丘和莎草科植物的保护和土壤水分、有机碳和微生物碳氮的补充.
致谢: 王鹏程、马强、郭凡、张宇鹏、马盼盼、张瑞和马启贤等在采样和实验方面提供帮助, 在此一并致谢！
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