2021, Vol. 42
, YANG Jiu-yang , HAO Bai-hui , HAO Li-jun , LUO Jun-qing , LI Xue , DIAO Feng-wei , ZHANG Jing-xia , GUO Wei
随着人口增长、人类活动和全球气候变化等因素影响, 加剧了世界各地土地的退化和沙化, 土地荒漠化已成为目前我国乃至世界公认的最严重的生态环境问题之一[1].中国是世界上受土地退化危害最严重的国家之一, 我国荒漠化(沙化)土地分布较广, 主要集中于北方干旱、半干旱地区和部分半湿润地区[2].截至目前我国荒漠化土地面积已达2 620 000 km2, 沙化土地面积已达173 000 km2[3], 其中土地沙化作为土地荒漠化的重要过渡形式, 较荒漠化土地更易被恢复[4].因此, 实现沙化土地的有效恢复, 对于减缓土地荒漠化进程、改善退化土壤危害具有重要意义.
受沙化土壤理化性质差(如养分匮乏、保水保肥性能差等)和土壤生物群落复杂程度低等因素限制, 沙化土壤的自然恢复或植物群落修复进程缓慢[5].因此, 有必要通过施加外源调节剂或改良剂加速沙化土壤的生态恢复[5].生物炭由于其具有富碳、疏松多孔、比表面积大、持水性高和吸附能力强等优点, 常被作为理想的土壤改良剂应用于退化土壤改良过程[6, 7].有研究表明, 生物炭施用能够显著影响土壤理化性质(如改善土壤容重、土壤水分条件、土壤酸碱度和提高土壤养分等)和土壤生物学特性(如改变土壤微生物丰度、微生物群落结构和微生物功能等)[8~11], 但由于受生物炭材料本身性质、热解过程和土壤性质等不同的影响[12], 其对于沙化土壤理化性质改良效果具有明显的差异性[13~19].此外, 目前关于生物炭施用对沙化土壤微生物群落影响研究还较少.然而, 土壤微生物群落对于调控土壤物质循环和改善土壤质量具有关键性作用.因此, 除土壤基本理化性质变化外, 有必要进一步关注到土壤微生物群落结构变化, 从微生物作用角度完善生物炭施用对沙化土壤改良的作用机制.丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)真菌对于极端环境中植物定植、植物养分吸收利用、土壤抗侵蚀能力和土壤碳储存等方面存在着有益影响, 因此也常被与植物联合, 用于退化土壤改良[20, 21].已有研究显示, AM真菌对促进退化土壤(如沙化土壤、矿区土壤、盐碱土壤)植物生长、养分吸收[22~24]以及污染土壤、盐碱土壤的生态恢复发挥着积极作用[25, 26], 然而对沙化土壤性质(基本理化性质、土壤微生物群落)改良及生态恢复方面关注较少.此外, 有研究发现土壤中生物炭容易导致植物和菌根真菌之间响应关系的重大变化, 如通过影响土壤理化性质改变土壤养分有效性, 进而影响AM真菌定植[27]; 亦或是增强AM真菌协助宿主植物抵抗病原侵染的能力[28].外源生物炭施加也会对菌根真菌或外生菌根生长产生增效作用, 进而对土壤质量及植物生长产生促进作用[29~31].基于此, 构建植物-微生物-土壤改良剂之间的协同过程, 对于加速土壤恢复具有巨大潜能.因此, 深入研究植物-AM真菌-生物炭修复沙化土壤作用机制, 对日后建立沙化土壤的高效修复技术, 加速退化土壤生态恢复具有十分重要的科学意义和实际应用价值.
土壤微生物作为土壤基质与植物间物质、能量和信息传递的桥梁, 对土壤性质改变、土壤养分循环及植物生长等方面具有重要影响[32, 33].尽管, 目前关于AM真菌和生物炭单独改良退化土壤方面的作用已有相关研究, 但二者联合的改良作用研究较少[34], 且很少有研究关注不同微生物群落(特别是真菌群落)在沙化土壤改良中的潜在作用.基于此, 本研究采用温室盆栽试验, 通过设置AM真菌和生物炭单独或联合处理的方式, 探究不同改良方式对植物生长、沙化土壤性质及微生物群落结构影响; 从土壤微生物作用角度探究AM真菌、生物炭施用及二者交互作用对沙化土壤改良的影响作用机制; 并通过多元分析手段, 识别引起改良效果差异的主要驱动力, 厘清微生物(AM真菌、细菌和真菌)、土壤及植物互作关系, 以期为合理有效改良沙化土壤提供基础数据和理论依据.
1 材料与方法 1.1 培养基质供试土壤取自内蒙古呼和浩特西部土默特左旗小营子村(N40°30′48.60″, E111°45′59.69″)附近, 收集表层(0~20 cm)无污染风沙土, 去除表面杂质(石块、枯枝落叶等), 并自然风干、研磨过筛(2.0 mm), 土壤基本性质见表 1, 其中沙化土壤水稳性团聚2~0.25、0.25~0.05、0.05~0.01和0.01~0.005 mm粒径所占比例分别为11.37%、77.54%、9.41%和1.12%.在盆栽试验前对土壤进行高温灭菌处理(121℃, 2 h), 灭菌后自然风干保存备用.
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表 1 供试沙化土壤基本理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of the sandy soil |
1.2 供试植物、菌种与生物炭改良剂
小果白刺(Nitrariasi birica Pall.)是荒漠生态系统的优势物种之一, 是一种典型的沙漠灌丛植物, 具有独特的防风固沙、耐干旱、抗风蚀和盐碱等功能[35]; 此外, 由于其根系发达, 在植物固沙和土壤改良等应用方面一直备受关注[36].基于此, 本研究选用小果白刺为供试植物, 小果白刺种子购于中国宁夏远胜陆洋草业生态工程有限公司.在进行温室盆栽试验前, 用10%体积比过氧化氢(H2O2)浸泡15 min, 以对种子表面进行消毒.之后在25℃潮湿滤纸上催芽萌发48~72 h, 直到露出胚根后进行播种.本研究供试的AM真菌为根内球囊霉[Rhizophagus intraradices, RI, BGC BJ09, 1511C0001BGCAM0042, 370个孢子·(10 g)-1].该菌剂购买于北京农林科学院植物营养与资源研究所, 以玉米(Zea mays L.)和白三叶草(Trifoliumrepens L.)混合栽种形式对菌株进行扩繁培养3个月, 获得内含真菌孢子、菌丝以及宿主植物根段等繁殖体的根际砂土混合物[37].基于前人研究发现秸秆类生物炭对沙土改良的有益作用[38, 39].因此, 本研究选用秸秆类生物炭为土壤改良剂, 生物炭购于江苏省溧阳市德胜活性炭厂, 其生产基本技术指标见表 2.在盆栽试验前对生物炭进行高温灭菌处理(121℃, 2 h), 灭菌后自然风干保存备用.
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表 2 秸秆生物炭生产技术指标 Table 2 Technical indicators of the straw biochar |
1.3 温室盆栽试验设计
本试验采用生物学盆栽法, 处理分为：对照处理(CK)、单独接种RI处理(RI)、单独施加生物炭处理(BC)和接种RI与生物炭联合改良处理(BC_RI)4个处理, 每个处理设置6盆重复(共计24盆).以圆形花盆(上口径25 cm×下口径15 cm×高20 cm)为培养容器, 内衬无菌塑料自封袋.每盆放入4 kg灭菌沙化土壤, 依据已有研究生物炭添加最佳施用[40]及预试验结果, BC处理生物炭添加量选择20 g·kg-1, AM真菌接种处理采用混接法进行, 其中接菌处理(即RI和BC_RI)每盆每千克土壤加入50 g菌剂[41], 不接菌处理(即CK和BC)加入同等质量的灭菌菌剂和10 mL的菌剂过滤液(10 μm滤膜过滤), 所有添加物均保证与土壤基质充分混匀.将每盆播种15粒均匀预发芽的小果白刺种子, 15 d后间苗, 每盆保留6株长势相近的植株.所有处理随机摆放于内蒙古大学的温室中, 试验期间采用自然采光(日间温度为20~30℃, 夜间温度为10~20℃).通过称重法定期添加去离子水, 维持土壤基质含水量为田间最大持水量的80%[37], 自出苗之日起植物生长150 d后收获.
1.4 样品制备与基本理化指标分析测定盆栽试验结束后, 分别收获植物地上部分以及地下部分(根系)样品, 用蒸馏水彻底冲洗去除附着土壤, 70℃烘干至恒重, 称重记录地上部分以及地下部分植物样品干重.在收获时, 随机选取部分新鲜根段(0.7 g)保存于乙醇(50%), 用于测定菌根侵染率[42].植物样品烘干称重后粉碎过筛(< 150 μm), 室温保存用于后续植物相关指标测定.称取研磨过筛植物样品(2~3 mg), 利用元素分析仪(Vario MACRO, CHNOS Elemental Analyzer, Elementar Co., Germany)测定植物样品C和N含量.称取0.5 g研磨过筛植物样品, 加入5 mL优级纯HNO3于120℃开放式消化96 h, 利用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES, Optima 7000DV, PerkinElmer USA)测定消煮液中P、K、Ca和Mg含量.
收获植物样品后, 将整盆土壤混合.从每个处理6盆重复中随机挑选3盆, 收集3盆重复的新鲜混合土壤样品.其中一部分土壤样品使用无菌离心管(50 mL)收集, 并立即转移到-80℃冰箱中储存, 用于后续的分子生物学分析; 剩余土壤样品风干、研磨、过筛后置于室温下保存, 以供后续土壤理化性质分析.利用HCl(1 mol·L-1)对土壤进行预处理以去除土壤中的无机碳组分, 将预处理后的土壤样品105℃烘干至恒重, 称取土壤样品(120 mg), 利用元素分析仪测定土壤样品总有机碳及全N含量[43].称取风干过筛后的土壤样品(1 g), 加入等体积微量金属级(trace metal grade)氯化氢(HCl)和硝酸(HNO3)对样品进行消解[44], 使用ICP-OES分析样品中全P和全K含量.称取风干过筛土壤样品, 分别按照固液比(W/V)1/2.5和1/5比例加入去离子水, 振荡混匀静置, 利用pH计(Seven Compact S210)和电导率仪(Seven Compact S230)分别测定土壤样品pH值及电导率(EC)[45].参照中国农业行业标准(NY/T 1121.20-2008), 采用湿筛法对土壤水溶性团聚体组分比例进行分离测定.沙化土壤粒径组成采用比重法进行测定[46].
1.5 分子生物学分析采用FastDNA® SPIN试剂盒(MP Biomedicals, CA, USA)对新鲜土壤样品(0.5 g)中DNA进行提取, 通过微量紫外分光光度计(Nano Drop® ND-2000, Wilmington, DE, USA)测定DNA浓度和纯度.利用PCR热循环仪(ABI GeneAmp® 9700, CA, USA), 选用特异性功能基因引物(表 3)分别对细菌16S rRNA基因V3~V4区和真菌ITS rRNA基因ITS区域进行PCR扩增; 再用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行定量检测, 用凝胶回收试剂盒(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)对目标片段进行切胶回收.按照前述电泳定量结果, 通过荧光计(QuantusTM Fluorometer, Promega, USA)对PCR扩增回收产物进行荧光定量.按照上海美吉生物技术有限公司(Majorbio Bio-Pharm, 中国上海)标准, 将纯化后的扩增子以等分子量混合, 借助Illumina MiSeq平台, 分别对土壤细菌、真菌群落进行高通量测序分析.
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表 3 PCR引物序列信息 Table 3 PCR primer sequence |
1.6 数据处理分析
所有植物及土壤基本理化指标试验数据通过Excel计算平均值和标准误差, 并采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析：采用单因素方差分析(ANOVA)分析不同处理差异性, 并通过Duncan多重复极差检验差异显著性(P < 0.05).通过R语言(ggplot2包)对植物及土壤基本理化指标数据进行可视化.采用双因子方差分析AM真菌、生物炭施用和二者交互作用的显著性影响.
采用Mothur软件对原始16S rRNA或ITS rRNA基因测序序列进行去重复、质量过滤和优化.利用UPARSE算法(UPARSE 7.1 http://drive5.com/uparse/)将优化后的原始数据进行拼接, 将相似性大于97%的优化序列划分为一个操作分类单元(OTU), 并与16S rRNA数据库(Silva：Release132 http://www.arb-silva.de)和ITS rRNA数据库(Unite：Release 7.2 http://unite.ut.ee/index.php)进行比对.通过Ribosomal Database Project(RDP http://rdp.cme.msu.edu/)数据库对每个OTU代表序列进行识别和分类.为保证分析结果的有效性, 对所有样本的子样本序列按照最小样本序列数抽平进行后续数据分析[47].最终, 各处理每个样品得到475 044条(细菌)和63 754条(真菌)优化后的有效序列, 各样本分别包含1 637个有效的细菌OTUs和775个真菌OUTs.
利用Mothur(http://www.mothur.org/wiki)计算微生物多样性指数(Shannon)及群落丰富度指数(Sobs); 利用Qiime 1.7.0(http://qiime.org/index.html)进行主坐标分析(Principal coordinate analysis, PCoA), 以判定各处理微生物群落分布及结构组成差异; 利用Circos-0.67-7(http://circos.ca/)对样本与物种对应关系进行可视化, 并通过R语言(stats包)和Python(scipy包)计算, 对多组样本中物种进行克氏秩和检验(Kruskal-Wallis H test), 识别不同处理中具有显著性差异的物种; 通过计算RI、BC和BC_RI处理中物种间Spearman相关性系数, 利用Cytoscape 2.6.0软件分别构建不同改良方式下细菌、真菌物种网络关系图, 以探究识别不同改良方式下微生物群落作用模式; 采用Canoco5(version 5.0)软件, 利用冗余分析(redundancy analysis, RDA)探讨AM真菌、生物炭及联合施用对土壤结构、土壤性质及微生物群落结构差异的影响; 基于结构方程模型(structural equation modeling, SEM)构建AM真菌、生物炭、土壤性质、土壤结构以及微生物群落间作用关系, 利用SPSS套件Amos(version 24.0)进行SEM分析, 以探究AM真菌、生物炭施用对沙化土壤改良作用机制.
2 结果与分析 2.1 菌根侵染率、小果白刺生物量及矿质营养元素含量分析各处理菌根侵染率、小果白刺生物量及营养元素(N、P、K、Ca和Mg)含量如图 1所示.不接种处理(CK和BC)小果白刺根系中未观察到菌根真菌的侵染; 接种R. intraradices处理中, RI和BC_RI处理间菌根侵染率无显著性差异[图 1(a)].双因子分析结果表明, 接种处理对菌根侵染率有极显著影响(P < 0.001), 而生物炭施加及二者交互作用对菌根侵染率无显著影响.
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CK: 对照处理; RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理; 柱状图上不同小写字母表示同一类指标不同处理间在P < 0.05显著水平差异 图 1 各处理小果白刺根系菌根侵染率、生物量及矿质营养元素(N、P、K、Ca和Mg)含量 Fig. 1 Mycorrhizal colonization, biomass, and mineral nutrient element (N, P, K, Ca, and Mg) content in the different treatments |
与CK相比, RI、BC和BC_RI处理使得小果白刺地上部干重分别显著增加了113.60%、264.08%和285.44%(P < 0.05), 使得小果白刺地下部干重分别增加了126.32%、568.42%和884.21%; 与RI相比, BC_RI处理使得小果白刺地上部与根部干重均显著增加(P < 0.05); 与BC相比, BC_RI处理仅使得小果白刺根部干重显著增加[P < 0.05, 图 1(b)和1(c)].双因子分析结果表明, 接种处理对小果白刺地上部及根部干重有显著影响(P < 0.05), 生物炭施加对小果白刺地上部及根部干重均有极显著影响(P < 0.001), 而在二者交互作用无显著影响.
N、P、K、Ca和Mg是植物生长所必需的营养元素.与CK相比, RI处理使得小果白刺地上部的N、K、Ca和Mg元素含量显著增加(P < 0.05), 而对根部元素含量无显著影响, BC处理使得地上部的N、P、K、Ca和Mg含量以及根部的N、K、Ca和Mg含量均显著增加(P < 0.05), BC_RI处理使得地上部及根部的N、P、K、Ca和Mg含量显著增加(P < 0.05); 与RI相比, BC_RI处理使得地上部P和K含量以及根部N、P、K、Ca和Mg含量显著增加(P < 0.05); 与BC相比, BC_RI处理使得根部P、K、Ca和Mg含量显著增加[P < 0.05, 图 1(d)和1(e)].双因子分析结果表明, 接种处理对小果白刺地上部N和Ca含量有显著影响(P < 0.05), 对地上部Mg及根部P、K和Mg含量有非常显著影响(P < 0.01), 对根部Ca含量有极显著影响(P < 0.001); 生物炭施加对小果白刺地上部N和Ca含量有显著影响(P < 0.05), 对根部N含量有非常显著影响(P < 0.01), 对地上部P和K含量及根部P、K、Ca和Mg含量有极显著影响(P < 0.001); 二者交互作用, 对小果白刺地上部N含量及根部P和Mg含量存在显著影响(P < 0.05), 对根部Ca含量有非常显著影响(P < 0.01).
2.2 土壤有机碳、营养元素含量和水稳性团聚体差异分析不同处理土壤有机碳含量如图 2(a)所示.与CK相比, BC和BC_RI处理使得土壤有机碳含量分别显著增加了58.00%和63.00%(P < 0.05), 而RI处理对土壤有机碳含量无显著影响; 与RI相比, BC_RI处理使得土壤有机碳含量显著增加了45.08%(P < 0.05); 与BC相比, BC_RI处理相对土壤有机碳含量无显著影响[图 2(a)].双因子分析结果表明, 仅生物炭施加对土壤有机碳含量有极显著影响(P < 0.001), 而接种处理及二者交互作用对其无显著影响.
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(a)土壤有机碳含量; (b)土壤营养元素含量; (c)土壤水稳性团聚体组成; CK: 对照处理; RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理; (a)和(b)柱状图上不同小写字母表示同一类指标不同处理间在P < 0.05显著水平差异; (c)柱状图内不同小写字母表示2~0.25 mm粒径水稳性团聚体组成不同处理间在P < 0.05显著水平差异, 不同大写字母表示0.25~0.05 mm粒径水稳性团聚体组成不同处理间在P < 0.05显著水平差异; 图例内星号表示该粒径土壤水稳性团聚体组成差异显著性, *表示P < 0.05 图 2 各处理土壤有机碳、土壤营养元素含量及土壤水稳性团聚体组成 Fig. 2 Soil organic carbon, soil nutrient element content, and soil water-stable aggregate composition in the different treatments |
不同处理土壤营养元素全N、全P和全K含量如图 2(b)所示.与CK相比, RI处理使得土壤全N含量显著增加了152.54%(P < 0.05), BC处理使得土壤全P和全K含量分别显著降低了12.5%和18.18%(P < 0.05), BC_RI处理对土壤全N、全P和全K含量无显著影响; 与RI相比, BC_RI处理使得土壤全N含量显著降低了51.68%(P < 0.05); 与BC相比, BC_RI处理使得土壤全P含量显著增加了10.71%[P < 0.05, 图 2(b)].双因子分析结果表明, 接种处理对土壤N含量有非常显著影响(P < 0.01); 生物炭施用对土壤N、P和K含量有显著影响(P < 0.05); 二者交互作用对土壤N和P有非常显著影响(P < 0.01), 对土壤K有显著影响(P < 0.05).
各处理水稳性团聚体组成中, 0.25~0.05 mm粒径土壤团聚体比例最高, 约占总体水稳性团聚体的71%~79%.与CK相比, RI和BC处理对土壤水稳性团聚体组成变化无显著影响, BC_RI处理使得2~0.25 mm粒径及0.25~0.05 mm粒径土壤团聚体比例发生显著变化(P < 0.05), 而对其他粒径团聚体比例无显著影响; 与RI相比, BC_RI处理对土壤水稳性团聚体组成变化无显著影响; 与BC相比, BC_RI处理显著促进了土壤大粒径团聚体(>0.25 mm)的形成(P < 0.05), 显著降低了0.25~0.05 mm粒径土壤团聚体比例(P < 0.05), 对其他粒径土壤团聚体比例无显著影响[图 2(c)].双因子分析结果表明, 接种处理对2~0.25 mm粒径和0.25~0.05 mm粒径土壤团聚体比例变化存在显著(P < 0.05)和非常显著(P < 0.01)影响; 而生物炭施用和二者交互作用对土壤水稳性团聚体组成变化无显著影响.
2.3 微生物群落组成及多样性差异分析各处理门(phylum)水平下物种群落组成如图 3所示.细菌群落中, 变形菌门(Proteobacteria)、酸根菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度总和占细菌菌群的80%~86%, 其中变形菌门(Proteobacteria)丰度最高, 酸根菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度次之[图 3(a)]; 真菌菌群中, 除未分类真菌菌门(unclassified_k_Fungi)外, 子囊菌门(Ascomycota)在各处理中相对丰度最高, 壶菌门(Chytridiomycota)相对丰度次之[图 3(b)].对比发现, 尽管各处理菌门组成具有相似性, 但不同菌门丰度具有明显差异性, 细菌菌门中Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutes、Saccharibacteria、WWE3、Nitrospirae、Chlamydiae、Latescibacteria、Peregrinibacteria和WS2在不同处理间存在显著差异[P < 0.05, 图 3(a)], 真菌菌门Basidiomycota在不同处理间存在显著差异[P < 0.05, 图 3(b)].
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CK: 对照处理; RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理 图 3 各处理土壤细菌及真菌群落组成(门水平) Fig. 3 Bacterial and fungal community composition (phylum level) in the different treatments |
微生物α-多样性指数直观地反映出微生物群落多样性和丰富度差异, 不同改良方式对土壤细菌、真菌群落多样性(Shannon指数)和丰富度(Sobs指数)影响如图 4所示.与CK相比, RI和BC_RI处理使得土壤细菌Shannon指数和Sobs指数及真菌Sobs指数显著降低(P < 0.05), BC处理与CK相比无显著变化; 与RI相比, BC_RI使得土壤真菌Shannon指数显著增加(P < 0.05); 与BC相比, BC_RI处理使得土壤细菌和真菌α-多样性指数均显著降低(P < 0.05).
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(a)细菌群落α-多样性指数; (b)真菌群落α-多样性指数; CK: 对照处理; RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理; 星号表示差异显著性, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 4 各处理细菌及真菌α-多样性指数 Fig. 4 The α-diversity indices of the bacterial and fungal community in the different treatments |
为探究不同改良方式下土壤基质环境(物理结构和性质)及微生物群落结构组成差异, 本研究基于RDA分析, 揭示不同改良方式对各处理土壤基质环境及微生物群落结构差异的影响, 其中土壤物理结构和性质分别通过土壤水稳性团聚体组成和土壤营养元素含量进行表征, 微生物群落结构基于OTU水平进行分析, 分别包含细菌群落及真菌群落.图 5中不同颜色图例代表不同处理样本, 红色箭头代表AM真菌、生物炭及二者联合改良方式, RDA1轴和RDA2轴对结果的解释分别为34.13%~55.68%和6.41%~19.57%, 两轴解释度总和较高, 表明不同改良方式对土壤基质环境影响显著.对比发现, 各处理土壤结构、性质差异明显, AM真菌、生物炭(BC)及二者交互(Interaction)均与不同处理土壤结构和性质呈显著相关关系[P < 0.05, 图 5(a)和5(b)].此外, 细菌群落和真菌群落分布分散, 各处理细菌及真菌群落结构差异显著; 同样不同改良方式均与各处理细菌、真菌群落结构呈显著相关关系[P < 0.05, 图 5(c)和5(d)].
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CK: 对照处理; RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理; AMF: AM真菌; BC: 生物炭; Interaction: AM真菌与生物炭联合改良 图 5 不同改良方式对土壤基质环境(物理结构和性质)及土壤微生物群落结构影响(RDA) Fig. 5 Effects of different amendment treatments on the soil environment (physical structure and properties) and soil microbial community structure (RDA) |
分子生态网络关系图显示改良剂施用处理条件下各物种之间的相互关系, 网络图仅显示具有显著相关关系(|r|>0.6, P < 0.001)的物种联系.网络关系图中(图 6和图 7), 不同节点代表不同物种, 不同节点颜色代表该物种所属不同菌门, 红色连线表示正相关, 绿色连线表示负相关, 线的多少表示节点之间联系的密切程度.阿拉伯数字表示细菌及真菌群落网络关系中的模块数, 根据模块中物种连接度高低顺序, 将模块依次进行排序, 其中模块1为细菌和真菌群落中物种连接度最高的模块, 该模块被定义为网络关系的核心模块, 该模块中的物种为核心物种[48].
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RI: 单独接种RI处理; BC: 单独施加生物炭处理; BC_RI: 接种RI与生物炭联合改良处理; 节点表示不同物种(不同节点颜色代表该物种所属不同菌门), 其中红色名称物种为该网络关系中连接度最高物种(定义为核心物种)、未显示物种名称的节点为未分类(unclassified)菌种; 连线表示物种间存在极显著(|r|>0.6, P < 0.001)相关关系(红色连线代表正相关, 绿色连线表示负相关, 线的多少表示节点之间联系的密切程度的高低); 阿拉伯数字表示不同模块(按照连接度高低顺序依次排序), 下同 图 6 细菌群落单因素相关性网络分析 Fig. 6 Network analysis applied to the bacterial community |
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图 7 真菌群落单因素相关性网络分析 Fig. 7 Network analysis applied to the fungal community |
如图 6所示, 不同改良处理条件下, RI处理细菌群落网络关系包含2类模块, BC和BC-RI处理均包含3类模块.对比发现, 不同改良处理中, 物种间相关性程度不同, RI、BC和BC_RI处理细菌群落中正相关关系分别为183、216和262个, 负相关关系分别为198、212和235个, 其中BC和BC_RI处理相关性联系高于RI处理.此外, 不同处理同一模块物种组成不同, 其中核心物种组成具有差异性, RI处理中细菌核心模块主要包含Acidobacteria_bacterium_CB_286306等19种核心物种, BC处理主要包含Domibacillus_robiginosus等23种细菌核心物种, BC_RI处理主要包含Archangium_gephyra等28种细菌核心物种.
如图 7所示, 不同改良处理条件下, 真菌群落网络关系模块数、物种间相关性程度及核心物种组成也存在差异性.RI处理真菌群落网络关系包含5类模块, 其中分别包含134和92个正相关和负相关关系, 核心模块主要包含Rhizophagus_intraradices等14种真菌核心物种; BC处理真菌网络关系包含3类模块, 分别存在156和136个正相关和负相关关系, 主要包含Acremonium_tubakii、Gibberella_baccata等32种真菌核心物种; BC_RI处理真菌群落网络关系包含4类模块, 其中正相关和负相关关系分别为126和94个, 核心模块中主要包含Gibellulopsis_nigrescens等13种真菌核心物种, 其中Rhizophagus_intraradices并未出现在BC_RI真菌网络关系中.
2.6 AM真菌、生物炭对沙化土壤改良作用机制分析本研究结果显示, AM真菌和生物炭施用能够影响土壤基质环境(土壤性质、结构和微生物群落结构组成), 不同改良方式对沙化土壤中植物生长具有正向促进作用, 但促进效果具有差异性.考虑到SEM是一种先验方法, 可以用直观的图形表示生态环境中复杂关系网络[49].为探明影响改良效果差异的主要驱动力, 厘清土壤微生物群落及土壤基本性质在改良过程中的重要角色, 本研究通过SEM构建AM真菌、生物炭、土壤性质、土壤结构以及微生物群落关系, 结果如图 8所示.AM真菌分别与细菌群落、真菌群落呈极显著相关关系(r=0.98, P < 0.001; r=0.69, P < 0.001); 生物炭分别与细菌群落、真菌群落和土壤性质呈极显著相关关系(r=-0.17, P < 0.001; r=-0.56, P < 0.001; r=0.93, P < 0.001), 与植物生物量呈显著相关关系(r=0.60, P < 0.05); 此外, 细菌群落、真菌群落分别与植物生物量(r=0.73, P < 0.01; r=-0.44, P < 0.05)、土壤性质(r=-0.88, P < 0.001; r=0.56, P < 0.01)存在显著相关关系.
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红色实线箭头表示呈极显著相关关系, 黑色实线箭头表示呈显著相关关系, 虚线表示相关关系不显著; 线条粗细表示相关系数的强弱, 线条越粗, 相关性越强; 箭头数字表示r值; 星号表示差异显著性, *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 8 SEM揭示沙化土壤改良作用机制 Fig. 8 SEM revealed the mechanism of sandy soil improvement |
植物生物量能够直接表征植物生长状况, 并间接反映土壤质量与肥力状况的好坏.因此, 植物生长状况对于直观地反映不同改良方式对沙化土壤改良的实际效果具有指导意义.本研究结果发现, AM真菌、生物炭施用以及联合改良对小果白刺生长均有促进作用, 但不同改良方式对植物生长促进效果具有差异性.生物炭施用(BC)及联合改良处理(BC_RI)比AM真菌单独接种(RI)对小果白刺生长促进效果显著, 其中联合改良方式对小果白刺根部生长较单独改良方式促进效果显著.植物生长受土壤基质环境的直接影响, 土壤基质环境变化可能是引起改良效果的差异的主要影响因子.许多研究已证实生物炭施用对提高土壤养分(特别是土壤有机碳)具有重要影响[50~52], 本研究结果同样发现生物炭施用对土壤基质环境有机碳含量具有显著提升效果.由于受沙化土壤养分匮乏等条件限制, 生物炭施用能够为土壤补充直接的养分含量, 这对于植物生长促进效果可能比AM真菌作用更直接.此外, AM真菌、生物炭施用能够影响土壤微生物群落结构[53~55]; 生物炭施用同样也会改变植物菌根真菌的信号传导过程[56], 进而影响菌根真菌协助植物生长的作用效果.生物炭施用后, 直接影响到植物根系与AM真菌定植关系, 因此在短期改良过程中, 联合改良对植物根部生长影响作用更明显.
目前大部分研究已发现AM真菌、生物炭施用对微生物群落组成结构的重要影响[57~59], 但却忽略了不同微生物群落(细菌和真菌群落)在调控土壤基质和改良土壤性质方面的关键作用.本研究通过高通量测序分析, 探究不同改良方式对细菌、真菌群落影响.微生物多样性研究结果显示, AM真菌接种及联合改良能够显著降低微生物群落多样性及丰富度, 这可能主要归因于AM真菌菌根对营养物质竞争的优势作用[60].由于菌根快速生长, 降低了其他微生物营养供给需求, 使得微生物生长受限, 从而降低了土壤微生物多样性.尽管有研究证实生物炭的多孔结构能够为微生物提供一定的生存空间[61], 但由于受到沙化土壤本身条件限制及AM真菌菌根等因素影响, 生物炭对微生物作用优势并不能在短期内得以发挥.因此, 联合改良处理中微生物多样性也显著降低.除微生物多样性差异外, 不同改良方式下土壤物理结构、营养环境及土壤微生物群落结构差异显著, 结合RDA结果发现, AM真菌、生物炭及二者联合改良对土壤基质环境变化具有显著影响, 其中二者联合作用条件下微生物群落结构均与其他改良方式存在明显差异, 表明二者联合可能更易导致微生物群落间互作关系的显著变化.有研究已发现, 生物炭对土壤中菌根群落变化具有显著影响[56], 在菌根群落与生物炭的共同影响下, 使得土壤微生物群落关系发生显著变化, 进而导致微生物群落结构的显著差异.网络分析结果进一步证实了, 不同改良方式对微生物群落互作关系的显著影响.结果表明, 不同改良方式下微生物分子生态网络关系能够发生显著变化, 不同处理网络关系中核心物种组成也发生明显改变; 生物炭施加处理(BC和BC_RI)较单独接种AM真菌改良处理(RI), 网络连接密集程度更高且核心物种组成更丰富; 生物炭与AM真菌联合, 弱化了Rhizophagus intraradices的核心作用, 并增强其他微生物(特别是细菌菌种)的核心地位.这些结果表明, 不同改良方式对微生物菌群互作关系具有重要影响, 生物炭施加可能能够平衡微生物群落对生态位和营养等的合理利用, 这对于有效调控微生物群落间协同分工意义重大.AM真菌单独作用时, 由于AM真菌菌根的优势作用, 使得其他微生物生长受限; 当施加生物炭后, 一方面由于生物炭本身多孔结构, 能够为其他微生物在其孔隙形成活性生物膜提供合适的生态位[61]; 另一方面, 生物炭能够通过吸附植物根系分泌物等方式改变根系周围环境, 进而影响AM真菌菌根生长[62].生物炭施加能够适当减弱AM真菌对土壤营养、环境等的争夺优势, 从而为其他更多的有益微生物生长提供基础.微生物群落协同联系对土壤生态恢复具有重要影响[63], 尽管AM真菌、生物炭和二者联合对沙化土壤改良均有正向促进作用, 但生物炭施加更有利于增强微生物群落互作关系, 因此, 生物炭对促进沙化土壤改良效果影响更显著.此外, AM真菌与生物炭联合, 更有利于平衡微生物群落间营养供给需求, 这可能对实现沙化土壤生态恢复具有潜在优势.
改良剂施用对土壤微环境变化有着直接影响, 为探明微生物群落、土壤基质环境在沙化土壤改良过程中的影响作用, 本研究通过SEM直观地揭示不同改良方式对沙化土壤改良的作用机制.结果表明, AM真菌和生物炭施用通过直接影响土壤细菌和真菌群落结构, 进而实现对植物生长及土壤性质变化的影响; 生物炭施用除能够直接影响土壤微生物群落外, 也会直接作用于土壤以及植物本身; 因此, 生物炭施用较AM真菌对沙化土壤改良优势更显著.综上结果发现, 微生物群落在土壤改良过程中起着关键性作用, 微生物群落结构差异(特别是微生物间的互作关系变化)是导致土壤改良效果差异的主要驱动力.由于生物炭施用能够瞬时弥补土壤养分匮乏的限制, 因此就短期改良效果来看, 生物炭较AM真菌对沙化土壤改良优势更显著.尽管AM真菌与生物炭联合施用对沙化土壤短期改良效果并不一定完全优于单独施加生物炭改良作用效果, 但本研究结果已显示出联合改良对植物根部生长的显著促进作用, 说明AM真菌-生物炭-植物联合修复对加速沙化土壤改良的潜在优势.然而想要构建完善高效的植物-微生物-改良剂联合改良体系, 除了需要考虑土壤基质、改良剂本身性质影响外, 还需要关注微生物群落, 特别是有益微生物(如菌根有益细菌、真菌等)在其中发挥的关键作用.日后可以考虑寻找更多的有益微生物, 用以加强联合改良的协同过程, 并针对不同土壤基质, 通过野外实地试验探讨其在退化土壤生态恢复中的实际作用效果, 为后续理解并提高土壤改良修复效率提供有力依据.
4 结论(1) AM真菌、生物炭及联合改良方式均对沙化土壤中小果白刺地上部生物量及矿质营养元素吸收具有显著促进作用; 生物炭和联合改良处理促进了小果白刺根部矿质营养元素吸收和生长, 联合改良处理效果要优于生物炭处理.
(2) 不同改良方式使得沙化土壤营养环境、物理结构具有显著差异性, AM真菌、生物炭及联合改良方式对土壤基质环境变化存在显著影响.
(3) 不同改良方式使得沙化土壤细菌、真菌群落α-多样性、组成及结构存在显著差异性, AM真菌、生物炭及二者联合对土壤微生物群落结构影响显著.
(4) 不同改良方式下微生物分子生态网络关系发生显著变化, 不同处理网络关系中核心物种组成具有差异性; 生物炭和联合改良处理较单独接种AM真菌改良处理, 网络连接密集程度更高且核心物种组成更丰富; 生物炭与AM真菌联合, 弱化了Rhizophagus intraradices的核心作用, 并增强其他微生物(特别是细菌菌种)的核心地位.
(5) AM真菌、生物炭施用通过直接影响土壤细菌、真菌群落结构, 进而实现对植物生长及土壤性质变化的影响; 微生物群落在土壤改良过程中具有关键性作用, 微生物群落结构差异(特别是微生物间的互作关系变化)是导致土壤改良效果差异的主要驱动力.
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