2021, Vol. 42
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 农业农村部农业生态与资源保护总站, 北京 100125;
4. 中国环境科学研究院, 北京 100012
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. Rural Energy and Environment Agency, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100125, China;
4. Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China
铬(Cr) 是我国主要的土壤重金属污染物之一.工业污染是土壤中重金属铬的主要源, 其中铬化工、电镀和制革是我国涉铬的主要行业.据调查统计, 全国历史遗留的铬渣约410.38万t, 这些铬渣经长期堆放后会形成铬污染场地[1].铬具有一定的生物毒性, 对生物危害极大, 可引起细胞的突变和癌变, 对人体具有致癌作用[2].植物体内的Cr主要来自根系吸收, 从而对植物产生毒害, 使其生长受到抑制直至枯死[3].环境中的Cr浓度达到一定程度时, 也会对微生物的生长代谢产生抑制作用, 有研究表明当土壤中Cr含量达到80 mg·kg-1时, 可使蓝绿藻的数量显著减少, 生物活性降低50%[4].
微生物作为土壤生态系统的重要组成部分, 能直接参与土壤物质的循环过程, 对外界环境十分敏感.当生存环境发生改变时, 微生物群落能快速地反映出土壤环境质量的变化情况, 是衡量土壤污染与恢复程度的重要指标[5].目前关于重金属污染土壤中微生物群落的研究逐渐增多.如Patel等[6]的研究发现, 当土壤中重金属Cu和Zn的浓度分别达到环境容量标准的2.5倍时, 会使土壤微生物的生物量减少40%.处于长期重金属污染环境中的微生物群落结构及多样性会发生改变, 耐受性较弱的物种会逐渐减少甚至消失, 而耐受性强的物种会存活下来组成新的群落, 丰度也逐渐增加[7].目前, 铬污染对微生物群落的影响仍不清楚, 尤其是对于微生物群落构建的机制不清楚.群落的构建过程直接影响着微生物群落的组成与多样性, 并且还能影响其在环境中的生态功能[8].因此, 揭示微生物群落结构及其构建过程已经成为近年来微生物生态领域的研究热点.
本文以某皮革厂铬污染土壤为研究对象, 采用16S rRNA高通量测序技术分析不同污染浓度土壤样品中微生物群落的结构、组成、多样性以及群落构建过程, 探讨不同铬污染程度对微生物群落特征影响的规律, 揭示微生物群落在铬污染土壤环境下的构建过程以及影响微生物群落结构的主要环境驱动因子, 以期为深入了解不同浓度铬胁迫下土壤微生物群落特征以及铬污染土壤的生物修复提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 土壤样品采集与理化性质检测本实验所用的土壤样品来自于河北省某牛皮制革厂区污泥堆场周边的铬污染土壤, 在以污泥堆为中心, 距离为10、50和100 m的范围内分别设置5个1 m×1 m的重复样方, 每个样方取2个土壤样品, 共计30个, 分为3组, 将距离污泥堆场10 m的采样点所采集的10个样本设为C组; 距离50 m所采样的10个样本设为B组; 距离100 m所采集的10个样本设为A组.样本釆集后除去草根及石块, 并置入无菌采样袋中带回实验室-80℃保存.
土壤含水率(MC) 采用重量分析法测定; 土壤pH值使用赛多利斯科学仪器(北京) 有限公司生产的土壤pH计来测定; 土壤有机质含量(OM) 采用重铬酸盐消解法测定[9]; 土壤总铬含量采用火焰原子吸收分光光度法测定[10]; 土壤六价铬含量采用二苯碳酰二肼分光光度法测定[11].
1.2 DNA提取与高通量测序 1.2.1 细菌DNA的提取称取0.5 g土壤样本, 采用FastDNAⓇ SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, LLC, 美国) 试剂盒提取样本中的细菌DNA, 利用琼脂糖凝胶电泳检测是否降解, 经Nanondrop2000测定其浓度后[12], 放置于-20℃冰箱保存用于后续的16S rRNA基因测序.
1.2.2 PCR扩增及高通量测序采用16S rRNA通用引物515F (5′-GTGCCAGC MGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3′) 对样品DNA进行扩增.PCR反应体系(50 μL)：Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.5 μL, 10×PCR缓冲液5 μL, dNTP MIX溶液4 μL, 正、反向引物(10 μmol·L-1) 各1 μL, 模板DNA (20~30 ng·μL-1) 1 μL, 再用超纯水补至50 μL.PCR反应条件：94℃ 1 min; 94℃ 20 s, 57℃ 25 s, 68℃ 45 s, 30个循环; 68℃ 10 min, 4℃保存[13, 14].PCR反应结束后取全部反应体系进行琼脂糖凝胶电泳.用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (OMEGA) 对PCR产物进行胶回收[15].纯化后的PCR产物采用高通量测序仪Illumina MiSeq 2000 (美国Illumina公司) 进行测序, 测序后的数据上传到实验室分析平台进行处理.
1.2.3 测序数据分析所有测序的原始数据处理以及后续的数据分析均在本实验室的Galaxy分析平台上(http://mem.rcees.ac.cn:8080) 完成[16], 下载运行结果后对其进行筛选.将保留下来的序列通过UPARSE方法[17]按照97%的序列相似度进行OTU的划分, 生成OTU表, 对原始的OTU进行重抽, 最终使得每个样品的序列数目相同, 之后基于重抽OTU表进行后续多种生物统计分析[18, 19].本文采用香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)和群落丰度指数(Chao1) 来研究细菌群落的α多样性; 通过韦恩图、优势物种相对丰度分析和主坐标分析(PCoA) 来揭示细菌群落组成与结构的变化规律; 通过典型关联分析(CCA) 来探讨影响细菌群落的主要驱动因子; 通过R软件(V 3.6)[20]计算最近物种指数βNTI的值来反映样品间的系统发育多样性(|βNTI| < 2表示随机过程占主导地位, |βNTI|>2表示确定性过程占主导地位); 基于Bray-Curtis距离观测值和零模型的随机性之间差异的RCbray指数来计算细菌群落的构建过程(|RCbray|>0.95表示观测值与零模型预期间存在显著差异)[21], 结合所得数据分析细菌群落构建机制.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质分析铬污染土壤的理化性质如表 1所示.本研究表明, 随着采样点和污泥堆之间距离的增加, C、B和A这3组样品中总铬和六价铬含量显著下降(P < 0.05), 而各组样品中pH值则随着距离的增加显著增大.此外, 随着土壤样品中总铬含量的增加, 有机质的含量逐渐增加, C组与A、B组样品之间的差异显著(P < 0.05).土壤含水率则随总铬含量的升高先下降而后升高.
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表 1 土壤理化性质1) Table 1 Physical and chemical properties of soil |
从土壤理化性质结果可以看出, 实验采集的3组土壤样本A、B、C的总铬与六价铬的含量差异显著, 并且六价铬浓度远低于总铬的含量.这可能是因为土壤中的Cr主要以Cr(Ⅲ)的价态存在, 且相对稳定, 大部分Cr(Ⅲ)的化合物被土壤吸附固定, 土壤中的Cr(Ⅵ)具有流动性, 仅有8.5%~36.2%能被土壤所吸附[22], 所以土壤样本中的Cr(Ⅵ)含量较低.
2.2 细菌群落组成与结构分析通过对3组共30个样品进行高通量测序, 共获得5811098条高质量序列, 样本平均条带数为193703.如图 1所示, 各样品的稀释曲线斜率均已经接近饱和, 表明样品的测序深度基本满足要求.对各组样品的独特OTUs以及组间样品的重叠OTUs进行Venn图可视化分析发现(图 2), A、B和C这3组样本的OTUs总数分别为12726、12184和11568个, 特有的OTU的数目分别是3377、1852和2396个, 各组样品中共同检测到OTUs为6547个.
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图 1 土壤样品细菌群落稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curve of bacterial community in soil samples |
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图 2 不同铬含量组分中细菌群落的OTUs数量Venn图 Fig. 2 Venn diagram of OTUs number of bacterial communities in different chromium concentration components |
各组样品中细菌群落共包含55个门、121个纲、212个目、440个科和1375个属(图 3与图 4).其中优势菌门(相对丰度>5%) 为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、奇古菌门(Thaumarchaeota)和厚壁菌门(Firmicutes), 优势菌属为亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和小梨形菌属(Pirellula).
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图 3 土壤样品中细菌群落在门水平上的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of bacterial community at the phylum level in soil samples |
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图 4 土壤样品中细菌群落在属水平上的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of bacterial community at the genus level in soil samples |
在门水平上, 不同污染程度铬污染土壤中的细菌组成基本相似, 其中放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes) 丰度随着铬浓度的升高而显著增加, 绿弯菌门(Chloroflexi) 丰度随铬含量的升高而显著下降, 变形菌门(Proteobacteria) 细菌丰度随铬含量的上升呈先升高后下降的趋势, 奇古菌门(Thaumarchaeota) 丰度变化趋势则是先下降后升高; 属水平上, 亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)和节杆菌属(Arthrobacter) 丰度随铬含量升高先下降而后显著增加, 鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、小梨形菌属(Pirellula)和类诺卡氏属(Nocardioides) 丰度随铬含量的升高而显著增大, 芽单胞菌属(Gemmatimonas) 丰度随铬含量的升高而显著减小.
为了进一步了解不同程度铬污染下细菌群落结构的差异, 对各组样品在OTU水平上进行主坐标分析.如图 5所示, 第一主成分(PCoA1)和第二主成分(PCoA2) 的差异解释率分别为26.10%和22.12%.不同含量的铬污染土壤样品明显分开, 尤其是A组(低污染含量) 与B (中污染含量)、C (高污染含量) 两组样品相距较远, 表明随着铬含量的增加细菌群落的结构发生了较大的变化.对所有样品进行相似性分析(ANOSIM), 发现铬污染对土壤细菌群落结构影响显著(R=0.4585, P < 0.05).
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图 5 不同铬含量土壤样品中细菌群落PCoA图 Fig. 5 PCoA diagram of bacterial community in soil samples with different chromium concentrations |
为进一步验证细菌群落之间的差异是否显著, 对不同铬污染程度土壤细菌群落间进行基于Bray-Curtis距离(表 2) 的不相似性检验[23, 24].3种不相似性分析结果均表明低浓度A组与中含量B组以及高含量C组土壤细菌群落之间的差异性显著(P < 0.05), 而B组与C组之间的差异仅通过MRPP方法检验显著[25].该结果与前面细菌群落的PCoA分析结果相吻合, 说明与低含量(A组)样品中的细菌群落相比, 中含量(B组)以及高含量(C组)样品中的细菌群落结构发生了显著变化, 而中含量与高含量样品中的细菌群落结构差异相对较小.
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表 2 细菌群落Bray-Curtis距离的不相似性检验 Table 2 Dissimilarity test of soil bacterial community based on Bray-Curtis distance |
比较不同污染程度土壤样品中细菌群落的α多样性发现(表 3), Shannon、Simpson、Observed_richness、Pielou_evenness和Chao1指数的变化趋势一致, 即中含量(B组)样品的α多样性指数最大, 高污染(C组)样品的多样性指数低于低污染(A组)与中污染(B组)样品, 但差异并不显著.
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表 3 铬污染土壤细菌群落α多样性指数 Table 3 The α diversity indexes of bacteria communities in chromium pollution soil |
2.3 细菌群落构建机制分析
细菌群落构建是一个较为复杂的过程, 本研究首先基于零模型计算了A、B和C这3组的零期望相似度平均值以及实际观测相似度平均值, 并估算了细菌群落构建过程中的随机性比例(表 4)[26].A、B、C 3组的随机性比例分别为0.453、0.384和0.359, 模型的P值均小于0.05, 这说明在铬污染土壤中细菌群落的构建基本上都以决定性因素为主, 而随着铬污染含量的增加决定性因素所占的比例不断增加, 从而进一步影响细菌的群落结构.通过计算遗传多样性的βNTI 指数与RCbray指数, 进一步验证了随机性比例的结果[27].如表 4所示, 3组样品的βNTI值均小于-2, 表明铬污染土壤中细菌群落构建是决定性因素占主导, 且为同质选择.
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表 4 不同铬污染程度土壤细菌群落的相似度1) Table 4 Similarity of bacterial communities in soil with different levels of chromium pollution |
2.4 细菌群落与环境因子关系分析
为了进一步了解影响细菌群落结构以及构建过程的环境因子, 对各组样本的细菌群落与环境因子之间关系进行CCA分析, 结果如图 6所示, 第一轴与第二轴分别能解释41.94%与38.32%的细菌群落差异, 两个轴累积解释变异量达到80.26%, 能够较好地反映出影响细菌群落的主要环境因子.土壤样品按照污染程度明显分开, 并且排列方向与环境因子总Cr箭头所指的方向一致, 表明土壤中Cr的含量可能是驱动微生物群落变化与构建机制的重要因素之一.此外, Mantel检验结果表明[28], 土壤铬含量(Cr, r2=0.598, P=0.001)、pH (r2=0.335, P=0.001)、有机质(OM, r2=0.374, P=0.006)和含水率(MC, r2=0.590, P=0.001) 均与细菌群落显著相关, 说明以上因素均可以显著影响细菌群落.环境因子和丰度较高的前5个优势菌门细菌群落的Mental分析显示(表 5), 变形菌门(Proteobacteria) 与土壤的铬含量、pH和OM显著相关, 放线菌门(Actinobacteria) 与土壤的铬含量、MC和pH显著相关, 酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi) 与土壤的铬含量和MC之间显著相关, 厚壁菌门(Firmicutes) 与土壤的铬含量、OM显著相关.这些结果进一步说明土壤中Cr含量是影响优势菌门细菌群落的驱动因子.
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图 6 不同铬含量土壤样品中细菌群落CCA分析 Fig. 6 CCA analysis of bacterial community in soil samples with different chromium concentrations |
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表 5 优势菌门和环境因子的Mantel检验 Table 5 Mantel test of dominant bacterial phyla and environmental factors |
3 讨论 3.1 铬污染对土壤细菌群落结构与组成影响
通过上述实验结果发现Cr含量显著地影响了细菌群落的结构与组成.有研究表明, 土壤细菌在低含量的重金属环境下无反应或反应较弱, 当超过土壤细菌的耐受含量时, 将对细菌的生长产生抑制效果, 降低细菌的活性[29].在铬污染土壤样品中发现放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes) 丰度随着铬污染程度的上升而增大, 可能是在铬污染过程中这些种类的细菌得到了富集.属水平上, 节杆菌属(Arthrobacter)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)和亚硝化菌属(Nitrolancea) 丰度随着铬污染程度的增加而下降, 可能是因为这些细菌不能够抵抗高含量的铬[30].这可能是由于铬对土壤中酶活性的抑制作用导致的, 如张雪晴等[30]在研究铜矿重金属污染对酶活力的影响时发现, 土壤中磷酸酶和脱氢酶的活性随着Cd、Zn和Pb含量的升高而明显下降.据相关报道, 变形菌门(Proteobacteria) 中的假单胞菌属(Pseudomonas)、盐单胞菌属(Halomonas)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas); 厚壁菌门(Firmicutes) 中的芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus); 放线菌门(Actinobacteria) 中的节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces) 均具有较强的耐铬能力, 同时能够还原六价铬, 在修复铬污染方面有着巨大的潜力[31].
其中变形菌门(Proteobacteria) 的丰度随铬含量的上升先升高后减小, 亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)和节杆菌属(Arthrobacter) 丰度随铬含量升高先下降而后显著增大.谢学辉等[32]在德兴铜矿尾矿库重金属污染对细菌群落多样性影响研究中发现, 各地土壤样品中, 细菌群落的香农指数在距离尾矿中等距离时最大; Wakelin等[33]将不同浓度梯度的Cu投放到土壤中, 细菌群落的α多样性指数随着重金属Cu含量的增加呈先升高后下降的趋势, 这些研究也验证了本文所得到的结论.李政红等[34]在耐铬菌群特性的研究中发现, 耐铬菌群在pH为5.5~8.5, 温度20~50℃的环境条件下均能生长, 最适宜的生长环境是在pH为7.5, 温度为30℃.由此可以推测, 高含量的铬可能抑制了较为敏感细菌的生长, 同时使耐受性强的细菌富集, 土壤pH随铬含量的上升而逐渐下降, 在下降过程中逐渐达到细菌最佳生长的pH值, 所以铬含量较低或较高时细菌群落的生物多样性及丰度均低于中含量, 中等含量的铬污染土壤中细菌群落变化及多样性更为丰富.
3.2 铬含量对土壤细菌群落构建影响在生态系统中研究复杂的群落构建机制对于维持生物多样性以及调控群落十分重要.微生物群落构建过程不仅决定了群落的组成和多样性, 还对系统的生态功能产生影响.土壤细菌能在不同环境因子的影响下, 呈现出特征性的群落结构差异, 从而适应外界环境变化[35].本研究结果表明, 铬污染土壤细菌群落的构建过程主要受到确定性因素的影响.由此可以推测, 在不同铬含量的污染土壤中, 铬含量是土壤环境中变化最为显著的, 所以在铬污染土壤中, 细菌群落的构建是以确定性因素为主导, 且为同质选择; 随机性过程则在外界环境干扰较小的环境中发挥主导作用[36].以上结论表明, 确定性因素会对铬污染土壤中细菌的群落构建存在影响, 随着铬含量的升高, 细菌群落构建过程的随机性过程下降, 确定性过程增加, 导致群落的物种多样性呈现先升高后降低的变化趋势, 这一结论与细菌群落多样性变化的结果一致.
环境因子被认为是影响细菌群落变化的主要驱动力, 土壤pH值、有机碳、土壤质地和温度等都可以显著影响细菌群落的构建[37].本实验所采集的3组不同铬含量污染土壤pH值之间的差异也较为显著, pH值在6.34~8.60的范围内, 且与细菌群落多样性呈显著的相关关系, 说明土壤pH的改变也影响了铬污染土壤细菌群落的构建过程.此外, 在分析过程中发现了多种耐铬和六价铬还原菌种以及未命名的耐铬细菌, 可以在后续研究中对其进行种属的鉴定, 为研究细菌修复铬污染土壤提供参考依据.
4 结论(1) 不同铬污染程度土壤样品中共包含55个门、121个纲、212个目、440个科和1375个属.优势菌门(相对丰度>5%) 为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、奇古菌门(Thaumarchaeota)和厚壁菌门(Firmicutes), 优势菌属为亚硝化螺菌属(Nitrososphaera)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和小梨形菌属(pirellula).
(2) 铬污染能显著地影响土壤细菌群落的结构与多样性, 放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes) 丰度随着铬含量的升高而显著增加, 绿弯菌门(Chloroflexi)丰度随铬含量的升高而显著下降, 变形菌门(Proteobacteria) 丰度随铬含量的上升呈先升高后下降的趋势, 奇古菌门(Thaumarchaeota) 丰度随铬含量的升高呈先下降后升高的趋势; 属水平上, 亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和节杆菌属(Arthrobacter) 丰度随铬含量升高先下降而后显著增大, 鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、小梨形菌属(Pirellula)和类诺卡氏属(Nocardioides) 丰度随铬含量的升高而显著增大, 芽单胞菌属(Gemmatimonas) 丰度随铬含量的升高而显著减小.
(3) 铬污染土壤中细菌群落的构建以决定性过程为主, 并且随着铬污染程度的增加, 随机性过程逐渐下降, 确定性过程逐渐增加.环境因子中铬含量、有机质、含水率、pH对铬污染土壤的细菌群落影响显著, 总铬含量为影响细菌群落以及各优势门水平微生物群落的主要影响因素.
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