2021, Vol. 42
2. 江苏省水利科学研究院, 南京 210017
2. Jiangsu Institute of Water Resources and Hydropower Research, Nanjing 210017, China
保障饮用水水质安全是维护人民群众根本利益的基本要求, 也是建设水生态文明的重点工作.近年来, 在德国、美国和中国等集中式供水水源地中频繁检出抗生素等新兴污染物, 对水生态安全和饮用水水质产生潜在威胁[1~5].水环境中低浓度的抗生素可作为一种信号分子, 调控微生物群落选择性适应抗生素, 加快耐药细菌和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的产生和传播[6].由于具有高传播性、环境持久性等特征, ARGs在环境中的残留和传播带来的生态健康风险引起人们的广泛关注.目前, ARGs已在我国黄浦江[7]、金山湖[8]和东江河流域[9]等河湖系统和饮用水水源地中广泛检出, 对人类健康造成潜在威胁.解析水源地中抗生素和ARGs的污染特征, 探寻阻止抗生素及ARGs的传播的有效途径已成为近年来研究热点.然而, 目前有关江苏省代表性集中式饮用水水源地中抗生素及ARGs的赋存特征、影响因素等方面的研究尚不多见.本研究于2018~2019年开展江苏省代表性集中式饮用水水源地抗生素和ARGs的调研, 测定水源地取水口处水体、表层沉积物以及石相附着生物膜中10种代表性抗生素、1类整合子intl1以及7种典型ARGs赋存情况, 分析ARGs潜在宿主及传播规律, 以期为江苏省水源地中抗生素及ARGs的赋存、传播和归趋机制研究提供一定的基础数据.
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ, 美国Waters公司), 配备ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司); 固相萃取装置(Mediwax 12, 美国Supelco公司); 氮吹仪(KD200, 杭州奥盛仪器有限公司); 冷冻干燥仪(18L Freeze Dry System, 美国Labconco公司); Oasis HLB固相萃取柱(6 mL, 500 mg, 美国water公司)Supelclean LC-SAX固相萃取柱(3 mL, 500 mg, 美国Waters公司); 加速溶剂萃取仪(ASE350, 美国Thermo公司); 0.45 μm滤膜(玻璃纤维材质, 上海Whatman公司); 高速冷冻离心机(TGL16M, 湘智离心机仪器有限公司); 超纯水仪(Milli-Q Advantage, 美国Millipore公司).磺胺类及喹诺酮类标准品抗生素购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司(Augsburg, Germany), 纯度大于98%.甲醇(色谱纯)购自于德国Merck公司.使用甲醇作溶剂配制1 mg ·L-1的混合储备液置于-20℃冰箱备用.甲酸、乙酸乙酯为色谱级, 购于江苏强盛功能化学股份有限公司. Na2EDTA和PBS缓冲液购于上海源叶生物科技有限公司.
1.2 样品采集和预处理选取江苏省5处代表性集中式水源地为研究对象, 包括苏北地区的蔷薇湖(34.53°N, 119.06°E)和骆马湖(34.01°N, 118.14°E)、苏中地区的高邮湖(32.75°N, 119.24°E), 以及苏南地区的滆湖(31.61°N, 119.87°E)和贡湖(31.46°N, 120.38°E), 采样点分布情况见图 1.于2018年12月(冬季)、和2019年6月(夏季)在各集中式水源地取水口处进行采样.利用采水器在水面下0.5 m处采集5 L水样放入玻璃瓶中并添加硫酸调至pH至2以抑制细菌生长.用抓泥斗取取水口处表层沉积物样约500 g.石相附着生物膜采集方法如下：将采样点处附着生物膜的岩石从水中取出, 用塑料铲轻轻地将生物膜刮入塑料瓶中.将采集到的生物膜过10目筛去除杂质, 并利用沉淀法去除沙石.所有样品放入含有冰袋的样品储存箱中保存, 尽快运回实验室.
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图 1 江苏省代表性水源地采样点示意 Fig. 1 Sampling points of representative drinking water resources in Jiangsu Province |
水样运回实验室后, 首先使用氢氧化钠溶液将pH值调节为中性, 再用0.45 μm醋酸纤维滤膜进行抽滤.每升水样加入0.5 g Na2EDTA, 振荡混合均匀, 使用HLB小柱富集萃取. HLB小柱使用前, 依次用9 mL甲醇、5 mL纯水、5 mL的0.1%甲酸水溶液淋洗活化, 取1 L水样以5 mL ·min-1的流速通过HLB小柱.过滤后的滤膜保存于-80℃冰箱中待用.样品富集完成后, 使用4 mL高纯水清洗小柱, 负压抽干30 min.用6 mL的甲醇和6 mL含0.1%甲酸的甲醇分两次洗脱小柱, 洗脱液移至自动浓缩仪内, 置于40℃水浴中氮气吹脱至近干, 最后用含0.1%甲酸的甲醇定容至1 mL, 使用0.22 μm滤膜过滤后, 存放于棕色气相色谱瓶中保存待测.
表层沉积物样与附着生物膜样进行冷冻干燥后研磨过100目孔径筛.准确称取5 g干燥样品置于50 mL离心管中.加入10 mL PBS缓冲液和乙腈的混合液(1 :1, 体积比, pH=3), 在200 r ·min-1条件下振荡20 min, 并进行超声提取10 min.以4 000 r ·min-1速度离心10 min, 收集上清液, 按上述方法提取2次, 合并提取液并加超纯水稀释至300 mL.将提取液通过LC-SAX和HLB串联柱进行富集.串联柱预先用10 mL甲醇、10 mL超纯水进行活化.过柱流速控制在3~5 mL ·min-1.样品富集完毕后, 用10 mL超纯水清洗串联柱, 去掉LC-SAX小柱, 负压抽真空干燥5 min.用10 mL甲醇对目标物进行洗脱, 收集的洗脱液于40℃下氮吹至近干, 然后用含0.1%甲酸的甲醇定容至1 mL, 使用0.22 μm滤膜过滤后, 存放于棕色送样瓶中保存待测.每个条件下设置3个平行.
1.3 仪器检测与质量控制 1.3.1 仪器检测(1) 色谱条件 ACQUITY BEH C18色谱柱, (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司); 流动相A为0.1%甲酸的水溶液, 流动相B为乙腈; 梯度洗脱程序：0~0.25 min, 90% A; 3.5 min, 50% A; 4.0~5.0 min, 5% A; 5.01~6.0 min, 90% A; 流速：0.3 mL ·min-1; 柱温：40℃; 进样量：5 μL.
(2) 质谱条件 采用三重四级杆质谱仪(具电喷雾离子源, Waters Xevo TQ)对目标化合物进行定性定量分析.离子源：ESI源; 电离模式：正离子模式; 毛细管电压：3.0 kV; 离子源温度：150℃; 锥孔反吹气流量：50 L ·h-1; 脱溶剂气温度：500℃; 脱溶剂气流量：900 L ·h-1; 监测模式：MRM模式.测试抗生素的质谱条件见表 1.
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表 1 10种抗生素的质谱条件 Table 1 MS parameters used in the determination of the ten antibiotics |
1.3.2 质量控制与保证
每份样品设置3个平行样.每批样品设置一个溶剂空白、一个野外空白和3个基质加标.每种目标污染物通过离子对和色谱保留时间进行定性, 通过离子信号定量, 建立标准曲线, 获得处理后样品中抗生素的浓度.通过内标回收率校准后, 最后得到样品中污染物的浓度.标准曲线由7个不同浓度梯度的混合标准溶液进行确定.方法定量下限采用3倍检出限确定.水样加标水平为50 ng ·L-1, 回收率范围为42.2% ~70.8%;表层沉积物和附着生物膜加标水平为100 ng ·g-1, 回收率范围为62.5% ~70.2%, 相对标准偏差低于20%.溶剂空白和野外空白中未检出目标化合物.
1.4 样品DNA提取和高通量测序样品中DNA采用FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals, Solon, OH, USA)试剂盒提取.对于水样DNA, 将1.2.1节中过滤后的滤膜剪成小块放入试剂盒.对于表层沉积物和附着生物膜, 取0.1 g湿重样品置于试剂盒进行提取.提取后的DNA样品送至上海凌恩生物科技有限公司进行细菌16S rRNA基因V3-V4高变区的高通量测序, 所用引物对为341F(5′-CCTAYGGGRBGC ASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCT AAT-3′).
1.5 实时荧光定量PCR对各介质中两种磺胺类ARGs(sul1和sul2)、3种四环素类ARGs(tetW、tetC和tetQ)、两种氯霉素类ARGs(cmlA和floR)以及与ARGs传播密切相关的一类整合子intl1进行定量PCR(qPCR)分析.扩增ARGs片段所对应的引物名称、序列、片段大小和退火温度的信息见表 2.目的基因的PCR扩增体系设置为30 μL, 其中包括15 μL的qPCR Mix, Mg2+(2 mmol ·L-1)溶液2 μL, 正向和反向引物各0.5 μL, 模板2 μL, 模板DNA浓度约为10 ng ·μL-1, 加ddH2 O补足至30 μL. PCR扩增设置程序为：在95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 退火温度为60℃, 最后72℃延伸30 s, 循环30次. PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳跑胶后, 割取扩增片段大小正确的条带回收, 用于后续的标准品制作.将纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上, 连接载体转化后涂布至LB琼脂平板, 在37℃下过夜培养, PCR鉴定5个单克隆菌落, 挑选接种一个阳性菌落进行扩大培养, 之后进行质粒抽提, 即标准品质粒.采用标准品专用稀释液做10倍梯度稀释, 制备目的基因的定量标准曲线.
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表 2 用于定性和定量ARGs等目的基因片段的引物基本信息 Table 2 Specific primers used for PCR and real-time PCR analysis of ARGs and other target gene abundances |
使用实时荧光定量PCR仪(7900HT型, ABI公司, 美国)进行目的基因的丰度分析. Real Time PCR体系包括12 μL ddH2 O, 15 μL qPCR Mix, 正向和反向引物(浓度为10 μmol ·L-1)各0.5 μL, 模板2 μL. qPCR程序如下：95℃预变性3 min, 循环次数为1, 循环5次变性为温度95℃持续30 s, 退火温度70℃持续30 s, 循环38次变性温度95℃持续30 s, 退火温度60℃持续30 s, 最后72℃延伸30 s. 16S rRNA反应条件同目的基因.实验得到的16S rRNA、整合子intl1 和7种ARGs的扩增效率范围在80% ~97%.
1.6 数据分析采用QIIME 1.7.0软件进行质量检测：①设置50 bp的窗口, 如果窗口内的平均质量值低于20, 从窗口开始截去后端碱基, 去除质控后长度低于50 bp的序列; ②barcode需精确匹配, 引物允许2个碱基的错配, 去除模糊碱基; ③根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接, overlap需大于10 bp, 去除无法拼接的序列.将序列进行剪切, 并使用SILVA128参考比较数据库进行比对.根据97%的相似性截断值将16S rRNA序列聚类为操作分类学单位(OTUs).使用Microsoft Office Excel 2016对数据进行整理计算.使用IBM SPSS19.0进行数据的相关性分析.使用Origin Pro 9.0绘制ARGs相对丰度图.共现网络分析体现ARGs和微生物之间的潜在的因果相互作用结构.首先通过Spearman的相关分析, 确定微生物群落的共现网络.各OTU之间的Spearman的秩相关系数(ρ)至少在25%的样本中出现, 并且使用内部的R脚本在R v3.5.3(http://cran.R-project.Org/)中至少进行30次两两间计算, 数据可视化及模块化分析通过Gephi软件(http://gephi.github.io/)实现.本研究中的细菌16S rRNA序列已经存入NCBI的Sequence Read Archive(SRA)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), BioProject ID为PRJNA647936.
2 结果与讨论 2.1 抗生素赋存现状江苏省5处代表性水源地中磺胺类抗生素检出率和丰度相对较高(表 3), 其中磺胺甲唑的检出率为100%, 磺胺甲唑和磺胺间甲氧嘧啶在水体中的浓度分别为1.0~78.1 ng ·L-1和NF(未检出, 下同)~56.7 ng ·L-1.研究区域中磺胺甲唑浓度远低于黄浦江流域[10](2.1~623.3 ng ·L-1)和珠江流域[11](NF~1080 ng ·L-1).相比而言, 喹诺酮类抗生素性质较不稳定, 在光照条件下易发生光解[12], 可能是其残留浓度较低的原因.水源地表层沉积物中磺胺类抗生素的检出率亦为100%(表 3).磺胺甲唑、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、磺胺喹啉和磺胺间二甲氧嘧啶的含量分别NF~15.4、1.7~25.3、2.6~87.0、NF~7.9和NF~10.7 ng ·g-1.与水体中检测结果类似, 喹诺酮类抗生素在沉积物中的含量较磺胺类更低, 诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星的含量分别为NF~0.7、NF~3.8和NF~0.8 ng ·g-1.值得指出的是, 滆湖水源地取水口表层沉积物中抗生素检出含量和检出率均高于其他采样点, 10种抗生素总检出量最高可达226.6 ng ·g-1, 推测可能原因是该取水口附近村庄密集, 生活污水和面源径流等排放量较多.
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表 3 代表性水源地取水口处不同介质中抗生素含量 Table 3 Concentrations of target antibiotics in multiple potential sources in the intake area in representative drinking water resources |
石相附着生物膜是由矿物颗粒、原生动物、固着细菌、真菌和藻类等构成的集合体, 具有较强的吸附能力, 在河湖污染物的迁移转化过程中起着决定性作用. 表 3显示骆马湖水源地生物膜中抗生素含量远高出其他采样点, 其中磺胺类抗生素含量为827.6~3 759.1 ng ·g-1, 喹诺类抗生素含量1.14~220.9 ng ·g-1, 其他采样点中两大类抗生素含量分别为NF~50.7 ng ·g-1和0.03~10.5 ng ·g-1.洪大林等[13]研究了骆马湖入湖抗生素的潜在来源, 推测污染主要来自新沂河与中运河等入湖河流承纳的生活污水与工业废水, 这可能是本研究中骆马湖表层沉积物和附着生物膜中抗生素赋存水平较高的原因.
与国内外其他流域相比, 研究区域上覆水体中磺胺类抗生素含量(NF~37.5 ng ·L-1)低于长江口(NF~71.8 ng ·L-1)和黄浦江(NF~89.1 ng ·L-1L)[14]等流域, 与深圳铁岗供水水库[15](6.1~47 ng ·L-1)、美国东南部某饮用水源地[16](2.0~19.9 ng ·L-1)、以及葡萄牙里斯本市地表饮用水源地[17] (8~25 ng ·L-1)等水源地浓度水平相当.喹诺酮类抗生素总量与长江口(NF~2.3 ng ·L-1)、黄浦江[14](NF~34.2 ng ·L-1)的浓度水平相当, 低于珠江[18](14~74 ng ·L-1)流域.表层沉积物中磺胺类抗生素的含量与三峡库区[19](3.0~35.9 ng ·g-1)、黄河[20](NF~22 ng ·g-1)以及美国的Cache La Poudre河[21](NF~13.7 ng ·g-1)中含量相当, 高于黄浦江流域(0.2~0.6 ng ·g-1), 显著低于珠江流域[22](NF~248 ng ·g-1)及海河流域(29.1~216.4 ng ·g-1).喹诺酮类抗生素的含量与辽河[20](诺氟沙星：NF~3.3 ng ·g-1)和瑞士格里芬湖[23](诺氟沙星：2.4 ng ·g-1、环丙沙星：2.5 ng ·g-1)等区域相当, 低于黄河[20](NF~123 ng ·g-1)、海河[20](10.3~5 770 ng ·g-1)以及珠江流域[24](21.8~1 560 ng ·g-1).总体而言, 本研究5处江苏省水源地的抗生素处于较低污染水平.
2.2 ARGs赋存特征及与国内外其他流域赋存状况的比较2018年12月(冬季)与2019年6月(夏季)各采样点水体中目标ARGs绝对丰度如图 2所示. sul1、sul2、tetW和tetQ在各介质中的检出率为100%.比较发现冬季水体中各ARGs绝对丰度均高于夏季.冬季水体中磺胺类ARGs, 即sul1和sul2的丰度分别为1.13×105~2.48×106 copies ·L-1和6.4×104~1.12×106 copies ·L-1, 高于夏季样品中丰度值6.8×104~1.30×105 copies ·L-1和3.65×102~10.34×103 copies ·L-1.冬季水样中四环素类ARGs, 即tetQ、tetC和tetW的含量分别为1.01×105~3.37×105、9.5×102~2.66×106和1.77×104~4.7×104 copies ·L-1, 亦高于夏季样品中的各绝对丰度.氯霉素类ARGs, 即floR和cmlA在冬季含量分别为1.5×104~2.04×104 copies ·L-1和8×102~7.52×103 copies ·L-1, 夏季含量则分别为NF~1.62×104 copies ·L-1和NF~1.83×104 copies ·L-1. Jiang等[7]的研究结果表明, ARGs在河湖水体中的浓度受多种因素影响, 其丰度与水体流速呈显著负相关.江苏省夏季雨水频繁, 取水口区域水量增加, 流速增大, 而冬季水源地水体流速缓慢, 可能促进了ARGs的富集.
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图 2 上覆水体、表层沉积物与附着生物膜中ARGs的绝对丰度 Fig. 2 Absolute abundances of ARGs water, sediments, and epilithic biofilm samples |
与水体中ARGs丰度规律不同, 夏季表层沉积物与石相附着生物膜中ARGs绝对丰度总体高于冬季水平, intl1、sul1、tetQ、tetW和floR等基因对温度的响应更加显著.这与Luo等[23]在海河流域观测的结论一致, 不同季节下sul1等ARGs在环境中的分布存在显著差异, 造成这种差异的原因包括环境温度、微生物活性, 以及intl1丰度等.由于intl1基因可以促进sul1在微生物之间转移传播, 且夏季样品中的intl1基因丰度较高, 可能是sul1在夏季样品中丰度增加的重要原因之一.此外, 温度的变化会对ARGs的转移产生影响, 随着温度的升高, 微生物与ARGs间的结合转移频率会显著增大, 加速ARGs的传播和扩散[25, 26].彭晶等[27]研究了堆肥系统中各环境因素对ARGs的影响, 发现温度是影响堆肥系统中tetQ和tetW等多种ARGs的重要环境因子, 夏季较高的温度可能是促进沉积物和生物膜中部分ARGs含量增高的原因.
图 3为目的ARGs在3种环境介质中的相对丰度.表层水样中, 磺胺类ARGs的相对丰度最高, sul1和sul2基因的相对丰度(以16S rRNA计, 下同)分别为3.13×10-2~6.34×10-1和1.11×10-3~1.74×10-1.磺胺类ARGs在水体为优势ARGs的原因主要有以下2点：①环境中细菌对磺胺类抗生素有较强的抗性, 磺胺类ARGs的潜在宿主较多; ②sul 2基因是一类二氢酸合成酶基因, 在环境中普遍存在. 图 3(b)表明表层沉积物与附着生物膜中目的ARGs的相对丰度相当, 显著高于水体中目的ARGs的丰度.水样中ARGs的含量远低于沉积物和生物膜中丰度的原因可解释如下.首先, 在水体中, 可移动遗传元件(mobile genetic element)主导的水平基因转移是ARGs传播和扩散的主要驱动因子[28], 本研究测定的intl1是一种与ARGs传播密切相关的可移动遗传元件, 是评价水体中ARGs传播的重要指标.水样中intl1丰度远低于沉积物和生物膜中的含量(图 2), 这与3种介质中ARGs相对丰度间的关系相吻合.其次, 水环境中ARGs易吸附于颗粒物/悬浮物等物质表面, 随其沉降至表层沉积物和生物膜等环境介质, 这类固相环境介质的稳定生境有利于宿主微生物的繁殖, 进一步促进ARGs的扩散.因此在沉积物/生物膜中, 水平基因转移和宿主微生物的繁殖都是影响ARGs传播和扩散的重要过程[29].
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(a)上覆水体; (b)表层沉积物和附着生物膜 图 3 ARGs在上覆水体、表层沉积物与附着生物膜中相对丰度 Fig. 3 Relative abundances ARGs in water, sediments, and epilithic biofilm samples |
表 4总结了国内外代表性流域表层水中ARGs丰度, 其中磺胺类ARGs在各流域丰度均为最高.本研究中5处水源地中的磺胺类ARGs丰度远低于梅梁湾的磺胺类ARGs丰度, tetW基因的丰度则高于梅梁湾检测的丰度.磺胺类ARGs和四环素类ARGs与珠江流域的东河、西河、南河以及意大利的马焦雷湖相当.与长江、黄浦江、海河、韩国的清州湖以及瓦塔尔河等流域相比, 研究区域的ARGs丰度较低.与国内外代表性流域相比, 研究的5处水源水中的ARGs污染水平较低.
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表 4 国内外不同水源地水体ARGs绝对丰度1)/copies ·L-1 Table 4 Absolute abundances of ARGs in various drinking water resources in China and elsewhere in the world/copies ·L-1 |
研究区域表层沉积物中ARGs的丰度与长江、洞庭湖、洪泽湖以及西班牙的River Lobregat相当(表 5), 低于大辽河和珠江流域.磺胺类ARGs在沉积物中相对丰度最高, sul1和sul2的相对丰度分别为9.14×10-4~8.88×10-1和2.12×10-4~2.68×10-1.在附着生物膜中sul 1和sul2的相对丰度分别为1.74×10-5~8.88×10-1和4.04×10-4~1.24.四环素类ARGs, 即tetQ、tetC和tetW的相对丰度分别为5.08×10-5~3.75×10-2、5.82×10-4~1.53×10-1和1.85×10-5~1.08×10-2, 其中tetC的丰度最高.氯霉素类抗性基因cmlA和floR的相对丰度分别为1.30×10-5~1.11×10-2和2.67×10-4~2.24×10-2.以上数据表明研究区域水样和表层沉积物样品中的ARGs均处于低污染水平.
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表 5 国内外不同水源地表层沉积物中ARGs绝对丰度/copies ·g-1 Table 5 Absolute abundances of ARGs in sediments in drinking water resources in China and elsewhere in the world/copies ·g-1 |
结合上述分析结果, 本研究所关注的5处代表性水源地抗生素和ARGs均处于较低污染水平, 且水源地间污染物赋存无显著地理性差异.结果说明江苏省水源地整体水质状况良好, 除常规指标能达到地表Ⅱ类至Ⅲ类水标准外, 抗生素和ARGs等新型污染物亦控制在较低污染水平.值得注意的是研究期间内滆湖表层沉积物和骆马湖附着生物膜样品中抗生素赋存量较高, 此两处水源地取水口处沉积物和生物膜中ARGs丰度也高于其他水源地, 综合考虑采样频次、分析测试方法等造成的误差, 该两处水源地抗生素和ARGs的潜在环境和生态风险仍值得关注.
2.3 微生物群落与抗生素ARGs间的关系不同季节各介质中门水平的微生物群落组成如图 4所示.变形菌门(Proteobacteria)在不同季节不同介质中均为环境样本中的优势菌.冬季表层水体中放线菌门(Actinobacteria)的丰度略低于变形菌门.而在夏季, 厚壁菌门(Fimicutes)的丰度有明显提升, 丰度仅次于变形菌门.在沉积物中, 绿屈挠菌门(Chloroflexies)和酸杆菌门(Acidobacteria)为主导菌.冬季生物膜中的主导菌为疣微菌门(Verrucomicrobia), 夏季主导菌门则为拟杆菌门(Bacteroidetes).不同季节各介质中属水平的微生物群落组成如图 5所示.不同季节的不同介质中属水平微生物群落结构差异显著. 5个水源地水样中占比最高的是马赛菌属(Massilia)(冬季, 占比21.3%)和不动杆菌属(Acinetobacter)(夏季, 占比53.4%).表层沉积物样品中占比最高的是硫杆菌属(Thiobacillus), 冬季占比57.5%, 夏季占比24.1%.附着生物膜样品中占比最高的是气单胞菌属(Aeromonas)(冬季, 占比26.7%)和不动杆菌属(Acinetobacter)(夏季, 占比26.0%).
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图 4 门水平上微生物群落组成 Fig. 4 Microbial compositions at the phylum level |
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图 5 15种样品中丰度前20的细菌属的分布热图 Fig. 5 Heatmap of the top 20 most abundant bacterial genera across the 15 samples |
属水平微生物和intl1及ARGs之间的共现网络分析如图 6所示.连接线表示节点与节点之间相关性大于0.6, 显著性小于0.05的相关关系, 节点的大小与节点间的显著相关性成正比.节点间的连线颜色代表着节点间的相关关系, 红色代表正相关, 绿色代表负相关.不同着色的节点代表着不同连接度的模块.橘色代表连接度最高的ARGs, 包括tetW和cmlA; 绿色代表连接度最低的ARGs, 包括sul1、tetC、intl1和floR.多种属水平上的微生物与ARGs丰度呈显著负相关关系, 包括sul2与Pseudoelavibacter、Leadbetterella和Luteolibacter; tetW与Novosphingobium; tetC与Chtinophaga; tetQ与Novosphingobium、Luteolibacter和Flavobacterium; clmA与Terrimonas; floR与Algoriphagus, 和Chitinilyticum以及intl1与Chtinophaga.其中, Luteolibacter和Flavobacterium(两种同属于黄杆菌属)在表层沉积物和底质中的丰度呈现出夏季大于冬季的特征.这说明Luteolibacter和Flavobacterium可能是导致冬季表层沉积物和生物膜样品中ARGs丰度相对较高的原因.
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图 6 属水平微生物群落与ARGs之间网络分析 Fig. 6 Network analysis between microbial communities at genus level and ARGs |
当目的ARGs和属水平微生物之间呈现显著正相关关系时, 一般认为这些菌属可能是ARGs的潜在宿主.这些菌属所属的拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、疣微菌门和放线菌门都是ARGs的潜在宿主. Huerta等[41]研究了供水水库中的微生物群落和ARGs之间的潜在关系, 发现厚壁菌门丰度与sul1基因丰度之间显著相关. Wang等[42]研究了洪湖中微生物群落和ARGs之间的变化规律, 发现厚壁菌门、变形菌门、芽单胞菌门和疣微菌门丰度与ARGs丰度呈显著正相关, 表明所属这些门的细菌可能是ARGs的宿主[43].因此, 当环境中这些潜在宿主细菌丰度增加时, 会促进ARGs在环境中的传播和水平转移.
本研究进一步对ARGs的潜在宿主细菌之间进行了相关性分析.结果表明, ARGs的部分共同宿主之间呈显著正相关关系, 如Novosphingobiu(新鞘脂菌属)与Terrimonas(黄体土单胞菌属)(P<0.01, R2=0.766), Luteolibacter(淡黄杆菌属)与Chitinophagaceae (甲壳菌属)(P<0.01, R2=0.721), 而这些细菌都是tetQ、tetW、tetC和floR等ARGs的共同宿主.研究表明某些ARGs的共同宿主是潜在的致病菌, 如tetW和tetQ的共同宿主, Acinetobacter(不动杆菌属)中的Baumannii(鲍氏不动杆菌), Arcobacter(弓形杆菌属)中的Butzleri(比茨莱弓形菌)以及Bacteroides(拟杆菌属)中的Fragilis(脆弱拟杆菌)被认为是条件致病菌, 会对水生生态和人体健康产生潜在威胁.唐伟欣等[44]对规模化畜禽场粪便中多重耐药菌进行了研究, 结果显示多耐药菌的菌门集中分布在Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(后壁菌门)和Actinobacteria(放线菌门), 图 6中与抗性基因具有显著相关性的菌属中分别有6个、9个和5个属归属于这3个门, 占34个菌属中的58.8%, 说明水源地中存在部分多重耐药菌群, 但其丰度相对较低.其中Corynebacterium(棒状杆菌)是重要的多重耐药菌, 与tetW、tetQ和cmlA的丰度均具有较强的相关性.共同宿主的存在会促使ARGs水平转移, 将增加细菌获得多重耐药性的概率, 在一定程度上加速超级细菌的产生.多重耐药性细菌在江苏省水源地中的赋存及变化规律值得进一步探索和研究.
3 结论(1) 江苏省代表性水源地抗生素浓度处于较低水平.磺胺类抗生素在5处水源地取水口水体、表层沉积物和附着生物膜中的丰度均高于喹诺酮类抗生素.滆湖取水口处沉积物样品和骆马湖取水口处生物膜样品中抗生素赋存量较高.
(2) 目标ARGs中, sul1、sul2、tetW和tetQ的检出率为100%, 其中磺胺类ARGs, 即sul1和sul2基因绝对丰度和相对丰度均最高. ARGs浓度呈现季节性变化, 夏季水样中ARGs丰度高于冬季, 而冬季表层沉积物和生物膜样品中ARGs丰度相对较高.
(3) 沉积物与生物膜中目的ARGs的相对丰度相当, 显著高于水体中目的ARGs的丰度.这是由于水体中可移动遗传元件主导的水平基因转移是ARGs传播的主导因子, 而沉积物/生物膜中水平基因转移和宿主微生物的繁殖都是ARGs传播扩散的重要机制.
(4) 所属拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、疣微菌门和放线菌门的细菌最有可能成为代表性水源地中ARGs的潜在宿主.共同宿主和多重耐药菌的存在可能会促进ARGs的水平转移, 其变化规律和生态风险值得进一步探索和研究.
| [1] | Voigt A M, Ciorba P, Döhla M, et al. The investigation of antibiotic residues, antibiotic resistance genes and antibiotic-resistant organisms in a drinking water reservoir system in Germany[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2020, 224. DOI:10.1016/j.ijheh.2020.113449 |
| [2] | Kim S C, Carlson K. Temporal and spatial trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in aqueous and river sediment matrices[J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(1): 50-57. |
| [3] |
张海丰, 史明明, 孙艳梅, 等. 磺胺甲唑污染土壤中微生物群落结构与抗生素抗性基因的分布特征[J]. 环境科学, 2019, 40(10): 4678-4684. Zhang H F, Shi M M, Sun Y M, et al. Microbial community structure and the distribution of antibiotic resistance genes in soil contaminated by sulfamethoxazole[J]. Environmental Science, 2019, 40(10): 4678-4684. |
| [4] |
胡亚茹, 姜蕾, 张天阳, 等. 华东地区某饮用水源地中磺胺类抗性基因的分布特征[J]. 环境科学, 2018, 39(9): 4222-4228. Hu Y R, Jiang L, Zhang T Y, et al. Distribution characteristics of sulfonamide antibiotic resistance genes in a drinking water source in East China[J]. Environmental Science, 2018, 39(9): 4222-4228. |
| [5] |
姚鹏城, 陈嘉瑜, 张永明, 等. 废水处理系统中抗生素抗性基因分布特征[J]. 环境科学, 2019, 40(11): 5024-5031. Yao P C, Chen J Y, Zhang Y M, et al. Distribution characteristics of antibiotic resistance genes in wastewater treatment plants[J]. Environmental Science, 2019, 40(11): 5024-5031. |
| [6] | Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. |
| [7] | Jiang L, Hu X L, Xu T, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes and their relationship with antibiotics in the Huangpu River and the drinking water sources, Shanghai, China[J]. Science of the Total Environment, 2013, 458-460: 267-272. DOI:10.1016/j.scitotenv.2013.04.038 |
| [8] | Wang C, Gu X C, Zhang S H, et al. Characterization of antibiotic-resistance genes in antibiotic resistance Escherichia coli isolates from a lake[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2013, 65(4): 635-641. DOI:10.1007/s00244-013-9932-2 |
| [9] |
房平, 代鹤峰, 庄僖, 等. 东江下游典型饮用水源地抗生素抗性基因分布研究[J]. 生态环境学报, 2019, 28(3): 548-554. Fang P, Dai H F, Zhuang X, et al. Distribution of antibiotic resistance genes in typical drinking water sources in the lower Dongjiang River[J]. Ecology and Environment Sciences, 2019, 28(3): 548-554. |
| [10] | Chen K, Zhou J L. Occurrence and behavior of antibiotics in water and sediments from the Huangpu River, Shanghai, China[J]. Chemosphere, 2014, 95: 604-612. DOI:10.1016/j.chemosphere.2013.09.119 |
| [11] |
徐维海, 张干, 邹世春, 等. 香港维多利亚港和珠江广州河段水体中抗生素的含量特征及其季节变化[J]. 环境科学, 2006, 27(12): 2458-2462. Xu W H, Zhang G, Zou S C, et al. Occurrence and seasonal changes of antibiotics in the Victoria Harbour and the Pearl River, South China[J]. Environmental Science, 2006, 27(12): 2458-2462. DOI:10.3321/j.issn:0250-3301.2006.12.016 |
| [12] |
张力媛, 马秀兰, 王富民, 等. 喹诺酮类抗生素在水环境中危害及降解特性研究进展[J]. 广州化工, 2016, 44(10): 22-23, 26. Zhang L Y, Ma X L, Wang F M, et al. Research progress on quinolone antibiotics harm in the water environment and degradation characteristics[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2016, 44(10): 22-23, 26. DOI:10.3969/j.issn.1001-9677.2016.10.010 |
| [13] |
申霞, 洪大林, 谈永锋, 等. 骆马湖生态环境现状及其保护措施[J]. 水资源保护, 2013, 29(3): 39-43, 50. Shen X, Hong D L, Tan Y F, et al. Ecological environment of Luoma Lake and protection measures[J]. Water Resources Protection, 2013, 29(3): 39-43, 50. DOI:10.3969/j.issn.1004-6933.2013.03.009 |
| [14] | Shi H, Yang Y, Liu Z, et al. Occurrence and distribution of antibiotics in the surface sediments of the Yangtze Estuary and nearby coastal areas[J]. Marine Pollution Bulletin, 2014, 83(1): 317-323. DOI:10.1016/j.marpolbul.2014.04.034 |
| [15] |
朱婷婷, 段标标, 宋战锋, 等. 深圳铁岗水库水体中抗生素污染特征分析及生态风险评价[J]. 生态环境学报, 2014, 23(7): 1175-1180. Zhu T T, Duan B B, Song Z F, et al. Pollution characteristics and ecological risk assessment of antibiotics in Tiegang reservoir in Shenzhen[J]. Ecology and Environment Sciences, 2014, 23(7): 1175-1180. DOI:10.3969/j.issn.1674-5906.2014.07.013 |
| [16] | Padhye L P, Yao H, Kung'u F T, et al. Year-long evaluation on the occurrence and fate of pharmaceuticals, personal care products, and endocrine disrupting chemicals in an urban drinking water treatment plant[J]. Water Research, 2014, 51: 266-276. DOI:10.1016/j.watres.2013.10.070 |
| [17] | Gaffney V D J, Almeida C M M, Rodrigues A, et al. Occurrence of pharmaceuticals in a water supply system and related human health risk assessment[J]. Water Research, 2015, 72: 199-208. DOI:10.1016/j.watres.2014.10.027 |
| [18] | Xu W H, Yan W, Li X D, et al. Antibiotics in riverine runoff of the Pearl River Delta and Pearl River Estuary, China: concentrations, mass loading and ecological risks[J]. Environmental Pollution, 2013, 182: 402-407. DOI:10.1016/j.envpol.2013.08.004 |
| [19] |
徐晨.三峡库区水体、土壤和沉积物中抗生素与抗生素抗性基因的污染特征[D].武汉: 中国科学院武汉植物园, 2017. Xu C. Contamination of Antibiotic and antibiotic resistance genes in water, soil and sediment of the Three Gorges Reservoir[D]. Wuhan: Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, 2017. |
| [20] | Zhou L J, Ying G G, Zhao J L, et al. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hai River and Liao River in northern China[J]. Environmental Pollution, 2011, 159(7): 1877-1885. DOI:10.1016/j.envpol.2011.03.034 |
| [21] | Pei R T, Kim S C, Carlson K H, et al. Effect of river landscape on the sediment concentrations of antibiotics and corresponding antibiotic resistance genes (ARG)[J]. Water Research, 2006, 40(12): 2427-2435. DOI:10.1016/j.watres.2006.04.017 |
| [22] | Yang J F, Ying G G, Zhao J L, et al. Simultaneous determination of four classes of antibiotics in sediments of the Pearl Rivers using RRLC-MS/MS[J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(16): 3424-3432. DOI:10.1016/j.scitotenv.2010.03.049 |
| [23] | Luo Y, Mao D Q, Rysz M, et al. Trends in antibiotic resistance genes occurrence in the Haihe River, China[J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(19): 7220-7225. |
| [24] | Golet E M, Strehler A, Alder A C, et al. Determination of fluoroquinolone antibacterial agents in sewage sludge and sludge-treated soil using accelerated solvent extraction followed by solid-phase extraction[J]. Analytical Chemistry, 2002, 74(21): 5455-5462. DOI:10.1021/ac025762m |
| [25] | Guo X P, Yang Y, Lu D P, et al. Biofilms as a sink for antibiotic resistance genes (ARGs) in the Yangtze Estuary[J]. Water Research, 2018, 129: 277-286. DOI:10.1016/j.watres.2017.11.029 |
| [26] | Son D I, Aleta P, Park M, et al. Seasonal changes in antibiotic resistance genes in rivers and reservoirs in South Korea[J]. Journal of Environmental Quality, 2018, 47(5): 1079-1085. DOI:10.2134/jeq2017.12.0493 |
| [27] |
彭晶, 王科, 谷月, 等. 牛粪堆肥系统环境因子对抗性基因的影响[J]. 环境科学, 2019, 40(3): 1439-1445. Peng J, Wang K, Gu Y, et al. Effects of environmental factors on tetracycline and macrolides resistance genes in cattle manure composting systems[J]. Environmental Science, 2019, 40(3): 1439-1445. |
| [28] | Li P, Wu Y F, He Y L, et al. Occurrence and fate of antibiotic residues and antibiotic resistance genes in a reservoir with ecological purification facilities for drinking water sources[J]. Science of the Total Environment, 2020, 707. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.135276 |
| [29] | Brown P C, Borowska E, Peschke R, et al. Decay of elevated antibiotic resistance genes in natural river sediments after sedimentation of wastewater particles[J]. Science of the Total Environment, 2020, 705. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.135861 |
| [30] | Koczura R, Mokracka J, Taraszewska A, et al. Abundance of class 1 integron-integrase and sulfonamide resistance genes in river water and sediment is affected by anthropogenic pressure and environmental factors[J]. Microbial Ecology, 2016, 72(4): 909-916. DOI:10.1007/s00248-016-0843-4 |
| [31] | Li S, Zhang R J, Hu J R, et al. Occurrence and removal of antibiotics and antibiotic resistance genes in natural and constructed riverine wetlands in Beijing, China[J]. Science of the Total Environment, 2019, 664: 546-553. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.02.043 |
| [32] | Jia J, Guan Y J, Cheng M Q, et al. Occurrence and distribution of antibiotics and antibiotic resistance genes in Ba River, China[J]. Science of the Total Environment, 2018, 642: 1136-1144. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.06.149 |
| [33] | Lu Z H, Na G S, Gao H, et al. Fate of sulfonamide resistance genes in estuary environment and effect of anthropogenic activities[J]. Science of the Total Environment, 2015, 527-528: 429-438. DOI:10.1016/j.scitotenv.2015.04.101 |
| [34] | Zhang X X, Wu B, Zhang Y, et al. Class 1 integronase gene and tetracycline resistance genes tetA and tetC in different water environments of Jiangsu Province, China[J]. Ecotoxicology, 2009, 18(6): 652-660. DOI:10.1007/s10646-009-0332-3 |
| [35] | Su H C, Liu Y S, Pan C G, et al. Persistence of antibiotic resistance genes and bacterial community changes in drinking water treatment system: From drinking water source to tap water[J]. Science of the Total Environment, 2018, 616-617: 453-461. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.10.318 |
| [36] | Yang Y Y, Cao X H, Lin H, et al. Antibiotics and antibiotic resistance genes in sediment of Honghu Lake and East Dongting Lake, China[J]. Microbial Ecology, 2016, 72(4): 791-801. DOI:10.1007/s00248-016-0814-9 |
| [37] | Su H C, Pan C G, Ying G G, et al. Contamination profiles of antibiotic resistance genes in the sediments at a catchment scale[J]. Science of the Total Environment, 2014, 490: 708-714. DOI:10.1016/j.scitotenv.2014.05.060 |
| [38] | Chen B W, Liang X M, Nie X P, et al. The role of class I integrons in the dissemination of sulfonamide resistance genes in the Pearl River and Pearl River Estuary, South China[J]. Journal of Hazardous Materials, 2015, 282: 61-67. DOI:10.1016/j.jhazmat.2014.06.010 |
| [39] | Knapp C W, Lima L, Olivares-Rieumont S, et al. Seasonal variations in antibiotic resistance gene transport in the Almendares River, Havana, Cuba[J]. Frontiers in Microbiology, 2012, 3: 396. |
| [40] | Calero-Cáceres W, Méndez J, Martín-Díaz J, et al. The occurrence of antibiotic resistance genes in a Mediterranean river and their persistence in the riverbed sediment[J]. Environmental Pollution, 2017, 223: 384-394. DOI:10.1016/j.envpol.2017.01.035 |
| [41] | Huerta B, Marti E, Gros M, et al. Exploring the links between antibiotic occurrence, antibiotic resistance, and bacterial communities in water supply reservoirs[J]. Science of the Total Environment, 2013, 456. |
| [42] | Wang Z, Han M Z, Li E H, et al. Distribution of antibiotic resistance genes in an agriculturally disturbed lake in China: Their links with microbial communities, antibiotics, and water quality[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 393. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.122426 |
| [43] | Forsberg K J, Patel S, Gibson M K, et al. Bacterial phylogeny structures soil resistomes across habitats[J]. Nature, 2014, 509(7502): 612-616. DOI:10.1038/nature13377 |
| [44] |
唐伟欣, 孙兴滨, 高浩泽, 等. 规模化畜禽养殖场粪便中多重耐药菌分离鉴定及其耐药特征[J]. 农业环境科学学报, 2020, 39(1): 207-216. Tang W X, Sun X B, Gao H Z, et al. Isolation and identification of multidrug-resistant bacteria in feces from large-scale livestock and poultry farms and their antibiotic-resistance characteristics[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2020, 39(1): 207-216. |