2020, Vol. 41
2. 中国农业科学院农业水资源高效安全利用重点开放实验室, 新乡 453002
2. Key Laboratory of High-efficient and Safe Utilization of Agriculture Water Resources, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xinxiang 453002, China
据2009~2018年《中国水资源公报》统计数据显示, 我国农业用水量在全年总用水量中占比始终保持在60%以上.文献[1]指出, 水资源短缺已成为我国生态文明建设和经济社会可持续发展的瓶颈制约, 要求加强再生水、雨水和微咸水等非常规水多元、梯级和安全利用.水资源短缺和农业用水量大、效率低等问题日益突出, 再生水作为一种可靠、有效的替代水源成为发展节水灌溉和缓解农业用水供需矛盾的重要途径之一.文献[2]中明确指出城镇污水处理设施建设要实现由“污水处理”向“再生利用”的转变. 2017年全国城市再生水利用量为71.34亿m3[3], 预计到2030年, 农业可利用非常规水资源量为34.38亿m3, 其中再生水农田灌溉量可达16.45亿m3[4].然而, 随着农业灌溉利用的大力发展, 再生水中盐分、重金属、有机污染物及病原菌引入农业环境可能导致土壤环境质量恶化和农产品污染风险[5], 影响再生水农业灌溉的可持续利用.
生物质炭(biochar)是动植物残体在完全或部分缺氧条件下, 经缓慢高温热解(通常 < 700℃)产生的一类难熔的、稳定的、高度芳香化的和富含碳素的固态物质[6].其作为一类新型环境功能材料引起广泛关注, 在土壤改良、温室气体减排以及污染环境修复等方面表现出极大的应用潜力.生物质炭对于因土壤质量恶化导致的粮食产量不足以及全球变暖的缓解具有重要意义, 成为近年来农业和环境领域的研究热点[7].生物质炭能够增加再生水灌溉土壤和作物养分含量, 并且降低了土壤有效态重金属和植株重金属含量[8].施用生物质炭影响作物根区土壤微生物数量及其对碳源的利用, 降低作物疫病的发生, 但其效果因生物质炭种类而异[9].前期研究表明, 再生水灌溉会导致辣椒果实和根际土壤中Legionella spp.和Pseudomonas syringae丰度显著增加[10].崔二苹等[11]的研究发现, 生物质炭可以不同程度地增加或降低再生水灌溉根际土壤病原菌的检出量.已有研究表明, 生物质炭不仅可以改善土壤结构和提高作物产量, 还能有效抑制土壤真菌病原对作物根部的侵袭[12]. Duan等[13]的研究也报道了生物质炭作为农田改良剂, 可有效降低土壤和作物中人类条件致病菌的数量.大量研究证实, 施用生物质炭可以改变土壤酶活和微生物群落结构, 这对于土壤养分积累与转化过程有着重要作用[14~16].
生物质炭是废弃生物质资源化利用的一种有效处置方式, 将其与再生水灌溉有机结合是可再生资源开发利用与环境污染治理的重要途径.当前大多数研究主要关注生物质炭对土壤物化环境和作物产量的影响, 而对于再生水灌溉条件下施用生物质炭对微生物群落结构与组成重塑作用的研究以及病原菌抑制有效性的认识还非常有限.本文拟采用盆栽试验, 研究花生壳生物质炭、水稻秸秆生物质炭、稻壳生物质炭和小麦秸秆生物质炭对根际土壤细菌群落组成及病原菌丰度的影响, 探讨生物质炭种类对再生水灌溉根际土壤微生物群落结构及菌群丰度变化的影响因素, 以期为生物质炭在再生水灌溉农业生产中的应用与实践提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器LB液体和固体培养基(生工生物工程股份有限公司, 上海); pMDTM19-T Vector(TaKaRa公司, 大连); TB GreenTM Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus, TaKaRa公司, 大连); FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, 美国); E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit (Omega Bio-tek公司, 美国); E.Z.N.AⓇ Plasmid Mini Kit Spin Kit(Omega Bio-tek公司, 美国); 生物质炭购自河南省商丘市三利新能源有限公司：花生壳生物质炭(PBC)、水稻秸秆生物质炭(RBC)、稻壳生物质炭(RKBC)、小麦秸秆生物质炭(WBC), 制备温度500℃左右, 具体理化性质见表 1.
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表 1 供试生物质炭理化性质 Table 1 Physicochemical properties of the selected biochars |
1.2 试验方法 1.2.1 试验设计及样品采集
本试验用再生水取自某城市生活污水处理厂, 其采用A/O+连续砂滤池组合工艺, 处理后的出水水质符合《城镇污水处理厂污染物排放标准GB 18918-2002》一级A排放标准, 并符合国家《城市污水再生利用农田灌溉用水水质GB 20922-2007》和《农田灌溉水质标准GB 5084-2005》.
盆栽试验于中国农业科学院新乡农业水土环境野外科学观测试验站的人工气候室中进行, 供试作物为空心菜.人工气候室环境条件：温度30℃/18℃(光照/黑暗), 光照强度为300 μmol·(m2·s)-1, 光照时间12 h·d-1.试验设置6组处理, 分别为清水灌溉(PW_CK)、再生水灌溉(RW_CK)、再生水灌溉施加花生壳生物质炭(RW_PBC)、再生水灌溉施加水稻秸秆生物质炭(RW_RBC)、再生水灌溉施加稻壳生物质炭(RW_RKBC)、再生水灌溉施加小麦秸秆生物质炭(RW_WBC), 每组处理3个重复.花盆盛土3.5 kg, 土壤基肥施用量为尿素200 mg·kg-1、过磷酸钙150 mg·kg-1、氯化钾150 mg·kg-1, 生物质炭添加量按占土壤质量分数2%混合均匀.试验周期2个月, 每隔两天灌水100 mL.
本试验结束后, 参考李春格等[17]的方法, 用毛刷轻轻刷取黏附在根表面的土壤即为根际土壤, 收集于无菌自封袋中带回实验室, 经真空冷冻干燥后研磨过2 mm筛, 用于理化测试与微生物分析.
1.2.2 土壤理化性质测定土壤理化性质测定参考文献[18].土壤pH和电导率(EC)按水土比1:5混匀后静置过夜测定.有机质(OM)测定采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法.土壤总氮(TN)和总磷(TP)分别经过浓硫酸和高氯酸消煮后利用连续流动化学分析仪(Seal-AA3, 德国)测定.土壤重金属全量(铅Pb、镉Cd、铜Cu和锌Zn)经盐酸-硝酸-氢氟酸微波消解后利用原子吸收分光光度计测定(Shimadzu AA-6300, 日本).
1.2.3 基因组DNA提取和Illumina测序利用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, 美国)提取根际土壤基因组DNA.利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测(电压110 V, 30 min)DNA的提取效果, DNA浓度及纯度利用超微量分光光度计(SpectraMaxⓇ QuickDropTM, Molecular Devices公司, 美国)测定, 保存于-80℃冰箱待用.
采用Illumina MiSeq测序平台测定根际土壤细菌群落的组成和多样性.选用16S rRNA基因V3-V4区引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对各处理基因组DNA进行PCR扩增及后续的高通量测序[19]. PCR反应采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase进行, 每个反应体系中包括4 μL FastPfu Buffer (5×TransGen), 2 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1), 正反向引物各0.8 μL(5 μmol·L-1), 0.4 μL FastPfu Polymerase, 10 ng模板DNA, ddH2O补足至20 μL.反应于ABI GeneAmpⓇ 9700PCR扩增仪上进行, 反应条件如下：95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30个循环; 最后72℃延伸10 min, 10℃保持.利用AxyPrepDNA试剂盒(Axygen, 美国)对PCR产物目的条带进行切胶回收.基于Illumina MiSeq PE300测序平台, 利用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit构建PE文库进行双末端测序.
1.2.4 定量PCR检测利用门水平细菌菌群引物和病原菌特异性引物对根际基因组DNA进行PCR扩增, 引物信息见表 2.标准曲线质粒制备参照前期研究报道[10].根据质粒DNA浓度计算基因拷贝数, 将已知拷贝数的质粒DNA 10倍梯度稀释作为标准模板.定量PCR反应体系：10 μL TB GreenTM Premix Ex TaqTM (TliRNaseH Plus), 上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1), 模板2 μL, 加无菌ddH2O补齐至20 μL.具体扩增程序如下：95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 50~60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 40个循环.熔解曲线条件：以0.5℃·s-1温度递增速率从65~95℃.反应于CFX96 TouchTM荧光定量PCR检测系统上进行, 所有反应均设置3个重复, 以无菌ddH2O作为阴性对照, 每轮反应结束后样品与标准曲线的Ct值进行比较确定目标基因的初始拷贝数.
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表 2 用于定量PCR检测的引物 Table 2 Primers for quantitative PCR detection |
1.2.5 数据分析
根际土壤微生物高通量测序数据利用I-Sanger生信云平台分析(上海桑格信息技术有限公司). ①物种注释与评估：利用Usearch(Version 7.0 http://drive5.com/uparse/)划分97%以上相似性的OTU, 并通过mothur计算α多样性指数.利用R语言工具绘制稀疏曲线图; ②物种组成分析：采用QIIME平台(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)对97%相似水平的OTU代表序列进行不同的分类学分析, 使用Silva(Release 128 http://www.arb-silva.de)比对数据库分析各样本的群落组成, 利用R语言工具绘制Venn图; ③样本比较分析：PCoA(Principal co-ordinates analysis)即主坐标分析利用R语言PCoA统计分析和作图; ④环境因子关联分析：利用R语言vegan包中RDA分析和作图, 相关性Heatmap分析利用R(pheatmap package)语言作图.
各处理数据利用Excel 2007和Origin 8.0进行分析绘图, 利用Hem I热图软件对定量的病原菌丰度进行绘图, 采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比较检验各处理间差异的显著性(α=0.05).
2 结果与分析 2.1 土壤理化指标分析不同处理根际土壤理化性质如表 3所示.清水和再生水灌溉土壤的理化性质基本相同, 4种生物质炭的添加均显著增加土壤EC值、有机质和总氮含量(P < 0.05).添加稻壳生物质炭显著增加土壤pH和总磷含量, 而显著降低锌和镉含量; 水稻秸秆生物质炭显著增加土壤pH, 降低镉含量; 小麦秸秆生物质炭能够显著增加总磷和锌含量, 降低镉含量; 花生壳生物质炭显著增加铜和锌含量(P < 0.05).这表明由于不同来源生物质炭的结构性质存在较大差异, 对土壤环境质量造成不同程度的影响.
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表 3 不同处理根际土壤样品理化性质1) Table 3 Physicochemical characteristics of rhizosphere soil in different samples |
2.2 细菌群落结构与多样性分析
不同处理各样本抽平后的有效序列数为21 872. 18个根际土壤样本共获得4 724个OTUs, 将其进行物种分类统计包括：33个门、82个纲、225个目、406个科和797个属.各处理根际土壤细菌群落的α多样性指数如表 4所示.通过比较分析可以看出生物质炭处理显著增加了根际土壤细菌的丰富度和多样性.与对照相比, 添加水稻秸秆生物质炭(RW_RBC)显著增加了Sobs指数、Shannon指数和Chao1指数(P < 0.05), 表明这种生物质炭处理下的物种总数最高.花生壳生物质炭(RW_PBC)、稻壳生物质炭(RW_RKBC)和小麦秸秆生物质炭(RW_WBC)处理均使Simpson指数显著降低(P < 0.05), 表明群落多样性和丰富度较其他处理高.不同处理方式下用于估计群落中OTU数目的Ace指数和代表测序深度的覆盖度(Coverage)均无显著差异, 反映了本次测序结果能够代表所有样本中微生物的真实情况和一致性, 可以较为准确地描述样本的微生物群落信息.
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表 4 不同处理细菌α多样性指数 Table 4 Bacterial community α diversity indices for different samples |
各处理的根际土壤细菌在门分类水平和属分类水平的群落组成信息如图 1所示.门分类水平上, 各处理间细菌群落结构组成相似性较高, 主要优势菌群包括变形菌门(Proteobacteria, 38.53%~64.47%)、放线菌门(Actinobacteria, 8.55%~15.22%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 6.53%~12.46%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 7.35%~13.25%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 4.55%~10.98%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes, 2.13%~4.55%)、厚壁菌门(Firmicutes, 0.59%~4.31%), 这7个菌群相对丰度占根际土壤细菌群落的90%以上, 其中变形菌门(Proteobacteria)占比最高.根际土壤细菌群落组成变化对生物质炭种类的响应存在差异, 但整体趋势一致.添加生物质炭处理均降低了变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度, 尤其是γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的相对丰度表现出大幅度下降.添加生物质炭处理后拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度均有增加的趋势, 而厚壁菌门(Firmicutes)表现出下降趋势.属分类水平上, 丰度Top 37的优势属占总序列相对比例的50%~60%, 各处理间优势属均为假单胞菌属(Pseudomonas, 2.41%~21.31%)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera, 1.90%~4.68%)、节杆菌属(Arthrobacter, 3.15%~6.11%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas, 1.53%~5.99%)、气单胞菌属(Aeromonas, 0.36%~7.35%)、福格斯氏菌属(Vogesella, 1.53%~5.99%)和红色杆菌属(Erythrobacter, 1.53%~5.99%), 这些优势菌属的相对丰度在不同处理间存在较大差异. RW_RBC和RW_WBC相较于RW_RKBC和RW_PBC处理中假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度下降幅度更大.与添加生物质炭的对照相比, 生物质炭处理降低了莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、节杆菌属(Arthrobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)和福格斯氏菌属(Vogesella)的相对丰度, 而增加了红色杆菌属(Erythrobacter)的相对丰度.
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图 1 门水平和属水平根际土壤细菌群落组成相对丰度 Fig. 1 Histograms of the relative abundances of bacterial communities in the rhizosphere soil at the phylum and genus levels |
基于Bray_Curtis距离的PCoA研究不同种类生物质炭处理根际土壤的细菌群落组成的相似性和差异性. 图 2中不同形状图例分别代表对照及不同种类生物质炭处理的根际土壤样本, PC1轴和PC2轴对结果的解释度分别为26.01%和10.83%.结果表明, 不同种类生物质炭处理的根际土壤细菌群落组成更加相似, 与未经处理的细菌群落组成存在差异.这说明相较于灌溉水源, 生物质炭对根际土壤细菌群落组成有更大影响.
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图 2 不同处理根际土壤微生物PCoA图 Fig. 2 Principal coordinate analysis (PCoA) of bacterial communities in the rhizosphere of different samples |
通过RDA揭示不同处理根际土壤样本细菌属水平群落组成与不同环境因子之间的相关性(图 3).结果表明, 土壤EC值、有机质、总氮和重金属镉含量与根际土壤样本中细菌群落变化具有明显的相关性(P < 0.05), 说明这些环境因子是影响根际土壤细菌群落多样性和组成的重要驱动因素.
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①Pseudomonas; ②Aeromonas; ③Rheinheimera; ④Arthrobacter; ⑤Vogesella; ⑥Sphingomonas; ⑦norank_ f_Gemmatimonadaceae; ⑧Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium; ⑨unclassified_ f_Burkholderiaceae; ⑩Subgroup_10; ⑪ norank_ f_A4b; ⑫ Bdellovibrio; ⑬ norank_o_SBR1031; ⑭ norank_c_Subgroup_6; ⑮ norank_ f_Microscillaceae 图 3 不同处理菌群与环境因子的RDA Fig. 3 Redundancy analysis of bacterial communities and environmental factors in different samples |
通过相关性Heatmap图分析不同的环境因子对根际土壤细菌属水平群落组成的影响(图 4). Pseudomonas与EC(r=-0.567, P=0.014)、TN(r=-0.501, P=0.034)、TP(r=-0.478, P=0.045)呈负相关, 而与Pb(r=0.583, P=0.011)、Cd(r=0.652, P=0.003)呈正相关; Rheinheimera与OM和TN呈显著负相关关系, 与EC呈极显著相关; Sphingomonas和Erythrobacter与EC、OM和TN呈显著正相关关系; Aeromonas与OM、TN和TP呈显著负相关关系, 而与Pb、Cd呈显著正相关.依据Spearman相关系数与P-value将细菌群落与环境因子的相关性划分为4类. ClusterⅠ中所有菌属与pH、EC、OM、TN、TP和Zn呈显著或极显著负相关, 与Pb和Cd呈显著正相关; ClusterⅡ所有菌属与Zn呈显著正相关, 其他部分菌属与OM、TN、TP和Cu呈显著正相关; ClusterⅢ中Bdellovibrio和Paenarthrobacter与pH呈显著正相关, 其他几种norank菌属与OM、TN和TP呈显著正相关, 而与Pb和Cd呈显著负相关; ClusterⅣ中部分菌属与重金属含量呈负相关, 而Janibacter和norank_ f_Saprospiraceae分别与Zn、TP呈显著正相关.上述结果表明根际土壤细菌群落受土壤理化性质的影响, 这种差异与灌溉水源及添加生物质炭改善土壤质量有关.
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*表示0.01 < P ≤ 0.05, **表示0.001 < P≤0.01, ***表示P≤0.001 图 4 环境因子与细菌群落组成Spearman相关性热图 Fig. 4 Spearman rank correlation Heatmap used to study the environmental factors and bacterial community compositions |
选择分类(属)水平总丰度前40的物种进行物种相关性分析, 图 5(a)为单因素相关性网络, 根据物种与物种之间的相关关系绘制网络图, 用于反映样本中物种间的相互作用.属水平相关性网络图揭示了不同属之间具有显著的相互作用(红色连线表示正相关, 绿色连线表示负相关, 连线的粗细代表相关性系数的大小, 线的多少表示节点之间联系的密切程度). Proteobacteria和Actinobacteria与其他物种的相关性较密切, 而Firmicutes和Planctomycetes与其他物种的相关性较低. 40个菌属间相关性程度不同, 其中有127个呈正相关关系和108个负相关关系, Aeromonas分别与Pseudomonas和Vogesella呈最大正相关(r2=0.641, r2=0.797). 图 5(b)为双因素相关性网络, 根据物种与环境因子之间的相关关系绘制网络图, 用于反映样本中环境因子与物种间的相互作用.与相关性Heatmap分析结果一致, 属于Proteobacteria的Pseudomonas、Aeromonas、Vogesella、Devosia和Bdellovibrio与各种环境因子均呈显著正相关.
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(a)单因素相关性网络; (b)双因素相关性网络 图 5 物种相关性网络分析 Fig. 5 Species-level network analysis |
利用特异性引物对不同生物质炭处理下根际土壤中的门水平菌群、氮功能菌群和病原菌种属进行定量检测.从图 6中可以看出, 添加生物质炭对根际土壤细菌群落与功能菌群有一定的影响.再生水灌溉显著降低了β-Proteobacteria的丰度(P < 0.05), 添加生物质炭处理β-Proteobacteria的丰度有降低趋势, 但不显著.花生壳生物质炭(RW_PBC)和水稻秸秆生物质炭(RW_RBC)处理显著降低了γ-Proteobacteria的丰度(P < 0.05), 其他处理下的菌群变化均无显著差异.小麦秸秆生物质炭(RW_WBC)和稻壳生物质炭(RW_RKBC)处理下再生水灌溉根际土壤氨氧化古菌(AOA)的丰度显著降低(P < 0.05), 各种生物质炭处理未对氨氧化细菌(AOB)和固氮菌群产生明显影响.与清水灌溉相比, 再生水灌溉显著增加了E. coli的丰度, 而添加生物质炭(RW_PBC、RW_RBC和RW_RKBC)能够显著降低再生水灌溉E. coli的丰度. RW_PBC处理显著降低了Enterococcus faecium、Legionella spp.和Mycobacterium spp.丰度. RW_RKBC和RW_WBC处理下再生水灌溉根际土壤Pseudomonas syringae丰度显著降低, 而其他处理均无显著差异.因生物质炭种类的不同, 造成各类菌群丰度呈现差异变化, 但各处理间样本的细菌总数和真菌总数并未受灌溉水源和生物质炭的影响而产生显著变化, 表明根际菌群丰度在受外界环境压力条件下始终维持一定的动态平衡.
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*表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 6 不同处理间菌群数量与病原菌丰度变化热图 Fig. 6 Heatmap analysis of the abundances of bacterial communities and pathogens in different treatments |
与清水灌溉相比, 再生水灌溉并未对土壤理化性质造成不利影响.从表 3可以看出土壤理化性质的差异是由于生物质炭输入造成的, 而非灌溉水源.生物质炭具有改良土壤、促进植物生长、固碳减排、降低重金属及其他污染物生物有效性等作用, 在农业和环境领域应用广泛.生物质炭对根际土壤理化性质的影响及差异性取决于其种类和性质的不同.有研究表明生物炭添加到土壤中后, 形成了稳定的有机碳, 有利于土壤有机质的形成和积累, 这对稳定土壤有机碳库和提高土壤肥力有重要意义[34].相对于土壤中的养分来说, 尽管生物质炭本身养分含量较低, 但仍可在一定程度上补充土壤养分[35].生物质炭施入增加了土壤养分, 显著提高了有机质、总氮和总磷含量.添加稻壳生物质炭和水稻秸秆生物质炭处理均能显著增加再生水灌溉土壤pH和EC值.而已有研究表明再生水灌溉条件下添加小麦秸秆生物质炭并未引起土壤pH和EC值的显著变化, 但显著降低了土壤中重金属铜和镍的含量[8], 这与本研究中生物质炭对重金属的影响结果不一致, 可能是由于生物质炭种类和性质的差异造成的. Tu等[36]的研究表明土壤中氮磷含量的增加可以有效降低土壤中水溶性和可交换态Cd的含量, 可见添加生物质炭提高土壤养分含量对重金属的影响较大.生物质炭能够改变重金属在土壤中的形态, 具有稳定固化作用, 但随着土壤环境的改变, 被固化的重金属可能重新被释放, 对土壤造成二次污染.但改性处理可以增加生物质炭的比表面积以及官能团的种类与数量, 使生物质炭对水体或土壤中Cd的吸附具有良好的稳固性[37].已有研究报道, 呈碱性的生物炭施入土壤后可提高酸性土壤pH值, 并能够显著影响土壤中重金属的形态和迁移行为, 降低土壤中Pb和Cd的可提取态含量, 影响土壤重金属污染物的生物有效性[38, 39].也有报道指出, 小麦秸秆生物质炭降低碱性土壤中作物吸收Cd的量并非通过提高土壤pH和吸附能力实现的[40].王海波等[41]的研究认为生物质炭输入后能够使土壤重金属由有效态向无效态转化, 从而达到修复重金属污染土壤和降低作物累积的目的.不同原料来源、制备条件和施用量的生物质炭在农业生产实践中的适用性也是人们关注的研究热点.本研究中, RW_RBC、RW_RKBC和RW_WBC处理均能显著降低Cd含量, 而RW_PBC处理增加了Cu和Zn含量, 这表明尽管花生壳生物质炭对改善土壤肥力状况作用显著, 但其应用的潜在环境风险还有待进一步研究.
3.2 生物质炭对根际土壤细菌群落多样性及其动态变化的影响根际为根系周围、受根系生长影响的土体, 是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面[42].根际作为土壤微生物群体富集的微生境之一, 其微生物多样性不仅受植物种类、土壤类型及其相互作用关系的影响, 还受灌溉水源及水质的影响.再生水中的营养成分可以被微生物利用, 其用于灌溉会促进根际土壤中真菌、氨化细菌、反硝化细菌的繁殖[43].各处理根际土壤细菌群落组成以Proteobacteria为主, 其次为Actinobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Acidobacteria、Gemmatimonadetes和Firmicutes, 这与文献[44]的报道一致.细菌群落组成分析结果表明不同处理在门分类水平优势类群相同, 但相对丰度呈现差异, 其中Proteobacteria的α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria相对丰度占比最高.从灌溉水质来看, 物种差异性主要表现在属分类水平的菌群组成, 再生水灌溉增加了根际土壤Rheinheimera、Arthrobacter和Sphingomonas等菌属的相对丰度, 而降低了Aeromonas和Vogesella的相对丰度.由于生物质炭具有优良的吸附性能、高孔隙率和低成本等特点, 已被作为农业实践中常用的土壤改良剂.研究发现施用生物质炭有利于提高土壤微生物的物种丰富度, 促进微生物种类的均匀分布[45].与未添加生物质炭处理相比, 生物质炭增加了根际土壤微生物群落的多样性和丰富度, 但因生物质炭种类不同而呈现差异.相较于其他生物质炭处理, 花生壳生物质炭(RW_PBC)处理的细菌群落丰富度和多样性较低.生物质炭能够通过改变土壤养分状况直接或间接影响土壤微生物, 有研究表明生物质炭种类与用量均会对土壤微生物群落结构产生一定影响, 并且生物质炭的影响程度与土壤有机质含量密切相关[46]. β多样性分析表明清水与再生水灌溉下微生物群落组成具有相似性, 而与添加生物质炭处理的组间比较差异明显.细菌群落组成主要受土壤养分和重金属含量的影响, 在添加生物质炭条件下, 土壤理化因子是微生物群落结构动态变化的主要驱动因素, 这表明生物质炭对根际微生物多样性具有重要的调控作用.生物质炭可通过自身性质和改变土壤理化性质来影响土壤微生物群落结构与功能多样性[47, 48].本研究中土壤有机质、总氮、总磷和EC值是生物质炭添加对微生物群落结构影响的关键环境因子.添加不同种类生物质炭处理均会显著降低Pseudomonas和Rheinheimera的相对丰度, 而Sphingomonas和norank_Subgroup_6相对丰度呈增加趋势. Pseudomonas菌属包括多种人类条件致病菌, 也是植物病原细菌中一个重要菌群.前期研究表明, 再生水灌溉会显著增加根际土壤Pseudomonas丰度[10].相关性Heatmap图分析结果表明, 根际土壤细菌群落受土壤特性的影响, 不同细菌菌属的影响程度因添加生物质炭种类不同而存在差异. Pseudomonas相对丰度与Cd含量呈显著相关, 生物质炭处理(除RW_PBC处理)均显著降低了两者的量. Sphingomonas是一类具有很强代谢能力的降解菌, 在环境污染治理方面研究应用广泛.物种相关性网络分析反映出不同分类水平核心菌群之间的共存关系, 并获取了优势菌属与环境因子的关联, 其中Arthrobacter、Lysobacter、Marmoricola和Nocardioides等关键菌属与文献报道一致[49].由此可见, 在根际细菌群落组成中, 即使添加生物质炭会增加细菌种群的丰富度和多样性, 而一些优势菌群与其他菌群也始终维持着密切的相关性.张秀等[50]的研究表明, 重金属Cd胁迫下土壤微生物的代谢功能多样性明显降低, 而添加生物质炭可转变土壤微生物的代谢模式, 从而缓解并改善土壤微生物群落功能多样性.重金属浓度增加产生的非生物胁迫导致土壤微生物生物量碳和氮含量降低, 生物质炭处理提高了土壤碳源利用率和微生物群落功能多样性, 这主要归因于生物质炭降低重金属的生物可利用性, 并且通过提高土壤持水能力、pH等对微生物种群的生长、繁殖和活性产生积极影响[51].
3.3 生物质炭对根际土壤中功能菌和病原菌的影响蔡九茂等[52]的研究发现施用生物质炭对设施农业土壤硝态氮含量及其转化的关键微生物影响较大, 生物质炭处理降低了根际土壤AOA基因拷贝数, 这与本文的部分研究结果一致.生物质炭添加对AOB数量影响不明显, 但会降低AOA菌群丰度, 原因可能是AOA菌群更适宜在酸性环境中生长, 而生物质炭的输入提高了土壤pH值[53].添加生物质炭后, 根际土壤的固氮菌丰度并无显著增加, 这可能与生物质炭的添加量及作用时间有关[54].多数研究集中于考察生物炭对控制植物病原体的影响[55, 56], 而对人类条件致病菌的抑制效率研究相对较少.本文研究了4种不同原料来源的生物质炭对再生水灌溉根际土壤病原菌丰度变化的影响.生物质炭对病原菌的影响因其种类不同而差异明显, 添加花生壳生物质炭对病原菌谱影响较其他处理更广.以竹子为原料制备的生物质炭应用于农业土壤中可以降低人类致病菌的传播[13]. Novak等[57]的研究表明, 由于生物质炭添加增加了对细菌的吸附作用, 导致E. coli在土壤中的运移能力降低.小麦秸秆生物质炭对土壤-作物病原菌的影响随灌溉水源与灌溉时间而变化, 表明根际土壤病原菌丰度与灌溉水源、生物质炭具有更强的相关性[11].生物质炭的多孔结构为各种微生物在其孔隙形成活性生物膜提供了生态位, 研究发现生物质炭在水中吸附E. coli的效率与其颗粒大小有关[58]. Gu等[12]的研究发现生物质炭可有效吸附植物根系分泌物, 通过减少根际微生物对营养物质的可利用量, 增强根际土壤中病原菌的的趋化能力, 从而降低了病原菌的群集运动能力和根际定殖能力.这些结果表明, 生物质炭的应用可能是减少人类条件致病菌与植物病原菌在根际定殖的一种潜在途径.目前尚不清楚生物质炭是如何影响病原菌吸附以及病原菌对根系分泌物可利用程度, 生物质炭的作用机制与效应是否取决于其自身性质及颗粒大小仍需进一步探索.
4 结论(1) 尽管再生水灌溉未对根际土壤质量造成不利影响, 但生物质炭仍不失为改良土壤的一种有效手段.生物质炭能够显著影响根际土壤的pH、EC、有机质、总氮、总磷以及重金属含量, 但由于生物质炭制备原料和条件以及土壤类型的不同, 使其作用效果的差异较大.
(2) 灌溉水源的不同并未导致细菌群落多样性和丰富度呈现显著差异, 而不同生物质炭处理对再生水灌溉根际土壤细菌群落多样性和丰富度的作用效果较为明显.根际土壤细菌群落结构在门、属分类水平上类似, 优势菌群的种类没有发生改变.门分类水平优势菌群为Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes和Acidobacteria, 共同优势菌属包括Pseudomonas、Rheinheimera、Arthrobacter、Sphingomonas和Aeromonas, 其相对丰度因生物质炭种类不同而存在差异.
(3) 不同种类生物质炭对根际土壤理化性质的影响程度不同, 其中EC、有机质、总氮和Cd含量变化是导致再生水灌溉根际土壤细菌群落结构及其多样性变化的主要驱动因子.
(4) 生物质炭的添加不易扰动菌群的稳定性, 仅水稻秸秆生物质炭(RW_RBC)和花生壳生物质炭(RW_PBC)处理下γ-Proteobacteria丰度显著降低. 4种生物质炭对病原菌丰度均有不同程度的影响, 其中花生壳生物质炭(RW_PBC)显著降低Escherichia coli、Enterococcus faecium、Legionella spp.和Mycobacterium spp.的丰度.
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