2020, Vol. 41
2. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085
, XIA Song1 , GUI Shuang-lin1 , FU Jia-qi1 , WU Jiu-jiu1 , XIONG Ji-hai1 , WEI Yuan-song1,2
2. Laboratory of Water Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)是在厌氧条件下, 由厌氧氨氧化菌(AnAOB)以NH4+-N和NO2--N为基质, 生成N2和NO3--N的生物过程.厌氧氨氧化因其高效、低耗的特征受到广泛关注[1, 2], 被认为具有广阔的应用前景[3].然而作为关键功能菌, 厌氧氨氧化细菌(AnAOB)生长缓慢[4, 5], 易受环境变化的影响, 从而限制了基于ANAMMOX工艺的推广应用[6, 7].厌氧氨氧化工艺高效脱氮的本质是微生物群落的协同作用, 微生物群落是功能菌和伴生菌的集聚体.通过微生物群落优化, 可以调控废水生物处理系统的性能[8].然而, 微生物群落数据不足, 尤其是群落结构、功能和生长动力学特征等认识不深, 是微生物群落优化的主要阻碍.因此, 全面了解厌氧氨氧化工艺微生物群落特征、演变规律及微生物间的相互作用关系, 对阐明厌氧氨氧化工艺快速启动和高效稳定运行背后的生物学机制至关重要.
当前, 随着分子生物学技术的普及, 厌氧氨氧化反应器微生物群落分析得到快速发展[9].厌氧氨氧化启动过程中, 微生物群落发生显著变化, 浮霉菌门丰度显著增加.微生物群落随着反应器脱氮效率的变化而发生变化.有研究表明, 厌氧氨氧化成功启动后, 浮霉菌门丰度显著高于变形菌门[10, 11], 但其他研究认为变形菌门丰度更高[12, 13].同时, 有研究对不同反应器类型、不同水质条件、不同接种物及不同运行条件下, 厌氧氨氧化反应器的微生物群落结构特征及差异进行分析; Yang等[14]的研究分析了反应器运行性能与微生物群落的关系.上述研究为厌氧氨氧化反应器微生物群落认识及理解其脱氮的生物学机制提供了基础数据.但已有研究主要关注氮素转化功能菌群的特征及其与脱氮效率间的变化关系, 对于伴生菌、微生物群落多样性及微生物间的相互作用关系仍不清楚.
本研究基于SBR反应器, 进行厌氧氨氧化菌富集培养, 利用高通量测序技术, 分析了富集培养过程微生物群落组成、结构及多样性差异, 以揭示微生物群落在厌氧氨氧化富集培养过程中的演变规律, 并探讨微生物类群的相互作用关系, 以期为深入理解厌氧氨氧化菌富集培养过程的微生物群落特征提供基础数据.
1 材料与方法 1.1 实验装置及接种污泥本实验采用的ASBR反应器, 装置如图 1所示, 由有机玻璃制成, 有效容积5 L; 反应器内置pH电极、DO电极、温度传感器和搅拌桨; 侧壁设置出水口和采样口, 顶部设有排气口, 底部设有排泥口; 外置水浴层, 并用铝箔包裹避光; 通过PLC控制进出水及搅拌.
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图 1 反应器示意 Fig. 1 Schematic diagram of reactor |
反应器接种污泥为南昌市某污水处理厂二沉池回流污泥和实验室稳定运行的SBR反应器厌氧氨氧化污泥, 按体积比2:1进行接种, 接种后其MLSS和VSS分别为8.406 g·L-1和5.356 g·L-1.
1.2 实验用水及运行条件实验用水为人工配制合成的模拟废水, 其中NH4+-N和NO2--N分别由NH4Cl和NaNO2按需提供, 其他组分包括：NaHCO3 500 mg·L-1、KH2PO4 25 mg·L-1、MgSO4·7H2O 300 mg·L-1、CaCl2 120 mg·L-1以及微量元素浓缩液Ⅰ、Ⅱ各1 mL·L-1, 微量元素浓缩液参照文献[15]配制.
反应器内控制温度为35℃, 采用间歇方式运行, 每个周期进水7 min, 运行11 h, 沉淀50 min, 出水3 min, 排水比50%, 搅拌速度为70 r·min-1, 反应器HRT设定为24 h.
1.3 水质测试方法及污泥样品采集反应器运行过程中每两天取进出水, 水样经0.45 μm滤纸过滤, 用纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法, 分别测定NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度.
反应器运行过程中, 分别于第0(S1)、30(S2)、60(S3)、120(S4)和180 d(S5)进行污泥样品采集, 其中第0 d和120 d进行3次重复采样; 其余进行4次重复样品采集, 共采集18个样品.采集的污泥样品经离心后, 于-80℃冰箱保存待用.
1.4 DNA提取、基因扩增及高通量测序污泥总DNA提取采用FastDNA® SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, U.S)试剂盒, 具体步骤按操作说明进行; 提取得到的样品总DNA, 利用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测, 经SMA4000超微量分光光度计(Merinton, USA)测定其浓度、纯度后, 再将提取的总DNA分成3份放置于-80℃冰箱保存待用.
针对细菌和古菌16S rRNA基因V4区, 使用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增. PCR反应体系：10×Ex Taq buffer 4 μL, dNTPs 2 μL, BSA 0.2 μL, 2.5 U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL, 引物各1 μL, DNA模板1 μL, 灭菌超纯水补足体系至25 μL; PCR反应条件：预变性温度94℃(2 min); 变性温度94℃(30 s), 退火温度53℃(30 s), 延伸温度72℃(45 s), 25次循环后72℃终止延伸10 min.
PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶检测, 使用E.Z.N.A.TM公司的Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒进行纯化, 并用QuantiFluorTM-ST进行定量分析后, 构建MiSeq文库, 利用Illumina MiSeq测序平台完成测序.本研究测序工作交由测序公司完成.
1.5 高通量数据处理与统计分析高通量测序原始数据利用FastQC进行初始质量控制, 后续处理基于QIIME 2 2020.2[16]实现.首先, 生成清单文件(manifest)用qiime tools import导入数据; 用q2-demux对序列进行样本拆分; 随后使用DADA2进行质量过滤和去噪, 输出“扩增序列变体”(ASV)的特征表(FeatureTable[Frequency])和特征序列(FeatureData[Sequence]); 使用经过预训练的Naive Bayes分类器, 并由q2-feature-classifier对FeatureData[Sequence]的序列进行物分类种注释.接下来使用q2-phylogeny插件mafft进行序列比对并用q2-phylogeny插件fasttree2构建生成系统发育树; 应用core-metrics-phylogenetic方法, 该方法将特征表(FeatureTable[Frequency])抽平到指定的测序深度, 通过q2-diversity计算α和β多样性指数, 包括：香农(Shannon's)多样性指数、Observed OTUs、Faith's系统发育多样性、辛普森(Simpson)多样性指数和Bray-Curtis距离.
基于不同富集培养时间(S1、S2、S3、S4和S5)相对丰度前100的物种, 构建微生物物种网络; 利用Cytoscape(3.7.1)软件中CoNet插件进行微生物群落网络关系分析; 选取5种相关计算方法(Spearman相关性, Pearson相关性, Kullback-Leibler dissimilarity, Bray-Curtis dissimilarity和mutual information), 并用Brown方法对物种方法的P值进行整合, 保留显著相关(P < 0.05)的数据进行后续分析, 之后选取Benjamini-Hochberg方法进行多重检验获得网络相关性; 将网络相关性数据导入Gephi软件(0.9.2), 利用Frucherman Reingold算法进行布局, 实现网络图可视化; 利用Cytoscape软件中Network Analyzer插件进行网络拓扑性质分析.
对不同分组数据门水平相对丰度和α多样性指数进行两两Student-t检验; 基于Bray-Curtis距离用主坐标分析(principal coordinates analysis, PCoA)比较不同分组样品间群落β多样性差异, 并用非参数多元方差分析(Adonis)进行差异检验; 本文所有统计分析及做图均基于R(3.5.1)不同程序包实现.
2 结果与讨论 2.1 反应器脱氮性能厌氧氨氧化菌富集培养过程中, 反应器运行特征如图 2.依据氮素转化特征, 将整个富集培养过程归为：菌体自溶期、活性迟滞期、活性提高期和稳定运行期, 这与已有研究结果一致.反应器运行第1~8 d, 出水NH4+-N浓度高于进水, 同时, 出水NO2--N浓度从零逐渐升高, 且没有NO3--N生成.反应器接种后, 微生物未适应新环境, 进而导致微生物菌体发生自溶[17, 18], 释放出有机物和NH4+-N.反硝化菌利用菌体自溶释放的有机物将NO2--N去除, 使得出水NO2--N浓度为零[19].随着培养时间的增长, 微生物逐步适应环境, 菌体自溶阶段结束, 反硝化作用明显减弱, 因此出水NO2--N浓度升高.
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图 2 厌氧氨氧化菌培养过程反应器脱氮性能 Fig. 2 Nitrogen removal performance of reactors during ANAMMOX bacterial culturing |
第10~16 d, 出水NH4+-N浓度降低, 并呈现出出水NO2--N浓度同步降低, 但整个过程去除率仍然维持在较低水平, NH4+-N平均去除率仅为19.5%, NO2--N平均去除率为16.7%.说明微生物逐渐适应环境, 反应器开始出现厌氧氨氧化活性[20].第18 d开始, NH4+-N和NO2--N呈现较强的同步去除趋势, 且去除率逐步提升, 表明厌氧氨氧化开始逐步占据主导地位[21], 厌氧氨氧化菌活性逐渐增强[22]; 到第60 d, NH4+-N去除率达到97.4%, NO2--N去除率达到98.5%, 反应器脱氮效率得到显著提升, 此时厌氧氨氧化菌群得到有效富集, 并且成为反应器的优势菌群[23, 24].
第60~180 d, 反应器进入稳定运行阶段, NH4+-N和NO2--N平均出水浓度分别为2.28 mg·L-1和4.81 mg·L-1; 平均去除率分别为97.6%和95.4%, 总氮平均去除率为84.9%, 且整体运行较为稳定. NH4+-N:NO2--N:NO3--N为1:(1.2±0.05):(0.25±0.01)与理论值(1:1.32:0.26)接近[25], 表明厌氧氨氧化反应器已成功启动.
2.2 微生物群落组成特征通过对18个样品进行高通量测序, 共获得1 056 225条高质量序列, 每个样品33 183~74 828条, 平均58 679条.所有样品共获得47个门、111个纲、277个目、472个科、863个属和1 543个种.优势菌门(相对丰度>5%)为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和放线菌门(Actinobacteria)(图 3).与已有研究相比, 虽然反应器运行条件、运行方式等不同, 但优势菌群门水平组成相似[24, 26~28].随反应器脱氮性能逐渐稳定提高, 厌氧氨氧化菌所属的浮霉菌门相对丰度不断升高, 接种时浮霉菌门相对丰度只有3.96%, 到180 d达到31.06%.同时, 厌氧异养菌有关的拟杆菌门相对丰度呈下降趋势, 且与氮素转化相关的功能菌所属主要菌群(变形菌门和浮霉菌门)相对丰度占细菌总量的49.69%, 因此反应器实现了厌氧氨氧化菌富集的同时也拥有较好的脱氮效果[28].
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图 3 门水平相对丰度 Fig. 3 Relative abundance at phylum level |
对富集培养过程不同时间微生物群落(丰度排名前10的菌门和属)对比分析发现(图 4), 浮霉菌门、放线菌门、装甲菌门和匿杆菌门(Latescibacteria)相对丰度存在显著差异(P < 0.05), 属水平上norank_ f_PHOS-HE36、candidatus Brocadia、Limnobacter、unclassified_o_Fimbriimonadales、Ignavibacterium和norank_ f_Desulfarculaceae的相对丰度存在显著差异(P < 0.05).一般而言, 氮素转化功能菌群(包括氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化菌和反硝化菌)隶属于拟杆菌门[29, 30], 而拟杆菌门的某些类群也具有反硝化功能[31], 它们的相对丰度在整个培养过程中呈显著下降趋势; 绿弯菌门等丝状菌被认为在污泥体系中扮演支撑角色[32], 起骨架和载体作用的重要伴生功能菌, 它们的相对丰度在整个培养过程中未出现显著变化.
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*表示P < 0.05; **表示P < 0.01 图 4 富集培养过程微生物群落组成差异 Fig. 4 Difference in microbial community composition during the culturing process |
Limnobacter被认为可以缓冲外界环境对厌氧氨氧化菌的影响[33], 而Ignavibacterium则是厌氧氨氧化系统常见的菌属[34], 具有反硝化功能.值得注意的是Candidatus Brocadia的相对丰度, 在第180 d相比于其他时间显著提升, 这可能是导致浮霉菌门丰度显著增加的主要原因, 也是厌氧氨氧化菌完成富集及反应器脱氮效果提升的关键. Candidatus Brocadia相对丰度从1.42%增长到24.66%, 是反应器中富集到的主要厌氧氨氧化菌.实验室反应器中常见的厌氧氨氧化菌为Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia[11, 27, 28, 35], 他们对基质的适应能力不同[36], 相比而言, 前者对基质亲和力差但增殖速率高, 后者不但能利用低浓度亚硝态氮而且对亚硝态氮的抑制更耐受[36~38].虽然厌氧氨氧化菌富集培养过程微生物群落优势菌群组成相似, 但相对丰度存在显著差异, 整个过程是目标菌群不断增殖而其他伴生菌群不生长或衰退的过程.
韦恩(Venn)图可以用来清晰且直观地表示不同分组间群落物种数目的异同情况, 富集培养过程不同时间微生物群落共有和特有物种(ASV)如图 5所示. 5个不同时间共有ASV 792个, 其中S1、S2、S3、S4和S5分别有特有ASV 65、437、117、73和65个.随着富集培养过程, 不同时间特有种的数量先急剧增加后逐渐减少, 说明某些微生物类群短暂出现, 但并不能适应反应器运行条件长期伴生于厌氧氨氧化系统.由此推断, 反应器接种后的一段时间内, 由于菌体自溶产生的某些物质或开始的低浓度基质导致稀有种(相对丰度 < 0.1%)的大量出现.
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图 5 基于ASV的微生物群落韦恩图 Fig. 5 Venn diagram of microbial communities based on ASV |
选择Sobs指数、Shannon指数、Simpson指数和PD指数, 反映富集培养过程微生物群落多样性特征.由图 6可知, 富集培养过程不同时间, 微生物群落多样性呈现先升高后降低的趋势, 且存在显著差异(P < 0.05).可能原因是随着厌氧氨氧化菌的逐渐富集, 不适应厌氧氨氧化系统环境的物种逐渐被淘汰, 系统微生物群落多样性减少. Wang等[39]的研究发现, 部分亚硝化-厌氧氨氧化系统硝酸盐累积及恢复过程中, 微生物群落多样性呈现先增加后减小趋势.同时, 需要关注的是接种运行第30 d(S2), 微生物群落多样性指数显著高于其它时间, 说明这段时间出现适应不同环境的微生物群落共存的情况.这与已有的研究结果不同, 何承兴等[40]的研究发现, 厌氧氨氧化启动过程中微生物多样性迅速降低; 曹雁等[41]的研究认为相比于富集阶段, 厌氧氨氧化反应器稳定运行阶段微生物群落多样性较高.然而, 姜滢等[28]的研究认为启动初期厌氧氨氧化颗粒污泥的物种多样性降低, 随着培养时间增加群落多样性略有增加.笔者发现, 上述研究取样主要集中于接种期和运行稳定期, 没有对整个过程进行连续采样, 因此造成上述不同结果的原因可能是取样时间节点不同所致.推测认为, 随着富集培养时间的延长, 反应器内厌氧氨氧化菌成为优势菌群, 相对丰度逐渐提高, 其它菌群停止生长或被淘汰, 因此系统中形成了一个相对单一但稳定的微生物群落.
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*表示P < 0.05;零*表示P < 0.01; ***表示P < 0.001 图 6 富集过程微生物群落α多样性指数 Fig. 6 The α diversity indices of microbial community during the enrichment process |
基于Bray-Curtis距离对富集培养过程不同时间微生物群落数据进行柱坐标分析(PCoA), 如图 7所示, 结果表明, 第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为29.48%和15.06%.不同时间样品在空间上呈现出显著的分异特征, 说明不同时间的微生物群落组间差异远大于组内差异.而微生物群落非参数多元方差分析(Adonis)也表明, 不同时间微生物群落之间存在显著差异(R=0.567 2, P < 0.01), 微生物群落β多样性在富集培养过程发生显著变化.
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图 7 富集培养过程不同时间微生物群落PCoA图 Fig. 7 PCoA diagram of microbial community under different phases during culturing process |
有研究表明, 土壤微生物群落的共生模式可以从新的视角理解潜在的微生物相互作用关系, 并揭示群落物种的空间生态位[42].本文基于厌氧氨氧化菌富集培养过程不同时间, 构建了5个微生物群落相互作用关键网络(图 8). S1共获得99个物种节点, 1 825个显著相关关系(边); S2共获得96个物种节点, 618个显著相关关系; S3共获得98个物种节点, 558个显著相关关系; S4共获得98个物种节点, 1 708个显著相关关系; S5共获得92个物种节点, 615个显著相关关系(表 1).这些网络关系显示了不同微生物类群间的潜在交互作用.每一个物种在图中显示为一个节点, 每个节点与其他节点的边数量水平称为度, 度越强说明相互关系越强. S1中每个节点的度分布为17~48; S2中每个节点的度分布为2~23; S3中每个节点的度分布为1~21; S4中每个节点的度分布为19~44; S5中每个节点的度分布为1~25, 并且相比于S1、S2、S4, S3和S5网络的聚类系数较低, 说明富集培养初期微生物关联性更紧密.同时, S1网络密度为0.188, 分别比S2、S3、S4和S5高0.12、0.129、0.008和0.115, 说明富集培养过程导致微生物间的关联作用变弱, 但相比富集培养中期而言后期的微生物关联性稍有增强.虽然富集培养后期微生物网络关联作用关系有所减弱, 但是浮霉菌门的相关类群微生物成为网络中的主要节点.
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图中节点代表物种, 节点大小表示物种丰度，不同颜色代表所属的门; 边代表物种间的相互关系，边的颜色代表正相关或负相关 图 8 不同培养阶段微生物网络 Fig. 8 Microbiome networks under different culturing stages |
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表 1 每个网络的拓扑学指数 Table 1 Topological indices of each network |
3 结论
(1) 利用ASBR接种二沉池回流污泥和厌氧氨氧化污泥的混合泥, 通过逐步提高进水负荷实现厌氧氨氧化菌富集培养, 稳定运行期间NH4+-N、NO2--N及总氮平均去除率分别为97.6%、95.4%及84.9%.
(2) 富集培养过程不同时间, 微生物群落优势菌门都为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和放线菌门(Actinobacteria), 没有发生显著变化, 但相对丰度呈现显著差异(P < 0.05); Candidatus Brocadia作为富集培养到的厌氧氨氧化菌, 相对丰度从1.42%增长到24.66%.
(3) 富集培养过程不同时间, 微生物群落α的多样性存在显著差异(P < 0.05);微生物群落β多样性在不同培养时间呈现明显空间分异, 且差异显著(Adonis：R=0.5672, P < 0.01).
(4) 富集培养过程不同时间, 微生物物种网络关系发生变化; 虽然整体的微生物类群间相互作用关系减弱, 但与浮霉菌门相关的微生物关联性变得更密切.
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