谷子(Setaria italica)又称粟, 禾本科狗尾草属, 一年生草本植物.据FAO统计, 我国是世界上谷子的集中种植国, 种植面积为世界总种植面积的80%.在我国, 谷子主要分布于淮河以北地区, 宁夏也有种植, 主要分布在盐池县、同心县和海原县等半干旱区^[1].有研究显示, 谷子的果实营养丰富, 含有人体必需氨基酸和抵抗某些化学致癌物的维生素E等, 具有良好的营养保健作用, 因此深受人们的喜爱^[2].文献[3]中有记载：谷子忌连作, 需要年年换茬, 以此来避免连作障碍的发生.目前, 受杂粮热的影响, 市场对谷子的需求极其旺盛, 进而导致谷子连作现象频发.

有研究显示, 连作障碍发生的重要因素是土壤根际微生态系统的失衡.连作栽培对土壤细菌及固氮菌等均有抑制作用, 而对真菌却有着促进作用^{[4, 5]}, 导致土壤由高肥力‘细菌型’向低肥力‘真菌型’转换^{[6, 7]}; 连作后土壤中原有的优势属的线虫群落降低, 而以植物寄生线虫为优势属的线虫开始破坏寄主植物, 致使土壤不利于作物生长^[8].由此可见, 致使作物连作障碍的主要因素是真菌病害及线虫病害, 因此, 研究土壤真菌群落的变化特征对缓解连作障碍具有重要意义.冯翠娥等^[9]对硒砂瓜连作下土壤真菌群落结构进行研究, 发现随着连作时间的增加, 土壤真菌多样性和丰富度均呈先增加后减少的趋势, 且真菌群落结构组成发生了较大变化.吴宏亮等^[10]的研究发现, 与连作相比, 轮作提高了土壤微生物多样性指数, 增加了土壤有益微生物的比例.科学合理地轮作可以有效缓解连作障碍^[11].鉴于此, 本文以真菌为研究对象, 应用高通量测序技术研究了不同轮作模式对根际土壤养分、真菌多样性及群落结构组成的影响, 通过较深层次上探索谷子连作障碍的形成机制, 以期为采取轮作措施减轻谷子连作障碍提供实践依据, 并为半干旱区农田土壤生态环境的可持续发展和谷子产业可持续健康发展提供理论基础.

本试验地位于宁夏吴忠市同心县王团镇(N36°51′42″, E105°59′27″).位于宁夏中部干旱带, 属中温带干旱大陆性气候, 干旱少雨, 年降水量150~300 mm, 主要集中在7、8和9月, 年际变幅大.年蒸发量在2 325 mm左右, 年平均气温8.6℃, ≥10℃的积温约3 000℃, 无霜期120~218 d.试验地土壤为砂壤土, 前茬为谷子.基础肥力为, pH：8.76, 有机质(OM)：12.66 g·kg^-1, 全氮(TN)：0.66 g·kg^-1, 速效磷(AP)：1.00 mg·kg^-1, 速效钾(AK)：440.39 mg·kg^-1.

供试材料谷子(Setaria italica)品种为“豫谷18号”, 大豆(Glycine max)品种为“宁黑1号”, 藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)品种为“静藜1号”, 籽粒苋(Amaranthus hybridus)品种为“旱雷神”.

本试验共设置4个处理, 分别为轮作大豆(MRG)、轮作籽粒苋(MRA)和轮作藜麦(MRQ), 以连作谷子为对照(CK).每个处理设置5个重复, 随机区组排列, 每小区长8 m, 宽3.2 m, 面积为25.6 m², 小区间用田埂进行分割, 不同小区的土壤肥力及管理方式相同.

于2018年10月作物成熟期采集土壤样品, 五点法取样.取样步骤：首先去除地表约5 cm厚的土壤, 用铁锹挖取作物的完整根部, 先轻轻抖落不含根系的大块土壤, 然后用刷子刷下附着在根毛上土壤, 将取得的土样混匀后分成2份, 一份放置于阴凉通风处自然风干, 并过筛用于土壤养分的测定, 一份鲜样保存于-80℃保存, 用于土壤微生物的测定.

PCR扩增仪, ABI公司; 酶标仪, BioTek公司; 电泳仪, 北京六一公司; 凝胶成像系统, 北京百晶公司; Q5^® High-Fidelity DNA Polymerase, NEB公司; Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit、Agarose和TAE, Invitrogen公司; Marker, Takara公司.

土壤pH采用pH计法(电位)测定; 土壤电导率采用电导率仪测定; 土壤有机质含量采用重铬酸钾法测定; 土壤全氮采用凯氏定氮法测定; 土壤全钾采用火焰光度法测定; 土壤全磷采用氢氧化钠消煮-钼锑抗比色法测定; 土壤硝态氮采用紫外分光光度法测定; 土壤铵态氮采用硫酸钾浸提-靛酚蓝比色法测定; 土壤速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定; 土壤速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定^[12].

采用美国MP公司的快速DNA旋转提取试剂盒提取土壤总DNA, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量, 用紫外分光光度法进行定量分析.按指定测序区域, 使用带有Barcode的特异引物, 对真菌ITS区进行PCR扩增, 引物为5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′.PCR扩增利用ABI公司2720型PCR扩增仪, 采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶, 反应体系如下：5 μL的反应缓冲液(5×5), 5 μL的高保真GC缓冲液(5倍), 0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶(5 U·μL^-1), 2 μL(2.5 mmol)dNTP, 1 μL(10 μmol)正向引物, 1 μL(10 μmol)反向引物, 2 μL DNA模板和8.75 μL ddH₂O.PCR扩增参数为：初始变性2 min(98℃), 27个循环(98℃ 15 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 72℃ 5 min), 然后10℃保存.用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测, 然后切胶回收目标片段, 回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒.此过程委托上海派森诺股份有限公司完成.

使用QIIME软件^[13]分析真菌OTU, 并绘制稀疏曲线(Rarefaction curve)、计算土壤真菌α多样性指数(Simpson、Shannon、Chao1和ACE指数).使用R语言, 对相对丰度>1%的真菌属进行聚类分析并绘制热图.使用R语言, 基于欧氏距离的主成分分析(principal component analysis, PCA)检验不同处理对土壤真菌群落的影响.用Pearson相关分析检验土壤优势真菌属与土壤养分之间的相关性.使用Canoco 4.5软件对土壤养分和真菌多样性进行主成分分析(PCA).使用Microsoft Excel 2010对土壤养分和多样性指数数据进行处理, 并用SPSS 20.0统计软件进行方差分析(one-way analysis)和多重比较(Duncan新复极差法), 显著性水平设为P < 0.05.

由表 1可知, 不同处理的土壤pH发生了改变, 轮作籽粒苋和藜麦处理显著低于对照, 且各处理土壤均处于碱性土壤的状态.轮作大豆和籽粒苋处理的土壤电导率、硝态氮、铵态氮含量均显著低于对照, 分别比对照低34.25%和39.73%、91.54%和35.24%、22.85%和28.96%.轮作处理的土壤全氮含量显著高于对照(P=0.007 9), 分别比对照高7.9%、9.26%和13.2%, 轮作可以提高土壤全氮含量.轮作藜麦处理的土壤全钾和全磷含量均显著高于对照(P=0.006 7, P=0.000 6), 分别比对照高253.05%和80.36%.轮作藜麦处理的土壤速效钾含量高于其他处理, 比对照提高5.48%, 轮作籽粒苋处理的含量最低, 比对照降低28.92%.轮作大豆处理的土壤速磷含量显著高于其他处理, 比对照提高63.0%.轮作处理的土壤有机质含量均高于对照, 其中轮作籽粒苋处理最高, 比对照提高25.36%.

表 1 (Table 1)

表 1 不同轮作模式下的土壤养分含量1) Table 1 Contents of soil nutrients under the different rotation patterns 处理 pH EC/S·m-1 TN/g·kg-1 TK/g·kg-1 TP/g·kg-1 NO3--N/mg·kg-1 NH4+-N/mg·kg-1 AK/mg·kg-1 AP/mg·kg-1 OM/g·kg-1 CK 9.01±0.02a 0.15±0.005a 0.70±0.02b 1.01±0.12c 0.012±0.001b 1.63±0.01a 0.13±0.004a 662.58±40.90a 1.26±0.19b 11.67±0.34b MRG 9.00±0.01a 0.10±0.002b 0.75±0.00a 1.52±0.25bc 0.014±0.002b 0.14±0.00c 0.10±0.005b 497.54±33.25b 2.06±0.11a 13.58±0.86ab MRA 8.83±0.02b 0.09±0.004b 0.76±0.01a 2.76±0.45ab 0.020±0.001a 1.06±0.04b 0.09±0.003b 470.98±27.34b 1.04±0.06b 14.62±1.17a MRQ 8.84±0.03b 0.14±0.005a 0.79±0.02a 3.58±0.68a 0.022±0.002a 1.65±0.04a 0.13±0.015a 698.90±29.37a 1.13±0.15b 13.21±0.47ab 1)同列数据后不同字母表示差异显著(P < 0.05); EC表示电导率, TN表示全氮, TK表示全钾, TP表示全磷, NO3--N表示硝态氮, NH4+-N表示铵态氮, AK表示速效钾, AP表示速效磷, OM表示有机质

表 1 不同轮作模式下的土壤养分含量1) Table 1 Contents of soil nutrients under the different rotation patterns

稀释曲线能够真实地反映土壤样品序列的测序深度, 通常用来评价测序量是否足以覆盖所有微生物类群^[14].如图 1所示, 在97%的相似度下, 4个处理的稀释曲线均基本趋于平稳, 说明该研究测序深度合理.

图 1

Fig. 1

不同颜色的曲线代表不同处理；相似水平为97% 图 1 土壤样品的稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of soil samples

对不同轮作模式下土壤样品真菌的ITS区测序, 20个土样共获得937 216条有效序列, 平均每个样品的序列数为46 860条, 序列的平均长度为254 bp.在97%的相似度下共聚类得到4 686个OTUs.由表 2可知, 对照处理的有效序列数最多, 其次为轮作籽粒苋处理、轮作大豆处理, 轮作藜麦处理最少.轮作籽粒苋处理的OTUs最多, 分别比轮作大豆、藜麦和对照高0.41%、7.79%和7.89%.

表 2 (Table 2)

表 2 不同轮作模式下土壤真菌序列数和OTUs数 Table 2 Reads and OTUs of fungal in different rotation patterns 处理 序列读数 OTUs CK 49 103 1 128 MRG 47 935 1 212 MRA 48 140 1 217 MRQ 42 264 1 129

表 2 不同轮作模式下土壤真菌序列数和OTUs数 Table 2 Reads and OTUs of fungal in different rotation patterns

由表 3可知, 3种轮作处理的真菌α多样性指数均高于连作, 说明轮作有利于提高土壤真菌群落的多样性和丰富度.4个处理的Simpson指数无显著差异(P=0.395 7), 仅3种轮作处理的Shannon指数与对照存在显著性差异(P < 0.05), 上述结果表明轮作处理提高了真菌的多样性.轮作大豆、轮作籽粒苋处理的Chao1指数和ACE指数无显著差异(P=0.103 1, P=0.417 1), 但均与轮作藜麦、谷子连作存在显著差异(P < 0.05), 说明与轮作大豆和轮作籽粒苋相比, 轮作藜麦和谷子连作会降低土壤真菌群落的丰富度.

表 3 (Table 3)

表 3 不同轮作模式下土壤真菌群落α多样性比较1) Table 3 Comparison of α diversity of soil fungal communities under different rotation patterns 处理 Simpson指数 Shannon指数 Chao1指数 ACE指数 CK 0.93±0.01a 5.47±0.12b 634.67±12.12b 655.73±19.89b MRG 0.95±0.01a 6.08±0.14a 773.73±6.92a 768.76±11.82a MRA 0.95±0.01a 6.02±0.19a 730.86±23.62a 742.63±26.81a MRQ 0.95±0.01a 6.00±0.13a 657.05±16.58b 677.00±18.04b 1)同列数据后不同字母表示差异显著(P < 0.05)

表 3 不同轮作模式下土壤真菌群落α多样性比较1) Table 3 Comparison of α diversity of soil fungal communities under different rotation patterns

在门水平上, 除少数真菌未被分类外, 4种处理下土壤真菌主要分布在8个真菌门类(图 2).分别为：Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门)、Zygomycota (接合菌门)、Chytridiomycota(壶菌门)、Rozellomycota(罗兹菌门)、Ciliophora(纤毛亚门)、Glomeromycota(球囊菌门)和Cercozoa(丝足虫门).其中, 子囊菌门(Ascomycota)为各处理的优势菌群, 丰度在88.74%~92.78%.不同处理影响了土壤真菌群落组成, 除轮作藜麦处理, 对照中的Ascomycota丰度明显高于其他轮作处理.轮作籽粒苋处理的Basidiomycota含量明显高于对照.

图 2

Fig. 2

图 2 不同轮作模式土壤在门水平的真菌类群比较 Fig. 2 Comparison of fungal groups at phylum level in the soils under different rotation patterns

对相对丰度大于1%的真菌属构建分层聚类, 图 3表明, 4个处理的土壤样品较为明显地分为3类, MRA和MRG处理土壤真菌群落结构较为接近, 可聚为一支; MRQ处理为一支, CK处理为一支.由此可见, 与谷子连作相比, 谷子轮作可对属水平上的土壤真菌群落结构产生显著影响.

图 3

Fig. 3

图 3 不同轮作模式土壤在属水平的真菌类群比较 Fig. 3 Comparison of fungal groups at genus level in the soils under different rotation patterns

对4个处理土壤真菌物种相对丰度共提取6个主成分, 累积贡献率达92.03%, 其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)贡献率分别为42.66%和19.13%.从图 4中可以看出, MRQ处理的样点分布在PC1轴正方向, CK和MRA处理样点分布在PC1轴负方向. MRQ和CK处理样点分布于PC2轴正方向, MRA样点分布在PC2轴负方向.

图 4

Fig. 4

图 4 不同轮作模式土壤在属水平真菌相对丰度主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis of relative abundance of soil fungal at genus level under different rotation patterns

由表 4可知, 土壤中全氮、全钾、硝态氮和有机质含量是影响土壤真菌群落最主要的因子.电导率与Acremonium呈显著正相关关系(P < 0.05);全氮和全磷与Mortierella呈显著正相关关系(P < 0.05), 且全氮与Gibberella呈极显著负相关关系(P < 0.01), 与Calicium呈显著负相关关系(P < 0.05);全钾与Mortierella呈极显著正相关关系(P < 0.01);硝态氮、铵态氮和速效钾与Preussia呈显著负相关关系(P < 0.05), 且硝态氮与Coprinellus呈极显著负相关关系(P < 0.01), 铵态氮与Acremonium呈显著正相关关系(P < 0.05), 与Russula呈显著负相关关系(P < 0.05);有机质与Myceliophthora呈极显著正相关关系(P < 0.01), 与Chaetomium、Acremonium和Coniolariella呈显著负相关关系(P < 0.05).

表 4 (Table 4)

表 4 不同养分因子和优势细菌属之间的相关性分析1) Table 4 Correlation analysis between different nutrient factors and dominant fungal genera 优势属 pH EC TN TK TP NO3--N NH4+-N AK AP OM Schizothecium 0.07 -0.75 -0.34 -0.36 -0.25 -0.48 -0.84 -0.87 0.08 0.48 Chaetomium 0.52 0.78 -0.82 -0.60 -0.62 0.58 0.68 0.59 -0.22 -0.91* Acremonium 0.21 0.96* -0.47 -0.21 -0.26 0.83 0.91* 0.88 -0.43 -0.89* Podospora 0.17 -0.01 -0.75 -0.51 -0.43 0.24 -0.15 -0.21 -0.37 -0.20 Myceliophthora -0.73 -0.76 0.83 0.73 0.77 -0.36 -0.68 -0.56 -0.08 0.97** Calicium 0.58 0.68 -0.89* -0.69 -0.70 0.48 0.56 0.46 -0.16 -0.87 Myrothecium 0.54 0.69 -0.88 -0.66 -0.67 0.52 0.57 0.48 -0.21 -0.86 Preussia 0.27 -0.87 -0.15 -0.39 -0.32 -0.88* -0.90* -0.96* 0.57 0.54 Mortierella -0.80 -0.02 0.95* 0.97** 0.93* 0.23 0.10 0.25 -0.34 0.45 Apodospora -0.21 -0.09 -0.46 -0.16 -0.06 0.38 -0.22 -0.21 -0.64 0.04 Coniolariella 0.69 0.64 -0.93* -0.78 -0.80 0.35 0.52 0.41 -0.01 -0.88* Aspergillus -0.09 -0.72 0.60 0.25 0.25 -0.83 -0.62 -0.60 0.63 0.70 Pyrenochaetopsis 0.65 -0.59 -0.44 -0.71 -0.67 -0.86 -0.63 -0.75 0.77 0.16 Gibberella 0.75 0.56 -0.96** -0.84 -0.85 0.25 0.44 0.31 0.07 -0.85 Coprinellus 0.21 -0.86 0.16 -0.18 -0.14 -0.98** -0.82 -0.86 0.74 0.62 Russula -0.47 -0.87 0.20 0.21 0.32 -0.36 -0.90* -0.84 -0.19 0.84 Lectera -0.85 -0.48 0.40 0.60 0.69 0.21 -0.50 -0.38 -0.70 0.71 1)**表示P < 0.01, *表示P < 0.05

表 4 不同养分因子和优势细菌属之间的相关性分析1) Table 4 Correlation analysis between different nutrient factors and dominant fungal genera

对不同轮作模式下土壤养分和真菌多样性进行主成分分析表明(表 5), 不同轮作模式下, 第一主成分方差贡献率为95.4%, 与第二主成分累积贡献率达99.9%, 说明前2个主成分能够反映土壤养分和真菌多样性的变异信息.由图 5可以看出, CK、MRG、MRA和MRQ分布在不同象限, 说明这4种处理间存在一定差异性; 由MRG、MRA和MRQ离CK的距离可以推断出MRG、MRA和MRQ与CK的相似度, 即距离越近, 相似度越高; 各轮作处理与CK的距离远近顺序为MRG>MRA>MRQ, 应选择与CK相似度较低的处理, 即MRG轮作处理最优.

表 5 (Table 5)

表 5 不同轮作模式的主成分分析 Table 5 PCA among different rotation patterns 编号 贡献率/% 累积贡献率/% 1 95.4 95.4 2 4.5 99.9 3 0.1 100

表 5 不同轮作模式的主成分分析 Table 5 PCA among different rotation patterns

图 5

Fig. 5

图 5 不同轮作模式的主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of different rotation patterns

作为土壤微生物区系的重要成员, 土壤真菌与其他微生物一起参与土壤生态系统中物质循环和能量流动.尹国丽等^[15]对不同草田轮作模式下土壤养分及微生物群落组成进行研究, 发现轮作作物和连作时间都会对土壤微生物多样性产生影响, 这与王芳等^[16]对连作及轮作模式下大豆根际微生物的研究结果一致.本研究结果同样可以看出, 轮作对土壤真菌群落结构有明显影响.

轮作作为一种常见的农业技术, 可促进根际微生物群落的多样性^[17], 而土壤微生物多样性的增加又有利于提高土壤的多功能性和可持续^[18].本研究结果显示, 轮作处理作物根际土壤真菌丰富度和多样性均高于连作谷子根际土, 说明轮作种植后土壤微环境优于连作土壤环境.其次, 轮作处理真菌多样性指数高于连作, 可能是土壤pH降低所致, 因为土壤pH下降会刺激嗜酸性真菌的生长繁殖^[19].此外, 有研究还发现, 轮作大豆根际土壤真菌多样性指数普遍高于其他处理, 这可能是因为大豆属于豆科, 具有固氮能力, 而固氮植物又具有提高土壤微生物多样性的能力造成的^[20].土壤微生物群落结构受种植作物的影响^[21], 不同的作物种类会导致其土壤微生物所处环境发生变化, 进而导致真菌组成和丰度存在差异.本研究结果发现, 不同的轮作模式下真菌群落结构具有一定差异, 但主要优势菌群保持稳定, 都以子囊菌门(Ascomycota)丰度最高, 这一结果与前人的研究结果一致^[22~24].子囊菌门是土壤中主要的分解者^{[25, 26]}, 能够分解环境中的木质素和角质素等难降解的有机质, 是养分循环和能量流动的主要驱动力^[27].本研究中, 轮作藜麦处理下土壤中子囊菌门含量最高, 推测轮作藜麦处理下土壤养分含量也会有所上升, 这与前文中轮作藜麦模式下土壤养分含量最高的结论是一致的.

土壤养分是影响土壤微生物群落结构变化的关键影响因子.前人研究结果显示, 土壤pH值是影响土壤微生物的最主要环境因子^{[28, 29]}.王楠等^[23]和Liu^[30]的研究同样显示pH值是影响土壤真菌的最主要因素, 且与真菌多样性呈极显著负相关关系, 说明真菌喜欢在偏酸性的环境中生长.本研究结果显示, 土壤pH值与Myceliophthora、Mortierella、Apodospora、Aspergillus、Russula和Lectera呈负相关关系(P < 0.05), 这也说明真菌喜好酸性环境.研究表明, 氮素含量的增加会影响真菌群落的氮循环过程, 进而改变土壤真菌的群落组成^[31].王楠等^[23]通过模拟酸雨对毛竹阔叶林过渡带真菌群落结构进行研究发现, 土壤全氮对真菌群落结构具有显著性影响, 本研究也同样发现氮素对不同轮作模式下真菌群落具有显著影响.

植物的生长发育离不开微生物的作用, 微生物的群落结构也受制于植物.有研究表明, 连作障碍发生的原因中微生物起至关重要的作用^[32].土壤微生物的数量和种类是影响土壤肥力和作物生长发育的重要因子之一^[32].许多研究表明土壤真菌能降解复杂化合物, 与作物共生形成菌根, 有利于作物生长, 在维持农业生态环境稳定方面具有重要意义^[33].刘珊廷等^[34]对连作和轮作下木薯根际土微生物研究发现, 连作和轮作对木薯根际土壤微生物的影响有明显差异; 轮作有利于木薯根际土壤真菌菌群的繁殖, 进而促进了土壤养分的转化.肖礼^[33]的研究表明, 土壤养分的有效化与土壤真菌密切相关, 土壤微生物中许多真菌菌群可促进土壤养分有效化, 提高土壤有效养分含量.综上所述, 研究谷子不同轮作模式下根际土壤真菌群落结构的变化特征对缓解农业生产中谷子的连作障碍具有重要意义.

本研究采用高通量测序技术研究了宁夏中部干旱带不同轮作模式下土壤养分及真菌群落结构特征.结果显示, 3种轮作均会提高土壤养分含量、土壤真菌多样性和丰富度, 改变真菌群落结构, 其中轮作大豆后根际土壤真菌多样性和丰富度最高.本研究中土壤优势真菌门为子囊菌门, 土壤真菌群落受土壤全氮、全钾、硝态氮和有机质含量的影响较大.