2020, Vol. 41
2. 贵州师范大学地理与环境科学学院, 贵阳 550001
2. School of Geography and Environmental Science, Guizhou Normal University, Guiyang 550001, China
喀斯特生态环境作为我国西南山区的一个独特生态环境系统, 维持着丰富的微生物多样性.茂兰喀斯特森林是目前世界上同纬度地区喀斯特原生性森林分布面积最大的地区[1], 具有重要的研究价值, 但是人类社会的发展逐渐破坏了原生林的原始性, 导致新的演替出现, 改变地上植被群落的分布组成, 从而引起地上生态系统和地下生态系统的物质循环发生改变[2].Stone等[3]的研究认为植被类型是土壤微生物多样性的主要驱动者, 植被多样性越高, 土壤微生物的营养来源越丰富, 微生物的种类就越多.近年来, 针对茂兰喀斯特森林的研究主要集中在土壤肥力[4]、石漠化过程[5]和土壤微生物活性[6]等方面, 但是有关茂兰喀斯特森林土壤真核微生物的研究甚少, 目前, 尚未见到对该地区不同植被演替阶段土壤真核微生物群落结构及多样性方面的研究报道.
土壤是一个复杂的环境, 蕴含着大量的微生物, 研究表明1 g土壤中就包含有几千种微生物[7], 其中包括原核微生物与真核微生物, 真核微生物主要包括原生生物与真菌[8, 9].目前对微生物多样性的研究往往偏向于原核微生物, 如Fierer等[10]对细菌群落多样性与地理环境的研究; DeLong等[11]对北美州近海岸地表水环境中古菌分布的研究.而对真核微生物的研究相对较少, 先前的研究表明, 植被演替对细菌、真菌的分布有着极大的影响[12, 13].白丽等[14]在对黄土高原草地次生演替的研究中发现, 随着植被演替的进行, 细菌微生物多样性整体出现显著增加的趋势; 还有研究在对森林、草地和农田土壤中真核微生物的分布研究中发现, 森林土壤中真核微生物的丰富度要远远高于灌木林和草地土壤[15].真核微生物是土壤生态系统中的重要组成部分, 其作为消费者、分解者在生物地球化学循环中扮演着不可或缺的重要角色[16~18], 是土壤肥力的一个重要要素[19].真核微生物多样性组成不仅影响植物与土壤环境之间的关系, 还对地上植被的生长有着重要意义[20~22].
随着分子生物学技术的迅速发展, 高通量测序技术在真核微生物多样性的研究也日渐增多.目前, 无论是陆地生态系统还是海洋生态系统中都有不少应用[23, 24]. Mahé等[25]利用高通量技术研究了热带雨林中土壤原生生物的多样性, 发现Parasites是热带雨林中最多样化的原生生物.秦文韬等[26]研究了城市污水处理系统中真核微生物群落特征, 揭示了在Supergroup分类水平和Division分类水平下真核微生物的差异性分布.因此, 本文以茂兰喀斯特森林为研究对象, 利用18S rDNA测序手段结合生态学方法对茂兰喀斯特森林不同演替过程中土壤真核微生物群落组成及多样性进行分析, 通过对茂兰喀斯特森林土壤真核微生物群落的认识, 以期为进一步研究茂兰自然保护区森林生态系统提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况及土样采集茂兰喀斯特森林位于贵州省荔波县南部, 与广西木论国家级自然保护区毗邻, 地理位置为25°09′20″~25°20′50″N, 107°52′10″~108°45′40″E.森林覆盖率达87.3%, 平均海拔500~800 m, 年平均气温18.3℃, 年平均相对湿度为70%左右, 属中亚热带季风湿润气候.土壤以黑色石灰土为主, 土层浅薄且不连续, 土壤富钙和富盐基化, pH值在6.5~8.0之间, 有机质含量高, 被誉为典型的喀斯特生境[27].
于2019年10月下旬, 在茂兰自然保护区及周边选择原生林(YSL)、灌木林(GML)、灌木丛(GMC)和草地(CD)这4种演替阶段类型土壤进行采集, 每种类型选取10 m×10 m的3个样方, 在每个样方内随机采取3份土样, 采土深度为0~5 cm, 共12个土样.现场采集的土样分为两份:一份取约20 g装入无菌采样袋, 放入含生物冰袋的泡沫箱内, 用于18S rDNA测序; 另一份取约1 kg带回实验室储存于4℃冰箱备用.
1.2 土样总DNA的提取与检测DNA提取及质量控制:根据E.Z.N.A soil试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S)说明书进行总DNA抽提, DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测, 利用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量.
1.3 土壤真核微生物18S rDNA的扩增和文库的构建根据文献[28, 29], 用547F (5′-CCAGCASCY GCGGTAATTCC-5′)和952R (5′-ACTTTCGTTCTT GATYRA-3′)引物对V4可变区进行PCR扩增, 本研究的文库构建采用两步PCR扩增的方法, 首先采用特异引物扩增目的片段, 将目的片段进行胶回收, 而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增.目的是将Illumina平台测序所需的接头、测序引物和barcode添加到目的片段的两端.
第一步扩增反应体系:5xBuffer 10 μL, 10 mmol ·L-1 dNTP 1 μL, DNA酶1 U, DNA模板5~50 ng, 10 μmol ·L-1正向、反向引物各1 μL, 补水至50 μL. PCR扩增条件:94℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共33个循环, 72℃延伸5 min.冷却至10℃.
第二步扩增反应体系:5xBuffer 8 μL, 10 mmol ·L-1 dNTP 1 μL, DNA酶0.8 U, DNA模板5 μL, 10 μmol ·L-1正向、反向引物各1 μL, 补水至50 μL. PCR扩增条件:94℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共33个循环, 72℃延伸5 min, 冷却至10℃.
同时每个样品做3个技术重复, 将同一样品PCR产物混合后经2%琼脂糖凝胶回收PCR产物、割胶纯化、浓度检测等操作后.根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2×300的文库.(上海美吉生物医药科技有限公司).
1.4 序列生物信息学分析通过VSEARCH 2.14.1[30]进行双端合并并且除引物, 去冗余; 基于USEARCH10[31]的UNOISE3[32]进行聚类生成OTU; 基于SILVA 128[33]去除嵌合体; PR2数据库[34]注释的置信值为0.6.同时, 对OTU进行丰度、α多样性和Venn图等分析; 利用R语言ggplot2包、vegan包进行NMDS分析及物种分布扇形图; 利用Python2.0软件进行LEfSe分析(LDA Effect Size).
2 结果与分析 2.1 不同演替阶段真核微生物OTU分布对土壤真核微生物18S rDNA的V4高变区PCR扩增, 进行Illumina MiSeq测序, 4种演替阶段土壤样品共获得192 157条优化序列, 基于USEARCH 10的UNOISE3进行聚类分析, 结果共获得1 580个OTU. 4种演替阶段土壤真核微生物OTU分布如图 1所示, 4种演替阶段下1580个OTU中共有的OTU个数为161, 占总OTU数量的10.18%. 4种演替阶段下OTU个数分别为: 902、629、652和702.其中, YSL中特有的OTU为435个, 占总OTU数量的27.53%; GML中特有的OTU为175个, 占总OTU数量的11.08%; GMC中特有的OTU为88个, 占总OTU数量的5.57%; CD中特有的OTU为142个, 占总OTU数量的8.99%.以上结果表明4种演替阶段土壤中真核微生物的群落结构存在一定差异.
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YSL表示原生林; GML表示灌木林; GMC表示灌木丛; CD表示草地, 下同 图 1 不同演替阶段下真核微生物OTU维恩图 Fig. 1 OTU Venn of eukaryotic microbes in different stages of succession |
ACE指数和Chao1指数是两种用于估计群落中含OTU数目的微生物多样性指数的方法, 在生态学中常用来估计物种的总数.由表 1可知, ACE指数和Chao1指数由大至小表现为YSL>GMC>GML >CD.表明原生林中真核微生物群落丰富度大于灌木林和草地; Shannon指数可以估算样本中微生物多样性, Shannon指数由大至小表现为YSL>GMC>GML>CD, 表明原生林中真核微生物群落多样性大于灌木林和草地.
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表 1 不同演替阶段下真核微生物群落α多样性指数1) Table 1 The α diversity indices of eukaryotic microbial community in different stages of succession |
2.3 不同演替阶段真核微生物群物种组成
本研究从Supergroup和Division两个水平对1 580个OTU进行了物种分析.图 2(a)展示了在Supergroup水平下, 1 580个OTU分属于8个Supergroup.其中, Opisthokonta的相对丰度最高, 为45.03%; Alveolata次之, 为14.52%; 图 2(b)展示了在Division水平下, 3 794个OTU分属于19个Division.其中, 相对丰度大于1%的有12个, 它们的累积相对丰度已高达99%.具体地, 62.62%的OTU属于Fungi、Cercozoa和Streptophyta, 其中, 相对丰度最高的是Fungi为43.06%, 其次是Cercozoa和Streptophyta, 相对丰度分别为13.92%和5.62%, 还有14.48%的OTU属于未被培养的物种.
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图 2 不同水平下不同演替阶段真核微生物群落组成 Fig. 2 Composition of eukaryotic microbial community in different stages of vegetation succession at different levels |
4种演替阶段Division水平下[图 2(c)].原生林土壤中真核微生物主要群落为Fungi、Apicomplexa、Streptophyta和Cercozoa, 其相对丰度占58.97%;灌木林土壤中真核微生物主要群落为Fungi、Cercozoa和Chlorophyta, 其相对丰度为83.51%;灌木丛土壤中真核微生物主要群落为Fungi和Cercozoa, 其相对丰度为41.41%;草地土壤中真核微生物主要群落为Fungi和Cercozoa.其相对丰度为77.89%.以上结果表明, Fungi是4种植被演替阶段土壤中的优势种群, 且在草地演替阶段中相对丰度最高(达到了群落结构的68.73%), 在原生林演替阶段中最低(达到了群落结构的17.90%).
2.4 不同演替阶段下真核微生物NMDS分析基于Bray-Curtis建立样品间的非相似性矩阵, 采用非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)得到不同演替阶段下的土壤真核微生物群落结构组成.结果如图 3所示, 根据植被演替阶段可以划分为4个聚集区, 来自YSL、GML、GMC和CD这4个演替阶段中的真核微生物群落各自聚为一类, 表明4种演替阶段下的真核微生物群落结构存在差异, 相异性分析非参数检验方法ADONIS、ANOSIM的结果也为4种不同植被演替下土壤真核微生物群落结构存在差异提供了佐证(P＜0.05).Stress(胁强系数) < 0.2时, 说明NMDS可以准确反映样品间的差异程度.综合分析发现, YSL与CD距离最远, 说明其土壤真核微生物群落组成结构差异最大, GMC与CD距离最近, 说明其土壤真核微生物群落组成结构最相似.总体来说, 各样地两两之间距离不同, 各样地土壤真核微生物群落组成结构均不同, 同时两两之间差异大小也不相同.
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图 3 基于NMDS的不同演替阶段下真核微生物群落结构分析 Fig. 3 Structure analysis using NMDS of eukaryotic microbial community in different stages of succession |
4个样地LEfSe分析进化如图 4所示, 在真核微生物属水平上作LEfSe分析, 仅展示得分值>2.0的物种.原生林与灌木林中共发现31个差异种, 其中原生林20个, 灌木林11个; 原生林与灌木丛中共发现26个差异种, 其中原生林20个, 灌木丛6个; 灌木林与灌木丛中共发现6个差异种, 其中灌木林5个, 灌木丛1个; 灌木丛与草地中共发现6个差异种, 其中灌木丛5个, 草地1个.原生林中的差异种主要有Stenophoridae(科)、Stenophorida(目)、Gregarinomorphea(纲)、Tubulinea(纲)、Peronosporales(科)、Oomycota(纲)和Embryophyceae(纲); 灌木林中的差异种主要有Mortierella(属)、Fungi(门)、Sphaeropleales(科)、Chlorophyceae(科)和Mucoromycotina(目); 灌木丛中的差异种主要有Chlorophyta(门)、Chlorophyceae(科)和Sphaeropleales(科); 草地的差异种主要有Fungi(门).
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(a)表示原生林与灌木林之间的差异指示种; (b)表示原生林与灌木丛之间的差异指示种; (c)表示灌木林与灌木丛之间的差异指示种; (d)表示灌木丛与草地之间的差异指示种; 图中小写字母(a~r)代表真核生物从门到属水平的差异指示种 图 4 不同演替阶段下真核微生物群落LEfSe分析 Fig. 4 LEfSe analysis of eukaryotic microbial community in different stages of succession |
目前, 对茂兰喀斯特自然保护区动植物群落结构和土壤理化性质等方面已有比较深入的研究[35, 36], 而针对真核微生物的研究主要集中在海洋真核微生物[37~39], 而对土壤真核微生物的研究较少.本研究发现Shannon和Chao1指数在不同植被演替阶段土壤中存在差异, 最低的是草地土壤, 最高的是原生林土壤.这表明随着正向演替的进行, 土壤微生物多样性在不断增加, 这一结果可能是因为:①原生林土壤养分肥沃, 为微生物的生存提供了较好的环境[40].并且随着演替的进行, 植被逐渐趋于成熟阶段, 植物生产力与凋落物的增加提高了土壤有机质含量[41], 研究表明有机质含量的差异是影响微生物多样性的主要因素[42], 而原生林土壤有机质往往高于草地, 因此原生林土壤物种多样性较草地土壤高.②原生林植被类型的丰富和多样性导致了土壤微生物利用资源异质性增加, 从而增加了土壤生物[43].Jangid等[44]的研究发现, 随着演替的进行, 演替后期土壤微生物群落多样性指数会高于早期演替阶段, 这与本研究结果一致.同样地, De Quadros等[45]的研究发现, 原生林微生物群落多样性略高于草地土壤微生物多样性.NMDS分析表明, 原生林、灌木林、灌木丛和草地演替阶段下土壤真核微生物群落可以明显区分, 这与Zhao等[28]的研究结果相一致.其原因可能是随着植被演替的进行, 植被类型也会随之改变, 这种改变会影响凋落物的数量和组成, 进而对土壤微生物的分布和组成产生间接影响[46~48].
土壤微生物多样性受植被、土壤类型、温度、水分和土地利用方式等因素影响[49].本研究发现, 在不同演替阶段中真核微生物组成相似, 主要优势群落为Fungi、Cercozoa和Streptophyta.Fungi是4种演替阶段下的优势物种.这与很多研究结果相似, 如Müller等[50]在使用高通量测序对大西洋森林土壤真核微生物的研究中发现, Fungi和Metazoa是最多的物种; Jing等[49]通过对不同植被恢复类型土壤中真核微生物的研究也发现, Fungi和Metazoa是主要的群落; 还有研究者认为土壤微生物会随着地上植被的演替发生变化, 大量不同种类的植物凋落物提供了丰富的营养物质来源[51].植被组成的不同也会导致进入到土壤中的有机质、根系分泌物等发生变化, 改变根系对土壤的营养物质输入, 从而影响土壤真菌的群落组成和多样性分布[52, 53].王韵等[54]的研究发现在整个植被演替的过程中, 植被类型改变了土壤养分、微生物群落多样性等.土壤养分越充足, 越有利于土壤微生物的生长发育.LEfSe分析还表明, 4种演替阶段土壤中真核微生物的差异种明显不同, 原生林中真核微生物差异种最多, 草地阶段差异种最少, 表明随着正向演替的进行差异指示种数量在不断增加, 这可能是因为原生林土壤有机质、总碳和总氮等理化因子较其他3种演替阶段而言土壤肥力较高[55], 各种土壤理化因子的综合作用使得原生林演替阶段差异指示种数量最多.
4 结论(1) 不同分类水平下, 不同演替阶段土壤真核微生物群落优势种群组成相似, 在Supergroup水平上, 群落优势种群主要由后鞭毛生物(Opisthokonta)、囊泡虫类(Alveolata)和有孔虫类(Rhizaria)组成.
(2) 不同演替阶段下土壤真核微生物多样性存在差异, Shannon指数与Simpson指数在不同演替阶段表现为:YSL>GMC>GML>CD.
(3) 利用NMDS分析和LEfSe分析探讨茂兰喀斯特地区真核微生物群落分布, 结果表明不同演替阶段下真核微生物群落结构存在差异.
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