环境科学  2020, Vol. 41 Issue (8): 3748-3757   PDF    
引用本文
袁其懿, CHEN Hong-jie, Laurence Haller, 何义亮. 亚剂量抗生素诱导抗性基因水平迁移[J]. 环境科学, 2020, 41(8): 3748-3757.
YUAN Qi-yi, CHEN Hong-jie, Laurence Haller, HE Yi-liang. Antibiotics Induce Horizontal Gene Transfer of Resistance at Sublethal Concentrations[J]. Environmental Science, 2020, 41(8): 3748-3757.
亚剂量抗生素诱导抗性基因水平迁移
袁其懿1, CHEN Hong-jie2, Laurence Haller2, 何义亮1     
1. 上海交通大学环境科学与工程学院, 上海 200240;
2. Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, Singapore 117576, Singapore
收稿日期: 2019-12-03; 修订日期: 2020-02-20
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2017ZX07207002-05）；上海交通大学-新加坡国立大学重大国际合作项目（CREATE）
作者简介: 袁其懿(1994~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为环境细菌耐药性和耐药基因传递, E-mail:yqy6611@sjtu.edu.cn
通信作者: 何义亮, E-mail:ylhe@sjtu.edu.cn
摘要: 为探究亚剂量抗生素诱导下编码广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）基因的接合转移（conjugation），使用从新加坡主要医院的废水中直接分离的可合成ESBL的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）和大肠杆菌（E.coli）菌株作为ESBL编码质粒的供体，以携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的耐氯霉素（chloramphenicol，CHL）大肠杆菌SCC1（E.coli SCC1）作为受体，借助响应面分析，检测并分析了携带有ESBL编码基因的质粒在亚剂量水平的四环素（tetracycline，TC），磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole，SMZ）和头孢他啶（ceftazidime，CAZ）单一暴露和共同暴露时，从供体菌株接合传递至受体菌株的特征.结果发现，ESBL编码质粒可在无诱导抗生素胁迫下，以平均0.0015和0.0042的频率分别由铜绿假单胞菌和大肠杆菌供体接合转移至受体大肠杆菌SCC1菌株，具有较低的"适应性代价"，并在质量浓度低于最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的抗生素暴露下更易在大肠杆菌菌株之间传递.大肠杆菌菌株之间的接合转移显著发生在质量浓度低于0.03 mg·L-1的TC与质量浓度低于0.002 mg·L-1的CAZ单一暴露或共同暴露时，并可被亚MIC的TC显著抑制.铜绿假单胞菌与大肠杆菌间的接合转移可在5倍MIC的TC、CAZ共同暴露时被显著诱导，未检测到亚MIC水平抗生素对其的促进作用.
关键词: 广谱β-内酰胺酶(ESBL)      质粒      接合体      抗生素      亚剂量      响应面分析     
Antibiotics Induce Horizontal Gene Transfer of Resistance at Sublethal Concentrations
YUAN Qi-yi1 , CHEN Hong-jie2 , Laurence Haller2 , HE Yi-liang1     
1. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;
2. Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, Singapore 117576, Singapore
Abstract: In order to explore the conjugation of genes encoding extended-spectrum β-lactamase (ESBL), ESBL-expressing P. aeruginosa and E.coli strains isolated from the wastewater of major hospitals in Singapore were used as donors. gfp-tagged E.coli SCC1 strains resistant to chloramphenicol (CHL) were chosen as recipients. Using response surface analysis, we detected and analyzed the induction of conjugal transfer under single-exposure and co-exposure of tetracycline (TC), sulfamethoxazole (SMZ), and ceftazidime (CAZ) at sublethal concentrations. It was found that the ESBL plasmid could be conjugal transferred from P. aeruginosa and E.coli strains to the recipient E.coli SCC1 strains at an average frequency of 0.0015 and 0.0042, respectively, without stress from inducing antibiotics, thus showing a low fitness cost and higher conjugal frequency between E.coli strains under the exposure of sub-MIC antibiotics. A significant conjugation between E.coli strains occurred under the single-exposure or co-exposure of a TC concentration of < 0.03 mg·L-1 and a CAZ concentration of < 0.002 mg·L-1, as inhibited by a sub-MIC level of TC. The conjugation between P. aeruginosa and E.coli strains was stimulated under the exposure of TC and CAZ with concentrations 5-times larger than the MIC, while no significant induction was detected from the sub-MIC antibiotics.
Key words: extended-spectrum β-lactamase (ESBL)      plasmids      transconjugants      antibiotics      sublethal      response surface analysis     

近年来, 环境细菌对β-内酰胺类抗生素持续增加的耐药性日益得到了人们的关注[1, 2], 其机制主要是通过合成多种β-内酰胺酶(β-lactamase)使进入细菌细胞的β-内酰胺类抗生素失活.以中国为例, 编码β-内酰胺酶的抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)已在包括河流、水库在内的城市水体[3~6]、污水处理系统[7~9]、河口沉积物[10]、土壤[11, 12]和牲畜排泄物[13]等被检出, 具有种类多、丰度大的特点.其中blaCTX、blaOXA、blaTEM和blaSHV等ARGs编码广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase, ESBL), 可使细菌获得对大多数青霉素类和头孢菌素类抗生素的耐药性, 对人类健康危害极大[1].

编码ESBL的基因通常位于包括质粒在内的可动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)上[14], 易于通过基因水平迁移(horizontal gene transfer, HGT)造成传播扩散[15].对于编码在质粒上的ESBL基因, 接合转移(conjugation)是最主要的HGT途径[16, 17].有研究发现, 当细菌暴露于低于其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的抗生素下, HGT将是细菌修补DNA损伤和获得耐药性的重要途径[18].国内外已有研究证明了亚MIC水平的四环素类[19~21]、磺胺类[22]和喹诺酮类[23]等抗生素具有富集抗性菌株、影响ARGs赋存特性和调节ARGs接合转移的功效, 但是这些研究普遍存在很少涉及ESBL编码基因、局限于单一抗生素暴露、对质粒做了过多人为改造等局限性.对于多种亚剂量抗生素共同暴露下ESBL编码质粒的接合传递, 国内外仍鲜见报道.

头孢他啶(ceftazidime, CAZ)是典型的第三代头孢菌素, 可作为判断菌株是否具备合成ESBL能力的指示剂.研究分别使用从新加坡主要医院的废水中直接分离的可合成ESBL的铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)作为ESBL编码质粒的供体细菌, 以携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的耐氯霉素(chloramphenicol, CHL)大肠杆菌SCC1(E.coli SCC1)作为受体细菌, 以抗CAZ基因作筛选基因, 定量研究携带有ESBL编码基因的质粒在亚MIC水平的四环素(tetracycline, TC), 磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole, SMZ)和CAZ单一暴露和共同暴露时, 从供体细胞水平迁移至受体细菌细胞的特征及其影响因素, 以期为了解和抑制ESBL编码基因在亚剂量抗生素胁迫下的迁移扩散提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 所用的化学药剂

使用的抗生素如下：TC: Tetracycline hydrochloride (Sigma-Aldrich, T3383), SMZ: Sulfamethoxazole (Fluka, S7507), CAZ: Ceftazidime hydrate (Sigma-Aldrich, A6987), CHL: Chloramphenicol (Sigma-Aldrich, C0378).

所用的LB培养液使用LB Broth Base (Invitrogen, 12780-052)配置而成.配置操作严格遵守产品指示.

1.2 供体细菌和受体细菌的准备

作为供体的大肠杆菌菌株由Laurence Haller提供, 铜绿假单胞菌菌株由Goh Shin Giek提供.菌株分离、纯化、种属鉴定和耐药性检验方法可详见文献[1].作为受体的携带gfp基因的耐CHL大肠杆菌SCC1菌株由CHEN Hong-jie提供.供体和受体分别预生长于含有15 mg ·L-1 CHL的LB培养液中, 在温度37℃, 摇速150 r ·min-1条件下过夜培养.

受体对诱导抗生素的MIC使用基于LB培养液培养的连续双倍稀释法检测.MIC数值如表 1所示.

表 1 受体MIC值 Table 1 MIC values for the recipient

1.3 接合转移实验与转移频率计算

各取5 μL供体细菌和受体细菌悬浮液混合入含有5 mL LB培养液的15 mL离心管中, 在温度37℃, 摇速150 r ·min-1条件下过夜培养.测试的抗生素质量浓度如下：TC为0、0.000 03、0.000 3、0.003、0.03、0.3和3 mg ·L-1; SMZ为0、0.000 3、0.003、0.03、0.3、3和30 mg ·L-1; CAZ为0、0.000 02、0.000 2、0.002、0.02和0.2 mg ·L-1.同时分别在3支仅含有5 mL LB培养液的15 mL离心管中混合入5 μL受体细菌悬浮液, 在温度37℃, 摇速150 r ·min-1条件下过夜培养, 作为对照.含CAZ(50 mg ·L-1)的LB培养液用于选择接合体(transconjugants)细胞(即成功获得ESBL编码质粒的受体细菌细胞)和排除受体细胞发生耐药性突变的可能性.使用流式细胞仪(CytoFLEX S, 美国贝克曼库尔特有限公司)检测接合体细胞的数量.通过将接合体细胞数除以从对照中推导出的平均受体细胞总数来计算转移频率.各组接合转移实验均做3组独立重复实验.

1.4 统计分析

本研究所涉及的响应面分析使用Design Expert 11完成, 选用Box-Behnken Design, 中心点设置为3个.其余的统计分析和绘图在R 3.6.2环境下实现.

2 结果与分析 2.1 无四环素、磺胺甲噁唑和头孢他啶胁迫时的接合转移频率

当供体菌株和受体菌株仅暴露于15 mg ·L-1氯霉素下, 发生的接合转移频率视为本研究的接合转移频率背景值.

当供体菌株为铜绿假单胞菌时, 该背景值变化范围为0.000 5~0.002 6, 均值0.001 5.当供体菌株为大肠杆菌时, 该背景值变化范围为0.003 0~0.005 4, 均值0.004 2.比较发现, 无TC、SMZ和CAZ胁迫时, 大肠杆菌供体更易将抗性质粒接合转移至大肠杆菌受体(t检验, P < 0.01).

2.2 单一亚剂量抗生素胁迫对接合转移影响

无论供体菌株是铜绿假单胞菌还是大肠杆菌, 在亚剂量SMZ胁迫下, 供受体菌株之间接合传递ESBL编码质粒的频率最高(t检验, P < 0.01, 图 1).在此胁迫条件下, 铜绿假单胞菌和受体菌株之间的抗性传递频率介于0.002 2~0.004 6之间(图 2); 大肠杆菌与受体菌株之间的抗性传递频率介于0.002 7~0.005 2之间(图 2).随着SMZ的胁迫质量浓度接近受体菌株的MIC, 受体菌株吸收不同供体菌株ESBL编码质粒的频率随着胁迫质量浓度增大而产生波动, 但与背景值无显著差异(t检验, P> 0.05)[图 2(b)].各胁迫质量浓度下, 检测误差多超过0.95置信区间范围[图 2(a)].

ns为P> 0.05, *为P < 0.05, **为P < 0.01 图 1 亚MIC抗生素对接合转移的诱导能力比较 Fig. 1 Comparison of the ability of induction by sub-MIC antibiotics on conjugation

图 2 SMZ对接合转移诱导作用对比和样条曲线 Fig. 2 Bar chart and splines to compare of the induction of SMZ on conjugation

供受体菌株暴露于亚剂量CAZ下时, 同样可发生较高频率的质粒接合传递.当供体菌株为铜绿假单胞菌时, 供受体菌株在亚剂量CAZ胁迫下的质粒迁移频率显著低于在亚剂量SMZ胁迫下的质粒迁移频率(t检验, P < 0.01);当供体菌株为大肠杆菌时, 供受体菌株在亚剂量CAZ胁迫下的质粒迁移频率在亚剂量SMZ胁迫下的质粒迁移频率无显著差异(t检验, P> 0.05, 图 1).在此胁迫条件下, 铜绿假单胞菌和受体菌株之间的抗性传递频率介于0.001 0~0.001 8之间(图 3); 大肠杆菌与受体菌株之间的抗性传递频率介于0.000 3~0.005 3之间(图 3).铜绿假单胞菌和受体菌株之间的抗性质粒传递频率在亚剂量CAZ胁迫下与背景值无显著差异(t检验, P> 0.05).当CAZ质量浓度不高于0.002 mg ·L-1时, 大肠杆菌供体与大肠杆菌受体菌株之间接合转移频率与背景值无显著差异(t检验, P>0.05);当CAZ质量浓度高于0.002 mg ·L-1时, 接合转移频率存在显著的降低(t检验, P < 0.01)[图 3(b)].在各胁迫质量浓度下, 检测误差多超过0.95置信区间范围[图 3(a)].

图 3 CAZ对接合转移诱导作用对比和样条曲线 Fig. 3 Bar chart and splines to compare of the induction of CAZ on conjugation

比较发现, 在亚剂量TC胁迫下, 受体菌株吸收源于不同供体的抗性质粒的频率最低(t检验, P < 0.01, 图 1).在此胁迫条件下, 铜绿假单胞菌和受体菌株之间的抗性传递频率介于0.000 3~0.003 3之间(图 4); 大肠杆菌与受体菌株之间的抗性传递频率介于0.000 5~0.004 2之间(图 4).铜绿假单胞菌和受体菌株之间的抗性质粒传递频率在亚剂量TC胁迫下与背景值无显著差异(t检验, P>0.05).当TC质量浓度低于0.003 mg ·L-1时, 大肠杆菌供体与大肠杆菌受体菌株之间接合转移频率与背景值无显著差异(t检验, P>0.05);当TC质量浓度高于0.003 mg ·L-1时, 接合转移频率存在显著的降低[t检验, P < 0.01, 图 4(b)].在各胁迫质量浓度下, 检测误差多超过0.95置信区间范围[图 4(a)].

图 4 TC对接合转移诱导作用对比和样条曲线 Fig. 4 Bar chart and splines to compare of the induction of TC on conjugation

综上, 在亚剂量SMZ、CAZ或TC胁迫下, 受体和不同供体发生ESBL编码质粒接合传递的频率符合相同的分布(Wilcoxon, P>0.05), 证明大肠杆菌受体使用相似的机制接受不同供体的ESBL编码质粒.在亚剂量SMZ或CAZ胁迫下, 相较于铜绿假单胞菌和大肠杆菌受体之间的抗性质粒转移, 供受体均为大肠杆菌时两者之前更易发生抗性质粒的接合转移(t检验, P < 0.01, 图 5).当TC质量浓度范围在0~3 mg ·L-1之间变化, 铜绿假单胞菌和大肠杆菌受体之间的抗性质粒转移频率与供受体均为大肠杆菌时的质粒转移频率无显著差异(t检验, P>0.05, 图 5); 当TC质量浓度不高于0.003 mg ·L-1, 供受体均为大肠杆菌时两者之前更易发生抗性质粒的接合转移(t检验, P < 0.01).

ns为P>0.05, *为P < 0.05, **为P < 0.01 图 5 受体接受来自不同供体的质粒的能力比较 Fig. 5 Comparison of the ability of recipients to accept plasmids from different donors

2.3 多种亚剂量抗生素对铜绿假单胞菌与受体菌株间接合转移的协同影响

根据2.2节的结果, 本节设计了两组Box-Behnken响应面分析实验.实验方案和检测结果如表 2和表 3所示.

表 2 TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时Box-Behnken响应面分析实验设计表及结果 Table 2 Design table and results of Box-Behnken response surface analysis with concentrations of TC lower than 0.03 mg ·L-1 and CAZ lower than 0.002 mg ·L-1

表 3 TC质量浓度高于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度高于0.002 mg ·L-1时Box-Behnken响应面分析实验设计表及结果 Table 3 Design table and results of Box-Behnken response surface analysis with concentrations of TC higher than 0.03 mg ·L-1 and CAZ higher than 0.002 mg ·L-1

响应面分析结果表明, 当TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时, 均值模型具有最佳的拟合效果(ANOVA, P < 0.01), 此时亚剂量TC、SMZ和CAZ对铜绿假单胞菌与受体菌株间抗性质粒接合转移频率没有显著的影响; 接合转移频率与背景值接近.

当TC质量浓度高于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度高于0.002 mg ·L-1时, 二次型具有最佳的拟合效果(P < 0.01).ANOVA结果认为, 此时TC对接合传递频率影响最为显著(ANOVA, P < 0.01), 剂量-效应呈现符合二次多项式的“抛物线型”促进-抑制特点(ANOVA, P < 0.01).TC与SMZ、CAZ的交互作用均不显著(ANOVA, P>0.05), 可认为TC对接合转移频率的影响具有相对独立性.CAZ对接合传递同样具有显著影响(ANOVA, P < 0.01), 剂量-效应同样呈现“抛物线型”促进-抑制特点(ANOVA, P < 0.01).SMZ对接合传递频率呈现微弱的“线性抑制”(ANOVA, P=0.04), 同时SMZ与CAZ存在极显著的交互作用(ANOVA, P < 0.01), 剂量-效应呈现“抑制”.响应面分析结果如图 6和图 7所示.

(a)等高线图；(b)三维图 图 6 暴露于TC和CAZ下, 铜绿假单胞菌和受体之间接合转移的剂量-效应曲面 Fig. 6 Dose-response surface of conjugation between P.aeruginosa and recipients under exposure of TC and CAZ

(a)等高线图; (b)三维图 图 7 暴露于SMZ和CAZ下, 铜绿假单胞菌和受体之间接合转移的剂量-效应曲面 Fig. 7 Dose-response surface of conjugation between P.aeruginosa and recipients under exposure of SMZ and CAZ

TC、SMZ和CAZ之间的协同作用, 可以显著提升受体菌株的抗性, 使其可暴露于超过MIC水平的抗生素下依旧存活.当TC和CAZ剂量达到5倍MIC的水平时, 仍可检测到显著的抗性质粒传递.上述结果表明无ESBL合成能力的大肠杆菌菌株具备在高质量浓度抗生素胁迫下接收铜绿假单胞菌输出的ESBL编码质粒从而增强抗药性的能力, 揭示了铜绿假单胞菌在环境细菌抗药性增强过程中起到的关键作用.

2.4 多种亚剂量抗生素对大肠杆菌与受体菌株间接合转移的协同影响

与2.3节类似, 本节设计了两组Box-Behnken响应面分析实验.实验方案和检测结果如表 4和表 5所示.

表 4 TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时Box-Behnken响应面分析实验设计表及结果 Table 4 Design table and results of Box-Behnken response surface analysis with concentrations of TC lower than 0.03 mg ·L-1 and CAZ lower than 0.002 mg ·L-1

表 5 TC质量浓度高于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度高于0.002 mg ·L-1时Box-Behnken响应面分析实验设计表及结果 Table 5 Design table and results of Box-Behnken response surface analysis with concentrations of TC higher than 0.03 mg ·L-1 and CAZ higher than 0.002 mg ·L-1

当TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时, 二次型具有最佳的拟合效果(P < 0.01).ANOVA结果认为, 此时TC对接合传递频率影响最为显著(ANOVA, P < 0.01), 剂量-效应总体呈现线性抑制(ANOVA, P < 0.01), 同时伴随着较微弱的抛物线型“抑制-促进”效应(ANOVA, P=0.04).TC与SMZ、CAZ的交互作用均不显著(ANOVA, P>0.05), 一样可认为TC对接合转移频率的影响具有相对独立性.SMZ、CAZ均对接合传递频率无显著影响(ANOVA, P>0.05), 与2.2节类似.响应面由图 8所示.

(a)等高线图; (b)三维图 图 8 在暴露于TC和CAZ的情况下, 大肠杆菌和受体之间接合转移的剂量-效应曲面 Fig. 8 Dose-response surface of conjugation between E.coli and recipients under exposure of TC and CAZ

综上, 当TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时, TC对大肠杆菌供受体之间ESBL编码质粒传递频率具有最显著的调节作用, 剂量-效应主要呈现为“抑制”, 与图 4(b)趋势一致.CAZ对于调节大肠杆菌供受体之间ESBL编码质粒传递频率无显著作用, 说明β-内酰胺类抗生素胁迫不必然影响ESBL编码质粒的传递扩散, 揭示了抗生素与抗性基因之间复杂的关系.

当TC质量浓度高于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度高于0.002 mg ·L-1时, 均值模型具有最佳的拟合效果(ANOVA, P < 0.01), 转移频率显著低于背景值.这说明高质量浓度(接近和超过MIC)的TC、SMZ、CAZ对大肠杆菌供受体菌株间抗性质粒接合转移频率具有强烈的抑制作用, 作用原理为强烈抑制大肠杆菌受体的生长繁殖.ESBL编码质粒在大肠杆菌菌株之间的扩散只可在亚剂量抗生素胁迫下显著发生.

3 讨论 3.1 ESBL编码质粒在亚剂量抗生素胁迫下的接合传递特点

携带高丰度耐药性基因的质粒通常具有较高的“适应性代价”[24], 具体表现为在低胁迫条件下, 耐药性细菌的生长速率显著低于野生型细菌.然而本研究发现, 从医院废水中分离获得的可合成ESBL的铜绿假单胞菌和大肠杆菌供体, 其ESBL编码质粒可在极低质量浓度抗生素胁迫甚至无抗生素胁迫下发生水平迁移和垂直迁移, 说明ESBL编码质粒的“适应性代价”较低.低“适应度代价”的抗性基因能更稳定地存在于细菌基因组中, 对于耐药性扩散具有更大的风险.

抗生素对接合转移的作用效果受到包括供受体菌株、抗性质粒结构、培养环境和计数方法等因素的复杂影响, 因此不同研究报道的亚MIC水平抗生素对接合转移的影响特性, 具有很大差异.例如, 已有研究证实了亚MIC水平的环丙沙星可显著促进接合转移[23], 但是Jutkina等[18]的研究显示亚MIC水平的环丙沙星对接合转移并无显著的诱导促进作用.本研究未发现亚MIC水平的四环素对ESBL编码质粒的接合转移有显著的诱导促进作用, 这与文献[20]存在矛盾.当ESBL编码质粒的供体为铜绿假单胞菌时, 5倍MIC水平的TC和CAZ共同暴露可显著提升接合转移的频率, 剂量-效应关系与文献[20]接近.因此, 亚MIC水平可能并不是抗生素显著诱导促进接合转移的充分必要条件.诱导抗生素与接合转移频率之间的剂量-效应关系具有一定的不一致性.

由于接合转移是耐药性扩散的重要途径, 抑制该过程被视为是控制耐药基因在环境微生物间扩散的有效途径[25].抑制原理可分为特异性和非特异性：非特异性抑制作用抑制了细菌的生长繁殖, 使得可接受抗性质粒的野生型细菌数量显著减少.当TC和CAZ质量浓度接近大肠杆菌受体MIC时所造成的抗性质粒接合转移频率相较于背景值的显著下降, 就属于非特异性抑制, 因为在该质量浓度的胁迫下, 大肠杆菌受体的生长繁殖受到了显著抑制.除典型抗生素和杀菌剂外, Kwapong等[26]的研究发现亚剂量异硫氰酸酯在质量浓度接近MIC时可对接合转移过程产生非特异性的抑制作用.特异性抑制指在不抑制受体细菌生长繁殖的前提下, 对质粒DNA的复制和转录, 或者对质粒接合转移系统的抑制作用.已有研究发现2-十六烷酸可以与第四分泌系统(T4SS)的ATP酶TrwD共价结合, 特异性抑制质粒的接合转移过程[27].当ESBL编码质粒的供体为大肠杆菌时, 本研究发现了TC在低于MIC两个数量级的亚剂量胁迫下, ESBL编码质粒的接合转移受到了显著抑制(图 8).TC对接合转移的抑制机制未见文献详述, 可能与抑制T4SS结构蛋白或与之密切联系的ATP酶的合成有关.因此, 本研究发现了TC对于ESBL编码质粒的接合转移同时存在促进和抑制的机制：低于MIC时相对背景值呈现抑制作用(图 8), 高于MIC一定范围时相较于MIC呈现相对的促进-抑制作用(图 6和图 7).

3.2 临床废水对环境微生物抗药性扩散的危害

临床废水对于环境细菌耐药性增强与扩散具有重要的影响作用.临床废水中携带的耐药性菌株随着地表和地下径流进入河流、水库等自然水体中, 其耐药性基因丰度可能会产生两种变化方向：一是由于自然水体中抗生素质量浓度低于临床废水, 耐药性基因在“适度性代价”的影响下丰度降低; 二是在自然水体中稳定存在并发生水平和垂直转移, 后者将导致耐药基因在自然水体宏基因组中的比重不断增加.

中国是抗生素使用大国, 亚MIC水平的抗生素残留陆续在各重要河流和水库中被检出.近年来, 杨俊[28]的研究发现, 苏州市不同功能区的河湖水环境最主要的抗生素污染为四环素类(13.41~1 322.0 ng ·L-1)和喹诺酮类(8.07~805.11 ng ·L-1), Jiang等[29]发现喹诺酮类(n.d~362.69 ng ·L-1, n.d指未检出)和β-内酰胺类(n.d~404.81 ng ·L-1)为青草沙水库中主要残留抗生素.此外, 亚MIC水平的喹诺酮类、磺胺类和四环素类抗生素在东江流域也被检出[30].除中国外, Tran等[31]通过对河内的主要湖泊检测, 同样发现了较低质量浓度的喹诺酮类抗生素残留(< 100 ng ·L-1), 而四环素类和β-内酰胺类抗生素残留则极少被检测到.亚MIC水平的抗生素对耐药性基因扩散具有重要作用：一是亚MIC水平的抗生素具有筛选富集耐药性突变细菌的作用; 二是亚MIC水平的抗生素作为一种诱导物质, 可诱导包括接合转移在内的各类基因水平迁移、耐药性突变以及同源重组过程.

作为ESBL编码质粒供体的铜绿假单胞菌和大肠杆菌, 均具备在上述河湖水环境中稳定存活并保持ESBL的表达能力.以磺胺类和四环素类为例, 在苏州河库、长江口和东江等中国重要水体中残留的磺胺类和四环素类含量, 大多低于受体大肠杆菌细胞对应MIC值的千分之一[32].在该质量浓度的胁迫下, ESBL编码质粒将以较高的频率在大肠杆菌细胞之间, 或铜绿假单胞菌与大肠杆菌之间, 发生接合传递, 使受体菌株增强对β-内酰胺类抗生素的抗药性.本研究未使用喹诺酮类抗生素诱导接合转移, 但是已有研究发现, 低于1/8 MIC水平的环丙沙星可显著提高大肠杆菌细胞通过接合转移接受外源质粒的频率[23].包括环丙沙星在内的喹诺酮类抗生素在自然水体中被广泛检出, 这为水体细菌获得ESBL编码质粒提供了良好的条件.铜绿假单胞菌是自然水体中耐药性基因的主要携带者之一, 并且由于适应能力极强, 在自然水体中广泛分布.本研究发现, 在接近MIC甚至超过MIC的抗生素质量浓度胁迫下, 受体大肠杆菌仍可以从铜绿假单胞菌获得ESBL编码质粒.上述结果发现了铜绿假单胞菌在提高环境细菌耐受高质量浓度的抗生素冲击负荷的作用.此外, 接合转移并不是ESBL基因水平传递的唯一途径, 因接合转移常常与整合子迁移紧密联系在一起[33].两者的接合会导致ESBL基因水平迁移的频率上升, 加速β-内酰胺类抗生素抗药性的扩散.

4 结论

(1) ESBL编码质粒具有较低的“适应性代价”, 可在极低抗生素胁迫下稳定存在和发生菌株间接合传递, 传递过程不受亚剂量SMZ胁迫的显著影响.

(2) 亚剂量抗生素胁迫下, 相较于铜绿假单胞菌供体, 大肠杆菌供体更易将ESBL编码质粒接合传递至大肠杆菌受体.

(3) 亚MIC的TC、SMZ、CAZ单一暴露和共同暴露均未对铜绿假单胞菌与大肠杆菌间ESBL编码质粒的接合传递起到显著的调节作用; 5倍MIC水平的TC、CAZ共同暴露对铜绿假单胞菌与大肠杆菌间接合转移有显著的诱导作用.

(4) 大肠杆菌供受体之间发生的ESBL编码质粒接合传递受到TC和CAZ的调节; 显著的接合转移过程仅发生在TC质量浓度低于0.03 mg ·L-1, CAZ质量浓度低于0.002 mg ·L-1时, 并可被TC显著抑制.

致谢: 本研究在新加坡国立大学(National University of Singapore, NUS)完成.作者感谢Department of Civil and Environmental Engineering的李文譞博士和毛飞剑博士在实验编排上提供的帮助, Lim Jit Xin在实验仪器准备方面提供的大量帮助.感谢上海交通大学的张小凡、张波和李彭老师提供的指导与帮助.

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