2019, Vol. 40
2. 浙江省林业科学研究院, 杭州 310000
2. Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310000, China
沉水植物在生态系统中处于初级生产者的地位, 主要通过自身的代谢和微生物的共同作用吸收富营养化水体中的氮、磷等有害物质, 同时抵制低等藻类的生长[1, 2].沉水植物关联的微生物主要栖息于植株表面与内部.一些研究认为：水体中有机物的降解和氮化合物的脱氮、磷化合物的转化等主要是由沉水植物表面附着的微生物活动来完成[3], 尤其是细菌, 由于其在植物表面环境中对各种分泌物的利用率和敏感性远远超过放线菌、真菌、藻类和原生动物等[4].已有研究也证实, 内生细菌能够有效地表达必要的新陈代谢基因, 能促进异型生物质和植物体内有害物质的降解, 在植物修复、水体净化和污染土地治理等方面扮演重要角色[5].因此, 研究沉水植物处理污水系统中植物关联细菌的群落组成, 对深入探讨沉水植物的净化功能及机制具有十分重要的意义.
目前, 关于不同沉水植物对水体污染物净化效果的相关研究较多[6, 7], 而对其净化效果中微生物作用的相关研究较少.何聃等[8]的研究表明沉水植物附着细菌主要包括拟杆菌(Bacteroidetes)、放线菌(Actinobacteria)、变形菌、蓝藻细菌(Cyanobacteria)和疣微菌(Verrucomicrobia)等门类. Eriksson等[9]的研究表明篦齿眼子菜表面附着细菌的脱氮作用明显, 其反硝化能力可以在高营养条件下得到极大地提高, 并且受光照、水流和植物年龄的影响.在水生生态系统中, 常见功能植物内生细菌假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、微杆菌属(Microbacterium)、固氮螺菌属(Azospirillum)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)和无色杆菌属(Achromobacter)等对氮、磷、硫和有机复合物具重要的降解作用, 并有助于植物修复[10].本文选取亚热带地区8种常见的沉水植物为研究对象, 分析不同沉水植物对水体氮磷的去除能力与植物关联细菌类群之间的相关性, 以期为水生态修复工程中沉水植物种类的筛选提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验材料野外采集杭州地区分布的8种常见沉水植物苦草(Vallisneria natans)、密刺苦草(Vallisneria denseserrulata)、黑藻(Hydrilla verticillata)、伊乐藻(Elodea canadensis)、金鱼藻(Ceratophyllum demersum)、竹叶眼子菜(Potamogeton malaianus)、篦齿眼子菜(Potamogeton pectinatus)和微齿眼子菜(Potamogeton maackianus), 选择生长状况良好且性状统一的成熟植株作为研究对象.
1.2 试验方法2018年7月初在浙江省林业科学研究院试验大棚内将供试的沉水植物用清水预培养15 d, 使其适应生长的环境.然后选用长势良好且性状一致的植株, 将其清洗干净并用海绵吸走多余的水后, 种植于40 L圆底白色聚乙烯塑料桶.试验共设置9组, 每组为3个重复.每种植物为一组, 每个容器内放入105 g植物, 5 kg石英砂(桶内厚度约5 cm)以固定根系.其中空白对照组每个桶内只放石英砂不放植物.
本试验用水采自上埠河(浙江工业大学内, 位点120°02′24″E, 30°13′48″N), 原水中TN含量为2.56mg ·L-1, TP含量0.22mg ·L-1.在原水中加入(NH4)2SO4和KH2PO4试剂, 使水中TN含量为5.10mg ·L-1, TP含量为0.53mg ·L-1, 达到《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)劣Ⅴ类标准.每个试验桶内加入35 L配制好的污水.
本试验从2018年7月16日开始到8月20日结束, 每隔一周采一次样.在水面下20 cm处采200 mL水样, 共采5次.采样消耗的水用配好的污水补充, 因蒸发消耗的水用蒸馏水补充到原水位高度.最后一次采样结束后, 将每个桶内植物全部捞出吸取表面水分, 进行称重, 烘干, 计算含水率.同时采集每个桶内沉水植物的根、茎、叶部位, 将其放在-80℃冰箱保存, 用于细菌高通量测序.
1.3 测定指标及方法 1.3.1 水质和植物样品指标测定水体TN用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[11], TP采用ICP-OES法直接进样测定[12], 植物样品中用浓硝酸(优级纯)消解, 植株全氮采用全自动凯氏定氮仪测定；植物总磷采用ICP-OES法进样测定[12].
1.3.2 植物关联细菌群落组成分析方法取-80℃保存的新鲜沉水植物的每个样品500 mg左右, 直接加入2 mL研磨离心管, 在预处理好的样品中加入3颗钢珠, 然后液氮冷冻, 核酸破碎仪上振荡45 s, 再按照M5635-02试剂盒(OMEGA, USA)的操作说明进行DNA提取, 细菌16S rRNA采用V3-V4区引物进行PCR扩增, 测序结果用QIIME软件剔除疑问序列.然后用Uparse软件对有效数据在97%水平上进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类.在QIIME中调用UCLUST这一序列对比工具与序列数据库Greengene进行比对, 获得每个OTU代表序列的分类学信息并剔除植物体叶绿素等干扰因素.再基于分类学信息, 进行群落结构的统计分析. 8组样品分别用名称的前两个汉字的首字母表示, 即苦草(KC)、密刺苦草(MC)、黑藻(HZ)、伊乐藻(YL)、金鱼藻(JY)、竹叶眼子菜(ZY)、篦齿眼子菜(BC)和微齿眼子菜(WC).
1.4 数据处理方法采用SPSS18软件对数据进行统计分析, 采用Duncan法进行差异显著性检验, 用Origin8.5软件作图.
该研究通过测定水体TN和TP浓度、植物鲜干重、植株TN和TP含量来计算水体TN、TP去除率(η1), 沉水植物体TN、TP富集吸收率(η2), 自然挥发、沉降等其他作用对TN、TP去除率(η3)及沉水植物增效作用对TN、TP去除率(η4).
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经过35 d的生长, 不同沉水植物的鲜干重均有明显增长(表 1).其中密刺苦草的鲜重增加最多为25.30 g, 篦齿眼子菜的鲜重增加最少为5.30 g.净增干重最多的苦草(2.80 g)是最少的篦齿眼子菜(0.78 g)的近3.6倍.不同沉水植物含水量的结束状态与初始状态相差不大, 变化范围为87.20%~91.80%. 8种沉水植物试验结束状态的植株氮、磷含量略高于起始状态.
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表 1 8种沉水植物鲜干重及植物氮、磷含量变化1) Table 1 Changes in fresh and dry weight and nitrogen and phosphorus contents of eight submerged macrophytes |
2.1.2 不同沉水植物处理的水质氮磷浓度变化
本试验供试的沉水植物都能有效地去除污水中的氮, 使水中总氮明显下降(图 1), 其中密刺苦草和金鱼藻的去除效果较好, 去除率达91.58%和91.27%.微齿眼子菜的去除效果最差, 去除率为79.41%.
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用字母表示同一时间段不同沉水植物水体中氮磷含量统计分析的显著性, 相同字母表示不显著, 不同的字母表示在P=0.05水平上显著, 下同 图 1 不同沉水植物生长体系水体总氮含量变化 Fig. 1 Total nitrogen content of water in different growth systems of submerged macrophytes |
8种沉水植物对水体中总磷的去除效果较明显(图 2).密刺苦草和黑藻对水体中总磷的去除效果最高, 去除率达96.81%和95.55%.篦齿眼子菜对TP的吸收效果较差, 去除率为80.89%.
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图 2 不同沉水植物生长体系水体总磷含量变化 Fig. 2 Total phosphorus content of water in different growth systems of submerged macrophytes |
通过对水体中TN和TP去除率(η1)的分析, 认为水体中氮磷去除率由植物富集吸收率(η2)、其他作用去除率(η3)和植物增效去除率(η4)这3部分组成(表 2).不同沉水植物对水体中TN、TP的去除率存在差异, 但均高于空白组.其中密刺苦草组对水体中TN和TP的去除率最高, 伊乐藻组和金鱼藻组的植物富集吸收率高于其他组, 密刺苦草和苦草的植物增效去除率最高.
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表 2 8种沉水植物水体TN、TP去除率和各种作用去除率/% Table 2 Removal rates of TN and TP and removal rates of various functions in eight submerged macrophytes/% |
2.2 沉水植物体菌群多样性组成结果分析 2.2.1 不同沉水植物体细菌群落多样性
Illumina测序结果显示, 24个样本所测得苦草组OTU数最多(1 742), 伊乐藻组的OTU数最少(816).苦草组中细菌丰富度和多样性均高于其他组, 金鱼藻的细菌丰富度和多样性在所测得沉水植物组中最低(表 3).
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表 3 不同沉水植物的细菌丰度与多样性(平均值±标准误差) Table 3 Bacterial abundance and diversity of different submerged macrophytes (mean±SE) |
2.2.2 PCA主成分分析
通过主成分分析, 不同沉水植物间的样本表现出分散或聚集的分布情况(图 3).第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)贡献率累计达96.99%, 解释了原始数据中的大多数差异.黑藻、金鱼藻、伊乐藻、竹叶眼子菜、篦齿眼子菜和微齿眼子菜都聚集在一起, 表明这6种沉水植物间的细菌群落结构相似度较高.与其他组相比, 苦草和密刺苦草的分布较集中, 表明这两组的细菌群落也具有较高的相似度.
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图 3 不同沉水植物细菌群落主成分分析 Fig. 3 Principal component analysis of bacterial communities in different submerged macrophytes |
本研究采集了8种沉水植物共24个样品, 共检测到23个门, 64个纲, 118个目, 214个科, 488个属的细菌种类.在门的分类水平上, 不同沉水植物之间的细菌群落组成相似, 主要来自7个门类(表 4).变形菌门为8种沉水植物的绝对优势菌门, 丰度值范围为40.2%~84.6%.苦草组、密刺苦草组和黑藻组的细菌在7个细菌门类中都有分布且丰度值都大于1%.
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表 4 8种沉水植物主要优势门类/% Table 4 Main dominant phyla of eight submerged macrophytes |
选取每个样品在属水平上最大丰度前20的物种, 生成物种相对丰度柱形图(图 4).贪铜菌属(Cupriavidus)、红细菌属(Rhodobacter)和芽单胞菌属(Gemmatimonas)为8种沉水植物共有的优势属(丰度>1%), 其中贪铜菌属的相对丰值较高, 丰度值范围为4.5%~34.2%, 在金鱼藻组中的丰度值最高.
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图 4 属水平细菌群落组成 Fig. 4 Bacterial community composition at the genus level |
为了筛选出不同沉水植物从门到属具有显著差异的关键物种类群, 进行了LEfSe分析(表 5). 8种沉水植物共有103个具有显著性差异的不同水平的物种类群.其中, 密刺苦草组和苦草组中具有显著差异的分类单元最多.密刺苦草组共有55个, 苦草组有32个, 且大多都分布于变形菌门.
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表 5 组间具有显著差异的分类单元1) Table 5 Classification units with significant differences between groups |
3 讨论 3.1 不同沉水植物对水体中氮磷净化效果的分析
有研究表明, 水体中氮磷的去除主要依靠植物直接吸收、物理作用和微生物作用等途径去除[13~15], 从试验结果看, 8种沉水植物对TN、TP的富集吸收率范围分别为1.65%~15.69%和1.51%~17.95%, 植物体内对氮磷的富集主要是通过植物体直接吸收水中氮和磷, 并且同化为自身的结构组成物质, 适时地转化到植物体内.其他作用TN和TP的去除率分别为41.76%和43.13%.其他作用对氮磷的去除主要依靠物理作用, 包括筒壁、石英砂的吸附和沉淀作用, 而水体中氮的去除除了这些途径外, 还存在氨的挥发作用.不同沉水植物系统扣除植物体直接吸收和其他作用去除后, 水中氮磷的植物增效去除率范围为33.45%~47.14%和32.35%~50.21%, 主要通过沉水植物分泌凝胶物质加速吸附水中的物质形成附着层, 增加植物体表微生物的数量, 植株表面附着的微生物和内生菌共同起到降解水中氮磷的作用[16].结果表明沉水植物对水体氮磷的吸收主要通过沉水植物增效作用, 自身吸收富集作用只占很小的比例.这一结论在其他研究中也被证实[17].
对不同沉水植物的水体净化效果进行分析, 8种沉水植物对水体中TN的吸收效果依次是密刺苦草>金鱼藻>黑藻>伊乐藻>苦草>竹叶眼子菜>篦齿眼子菜>微齿眼子菜.对水体中TP的净化效果表现为：密刺苦草>黑藻>苦草>金鱼藻>伊乐藻>竹叶眼子菜>微齿眼子菜>篦齿眼子菜.其中伊乐藻、金鱼藻对水中氮磷自身吸收能力高于其他组, 密刺苦草和苦草的植物增效作用的净化能力较强.刘丹丹等[18]和杨文斌等[19]研究表明金鱼藻、伊乐藻都具有较强的吸收富集能力, 本文研究结果与此相似, 试验期间伊乐藻和金鱼藻的水体透明度较高.孔祥龙等[20]的研究表明苦草属的植物对水体中氮磷具有较强的净化能力, 与文中结论相似.
3.2 不同沉水植物体细菌群落组成与水体中氮磷净化效果之间的关系为了更深入地研究水体净化过程中微生物的作用, 通过高通量测序对供试的8组24个样品的沉水植物进行了细菌16S rRNA基因测序, 共得到8995个OTU, 表明8种沉水植物体中存在丰富的微生物, 这些微生物不仅数量众多, 也具有较高的多样性.本研究中8组沉水植物样品中优势门类为7个.主要优势菌门是变形菌门和蓝藻门, 相对丰值较高菌门还有放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门和酸杆菌门. van der等[21]的研究表明, 在浮游藻类占优势的藻型湖泊(浑浊态)中蓝藻门的含量较多, 而在以水生植物为主体的草型湖泊(清水态)中则是拟杆菌门更占优势.本研究结果表明, 与其他处理组相比金鱼藻组中蓝藻门的丰度值较低, 水体较清澈.许多研究表明[22, 23]变形菌门的细菌参与了湖泊生态系统中各种生物地球化学循环过程, 变形菌门是湖泊生态系统中的绝对优势菌群.本次研究中变形菌门的丰度值范围为40.2%~84.6%, 也证明了这一观点. Fuentes等[24]的研究结果表明, 属于厚壁细胞门类的细菌可以有效地降解多氯联苯和石油烃类化合物等有机污染物.酸杆菌门被认为能够参与各种环境污染物的生物降解过程[21].本研究中沉水植物的大多数优势门类细菌都对水中的污染物有降解作用, 在对水体总氮总磷的分解代谢过程中起着十分重要的作用.
在细菌属水平上比较所有样本发现, 贪铜菌属、红细菌属和芽单胞菌属的相对丰度值超过了1%.目前, 有报道指出贪铜菌属是一种很少见的耐重金属的细菌, 主要应用在环境污染物的降解方面.沈娥[25]探讨了贪铜菌属Cupriavidus sp. SHE在对吲哚等芳香族化合物降解方面的研究.红细菌属在各个样本中占一定的优势.有研究报道, 隶属于这个属的细菌在生物膜的形成过程中发挥了关键作用[26], 这些细菌在维持河湖生态系统的稳定性等过程中发挥着至关重要的作用.芽单胞菌属于革兰氏阴性菌, 繁殖通过出芽方式, 对有机物的去除有积极作用[27].
本试验条件下各处理组的微生物群落结构存在差异, 由PCA主成分分析可知, 苦草组、密刺苦草组与其他沉水植物组细菌群落组成差异显著. LEfSe分析结果表明, 密刺苦草组和苦草组中具有显著差异的菌群数量最多, 而且水样测定结果表明密刺苦草和苦草的植物增效的净化能力高于其他组.密刺苦草中具有显著差异的菌群数量共55个, 大多分布于变形菌门.根瘤菌(属于α-Proteobacteria)是通过与豆科植物根系共生, 在植物根部形成根瘤共生体, 在利用植物根系分泌物的同时通过固氮作用为植物提供氮素[28]. Moulin等[29]提出伯克霍尔德氏菌属和贪铜菌属是归属于β-变形杆菌纲的根瘤菌, 也有固氮作用.李辉等[30]的研究表明, 人工湿地去除有机氮主要由于氨化细菌的作用, 而芽孢杆菌属(属于厚壁菌门)为人工湿地中氨化细菌的优势菌属.李科德等[31]认为产碱杆菌属(属于β-Proteobacteria)和黄杆菌属(属于拟杆菌门)等快生型细菌在有机污染物的分解代谢中起着十分重要的作用.由此可以推断密刺苦草组引起水体中氮磷降解的关键物种分布于根瘤菌目、伯克霍尔德氏菌目、黄杆菌目、产碱杆菌科、贪铜菌属和芽孢杆菌属.苦草组中具有显著差异的分类单元是32个, 集中分布于变形菌门、拟杆菌门、栖热菌门和酸杆菌门.李卫华等[32]提到反硝化细菌分布于变形菌门, 除了δ-Proteobacteria纲外, 其余的α、β、γ和ε这4个纲都含有反硝化菌.王莉等[33]的研究表明α-变形菌纲生丝微属菌株Hyphomicrobium sp. MAP-1对甲胺磷、乙酰甲胺磷和水胺硫磷污染的土壤有修复能力.丛毛单胞菌科(属于β-Proteobacteria)中大部分菌属可分解污染物, 氨氮、酚类物质、碳氮等营养因子对该菌科的生长繁殖均产生影响[34].有研究表明特吕珀菌科属于异常球菌纲栖热菌门, 能在碱、盐及高温的条件中生长, 在堆肥过程中产生固氮酶, 参与固氮过程, 同时可利用多种糖类、有机酸和氨基酸[35].腐螺旋菌科可以降解活性污泥中的蛋白质[36].由此得出苦草组中异常球菌纲、丛毛单胞菌科、腐螺旋菌科和生丝微菌属的细菌具有降解作用, 因此推断这些菌种可能是引起苦草组水体中氮磷降解的关键物种.
4 结论(1) 8种沉水植物都对水体中TN、TP有明显的净化效果.其中密刺苦草组对水体中TN、TP的去除率最高, 伊乐藻组和金鱼藻组的植物富集吸收率高于其他组, 密刺苦草和苦草的植物增效去除率最高.
(2) 8种沉水植物关联细菌的绝对优势菌门为变形菌门(丰度值均大于40%).贪铜菌属、红细菌属和芽单胞菌属为不同沉水植物共有的优势属.这些细菌类群大多具有降解作用, 可能是引起沉水植物对水体中氮磷净化能力较强的主要原因.
(3) 由PCA主成分分析可知, 密刺苦草组、苦草组与其他沉水植物组的细菌群落结构相似度不高. LEfSe分析结果表明, 密刺苦草组和苦草组中具有显著差异的菌群数量最多, 其中根瘤菌目、伯克霍尔德氏菌目、黄杆菌目、产碱杆菌科、贪铜菌属和芽孢杆菌属的细菌可能是引起密刺苦草增效的净化能力较强的优势菌群; 异常球菌纲、丛毛单胞菌科、腐螺旋菌科和生丝微菌属的细菌可能是引起苦草增效的净化能力较强的优势菌群.
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