2019, Vol. 40
渭河是黄河的最大支流, 流域面积为13.48万km2, 河流长度818 km.是陕西、甘肃、宁夏地区的“母亲河”[1].然而, 由于社会经济快速发展及人口数量逐年增加, 渭河流域生态环境遭到严重破坏, 许多地区丧失其作为饮用水源地、养育水生生物、水体自净等功能.经相关方案的实施[2], 渭河流域陕西境内进行了综合整治, 水体环境有所改观, 但流域水体健康安全方面尚缺乏数据支撑.
当前关于流域水体健康的研究主要集中在典型污染物、重金属的分布及控制, 水环境承载力评价以及浮游动植物、藻类群落结构与环境因子关系方面[3~7].白海峰等[8]利用典范对应分析(CCA)得出, 驱动渭河流域内浮游动物群落形成的水环境因子主要为水温、饱和度、流量和pH.闵文武等[9]采用MRPP(多相应置换过程)及CCA技术对渭河流域不同水期浮游植物群落组成和空间结构进行分析, 得出浮游植物群落结构具有较明显的时空差异, 并分析了主要影响群落结构的环境因子.殷旭旺等[10]探讨了渭河流域着生藻类的群落结构与水环境理化因子相互关系, 并用完整性评价指数(P-IBI)评价渭河流域水生态系统健康状况.也有研究报道了渭河综合治理后水沙变化条件对菌群特征的影响[11], 但对流域细菌群落及代谢功能预测的报道较少.
事实上, 细菌作为水生生态系统中重要的组成部分, 在水生态功能指示及水体自净过程中起到极为重要的作用[12].随着水体环境更替与改变, 水体细菌群落结构及分布也会发生变化, 其生态功能也会受到影响[13].目前, 16S rDNA PCR-DGGE和16S rRNA高通量测序分析技术被用来研究细菌群落结构特征及其关键驱动因子.薛银刚等[14]认为营养盐水平、水温和pH值均能影响沉积物细菌群落结构, NO3--N和水温是微囊藻属的主要影响因子.水体中细菌大量繁殖, 死亡解体释放的内毒素会威胁水环境健康, 致使机体产生病理生理反应[15]. Pham等[16]报道蓝藻毒素对淡水生态系统构成重大的、全球性的环境威胁, 被藻毒素污染的水体可能会导致食物链污染, 对生态健康造成相当大的风险.
因此, 探讨渭河流域水体细菌与水环境因子的响应关系, 探究其生态代谢功能, 对流域水环境治理及水体健康的可持续发展意义重大.本研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术获取综合治理后渭河流域陕西段(从宝鸡峡水库至潼关段)水体中细菌群落结构信息, 分析水体中细菌群落结构的空间分布规律; 通过RDA技术分析细菌群落与关键环境因子之间的相关性, 以揭示水质参数与细菌分布的内在联系; 基于细菌菌群的代谢功能的预测与评价, 解析细菌菌群可能对环境和生物健康产生的生态影响, 以期为渭河流域水环境健康发展提供理论支撑.
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理渭河发源于甘肃省渭源县鸟鼠山, 流域涉及甘肃、宁夏和陕西三省(自治区), 流域面积约13.5万km2.渭河支流繁多, 尤其是北岸拥有较多较大的支流, 有14条的支流的集水面积超过1000 km2.渭河流经陕西境内的主要城市有宝鸡、咸阳、西安和渭南等.基于水质监测及河流采样点布设原则, 结合渭河流域陕西境内水环境现状, 对流域微生物采样点进行优化布设, 具体如图 1所示, S1~S7采样点分别取自宝鸡峡渭河大桥、石头河入渭口后、咸阳上林大桥、皂河、灞河入渭口下游、灞河特大桥和渭河入黄河前, 涵盖了渭河流域典型支流及水环境特征.
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图 1 渭河流域采样点布设分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling points in the Weihe River Basin |
水样于2017年7月中旬采集.使用采水器在水面下20 cm处取1 000 mL水样, 临时保存在4℃以下的保温箱, 直至运送到实验室.在无菌条件下, 使用0.45 μm聚醚砜滤膜过滤截留水样中的细菌, 将过滤的滤膜保存在-20℃以下, 直至进行细菌群落测序.样品预处理过程均在无菌环境中进行, 避免外界细菌对细菌样品的污染.
1.2 细菌DNA的提取及PCR扩增 1.2.1 DNA的提取水样中细菌DNA提取采用PowerWater® DNA Isolation kit试剂盒(强力水样DNA提取试剂盒, 深圳市安必胜科技有限公司), 详细步骤参考试剂盒提取说明.提取并纯化后的DNA样品采用Nanodrop(NC2000, Thermo Scientific)、荧光光谱仪(DC2000, Thermo Scientific)、凝胶电泳仪(DYY-6C, 北京六一)和TBS380荧光计(E6090, PROMEGA)分别进行紫外定量、荧光定量、浓度和纯度检测, 纯度及浓度达到检测要求方可进行后续基因PCR扩增及测序, 且DNA样品应储存在-20℃直至进一步分析.
1.2.2 PCR扩增采用聚合酶链反应(PCR)(2720, ABI), 采用带Barcode的特异引物5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′和5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′对16S rRNA的V4~V5区扩增引物进行扩增. PCR扩增过程：98℃初始变性2 min, 98℃变性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 72℃最终延伸5 min. PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后, 用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒进行回收.使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit构建测序文库, 文库经Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit定量和Agilent Bioanalyzer 2100系统质检合格后, 在Illumina HiSeq 2500平台(上海派森诺生物科技股份有限公司)上进行高通量测序.
1.3 水体理化指标测定对渭河流域陕西段7个采样点的水体理化性质进行测定, 测定指标有水温、pH、DO、TOC、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TP.其中, 水样水温、pH和DO采用便携式多参数水质测定仪(HQ30d, HACH, USA)现场测定, 水样TOC采用TOC分析仪测定, NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TP的测量方法遵循文献[17]的方法.
1.4 测序数据处理采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序, 原始双端测序数据经滑动窗口法进行质量筛查, 质量合格后使用FLASH软件(v1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对样品进行reads配对连接.运用Qiime软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.0, http://qiime.org/)识别疑问序列, 调用Usearch(v5.2.236)检查并剔除嵌合体序列.
调用Qiime软件中的Uclust工具, 对优质序列按相似度97%进行OTUs划分.在Qiime中将OTUs代表序列与对应数据库的模板序列相比对, 获取每个OTU所对应的分类学信息.注释数据库为：Greengenes数据库(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/); RDP(Ribosomal Database Project)数据库(Release 11.1); Silva数据库(Release115); UNITE数据库(Release 5.0).去除掉丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTUs和稀有OTUs, 得到用于后续分析的OTUs丰度矩阵.
根据最低测序深度对OTU丰度矩阵中的样本进行随机重抽样.在Qiime软件中, 利用校正测序深度后的OTUs计算每个样品的Chao、ACE、Shannon和Simpson多样性指数.
1.5 PICRUSt功能预测分析PICRUSt是由美国哈佛大学的Curtis Huttenhower课题组开发的菌群代谢功能预测工具.对已测微生物和其它未测物种基因组的基因功能谱进行推断, 构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱[18].将测序得到的16S rRNA基因序列数据与Greengenes数据库比对, 找出最为相近的基因序列归为参考OUTs, 并根据上述基因序列的rRNA基因拷贝数校正OTUs丰度矩阵.通过将现有的16S rRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库相对比, 实现对细菌代谢功能的预测.具体分析步骤基于在线平台(http://picrust.github.io/picrust/).
1.6 数据分析利用Canoco5.0软件对细菌群落物种信息进行去趋势对应分析(detrended correspondence analysis, DCA), 并结合IBM SPSS Statistics 22分析细菌群落结构和水环境因子间的相关性. R2为相关系数, P为显著性.
2 结果与讨论 2.1 渭河流域陕西段水质现状分布特征表 1为渭河流域7个采样点水体基本水质指标分布状况, 水体的温度分布在20.0~23.0℃, 溶解氧(DO)分布在6.58~9.07mg ·L-1, 且pH在6.8~7.9之间, 水体基本呈现中性或弱碱性.渭河流域水体水质指标显著高于文献[19]中Ⅴ类水体标准, 主要是氮超标严重(Ⅴ类水TN为2.00 mg ·L-1). S4和S6的TOC质量浓度显著高于其他采样点, 且S4的NH4+-N、TN和TP质量浓度远高于其他采样点, 均达到劣Ⅴ类.这主要由于皂河本身水环境恶化严重, 出现黑臭现象, 同时灞河属于城市的纳污河, 水体水质状况一直存在超标问题.流域各个采样位置的NO3--N浓度均高于地表水Ⅴ类水TN的限值, 这主要与水体的DO分布(DO≥5.58mg ·L-1)和细菌的硝化过程有关[20].
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表 1 渭河流域陕西境内7个采样点水体水质现状指标 Table 1 Water quality factor table for seven sampling points in the Weihe River Basin of Shaanxi |
2.2 细菌群落多样性分析
细菌群落的丰度、丰富度可以统一称为微生物的相对丰度, 可用Chao1和ACE等相关指数表征[21].表 2为渭河流域各采样点微生物多样性指数分布结果, 其中Chao1和ACE指数越大表示丰富度越高, Shannon和Simpson指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度, 指数值数值越高表明群落的多样性越高. OTUs、Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数表明, 沿着河流流向水体中细菌多样性未呈现出规律性, 多样性高低顺序为S5＞S2＞S7＞S1＞S6＞S3＞S4. S5位置的细菌Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数明显高于其他采样点, 表明S5采样点的细菌相对丰度及多样性最高, 这可能与灞河水体严重富营养化有关.然而, S4的细菌4个指数显著低于其他采样点, 主要由于皂河水体呈现黑臭现象, 细菌的生长代谢活动可能受到抑制.
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表 2 渭河流域水体细菌多样性指数 Table 2 Microbial diversity index for water bodies in the Weihe River Basin |
2.3 细菌群落结构的空间分布规律 2.3.1 流域水体细菌群落结构分布
图 2为渭河流域各水样细菌在门水平的相对丰度分布结果, 其中门水平最高可到34门.变形菌门(Proteobacteria)相对丰度(24.1%~42.1%)显著高于其他门类, 属于优势菌群, 其他的主导菌群依次为放线细菌门(Actinobacteria, 16.3%~37.9%)、蓝藻门(Cyanobacteria, 4.5%~37.9%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 1.7%~14.3%)、浮霉菌门(Planctomycetes, 0.1%~14.0%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 0.6%~11.9%)、绿菌门(Chlorobi, 0.1%~4.7%).这与水环境中细菌群落结果基本相似[22].
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图 2 样品细菌群落结构分布 Fig. 2 Distribution of the microbial community structure in the water samples |
在门分类水平上, S1~S7水样的菌群落丰度分布有所差异. S2的变形菌门相对丰度最高, S3的放线细菌门和拟杆菌门相对丰度最高, S4的蓝藻门相对丰度最高, S7的浮霉菌门相对丰度最高.变形菌门类细菌可以去除水体中磷, 并将亚硝酸盐转化为硝酸盐[23]; 放线菌由于其具有独特的物质代谢功能, 对水生态修复及水质净化有很好地促进作用[24]; 蓝藻门是水体富营养化主要指示生物[25]; 浮霉菌门属于氨氧化细菌, 可直接将NH4+-N转化为N2[26]; 拟杆菌门细菌属革兰氏阴性菌, 对恶劣环境的耐受性较差[27].各个样品中均具有相对较高的蓝藻门的分布, 表明渭河流域存在潜在富营养化的风险.这些细菌的分布主要与流域水体水质及环境状况相关.
2.3.2 功能型细菌分布规律变形菌门、放线菌门和蓝藻门在水质修复及水环境现状方面具有重要的作用, 图 3为流域水体3种主要功能型细菌在纲水平的分布结构.水样变形菌门中有：α变形菌纲(α-Proteobacteria)、β变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ变形菌纲(γ-Proteobacteria)、δ变形菌纲(δ-Proteobacteria)和ε变形菌纲(ε-Proteobacteria), β变形菌纲相对丰度(8.7%~32.4%)显著高于其他纲类的变形菌. α变形菌纲、β变形菌纲与脱氮除磷过程有关[28], 且β变形菌纲是生长和代谢阶段中质子和电子的主要供应者[29].而S4点的这两类变形菌纲含量低于其他采样点, 说明在该采样点能起到脱氮除磷效果的菌群较少, 而从水样检测上也看出, S4采样点总氮、总磷均高于其他采样点, 进一步说明细菌群落与水体健康之间存在关联.
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图 3 典型功能型细菌群落在纲类的分布 Fig. 3 Distribution of the typical functional bacterial communities by class |
放线菌门作为水体净化重要微生物, 其纲水平分布结果如图 3(b)所示. 7组水样中放线细菌纲(Actinobacteria)是放线菌门丰度最大的菌群, 其相对丰度约占10.6%~30.8%, 嗜热油菌纲(Thermoleophilia)的丰度较低, 在S1~S3水样中几乎不存在, S4~S7水样中仅占0.1%~0.5%. S3点的放线细菌纲的丰度最高(37.9%), 这表明S3区域水环境生态修复及净化效果较优, 主要由于该位置处于咸阳市中心, 可能是水环境生态修复治理力度较大, 从而使得水环境净化效果较好.蓝藻门对水质污染具有指示作用, 其在纲水平的分布沿河流呈现先降低后升高的趋势, 而皂河(S4)和灞河(S6)的蓝藻相对丰度(37.9%和30.3%)显著高于其他点, 这与皂河的水环境现状密切相关.
2.4 细菌群落与关键环境因子相关性分析细菌功能及多样性与环境因子之间的联系对于促进水生生态系统健康和恢复力的发展至关重要, 为此, 本研究利用Canoco5.0软件对渭河流域水体中细菌门分类水平丰度进行除趋势对应分析, 结果显示特征值分部部分的梯度长度值小于3, 故选择线性模型RDA分析细菌群落结构与环境因子间的响应关系, 结果如图 4所示.所分析的环境因子中TOC、TN、TP、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐与温度呈现正相关, 其相关系数分别为0.65、0.86、0.89、0.66、0.67和0.49, 达到显著正相关(P < 0.05), 与DO和pH均呈负相关, 相关系数-0.71和-0.52, 达到显著差异水平(P < 0.05).这些相关性分析进一步解析了渭河流域细菌群落结构与水质间的响应关系.
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图 4 水体细菌群落与关键环境因子的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of the bacterial communities and the key environmental factors of the water samples |
从细菌与环境因子关联性上来看, 第一象限中, 变形菌门与温度、TP、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TOC之间呈显著相关关系(P < 0.05), 与pH、DO呈负相关关系.第二象限中, 拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门与NO2--N、NO3--N、TN、pH和DO呈正相关关系, 与NH4+-N、TOC和TP之间呈负相关关系.第三象限中, 浮霉菌门与NH4+-N、TOC和TP呈正相关关系, 与温度、TP、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN、pH和DO呈负相关关系.第四象限中, 蓝藻门与TOC、NH4+-N、TP、温度、TN、NO2--N和NO3--N呈正相关关系, 与DO、pH呈负相关关系.从水体水质分析可得, 渭河流域S4、S6的表层水体中TOC、NH4+-N、TP和TN含量较高, 且蓝藻门丰度较高, 表明水体中蓝藻门细菌生长繁殖旺盛, 水体富营养化情况严重; 此外, 蓝藻生长繁殖消耗水中溶解氧, 这也是导致S4水体溶解氧浓度较低的原因.刘睿等[11]通过RDA分析, 得出渭河流域丰水期水体中氮磷比、NH4+-N、TSS、pH、碳氮比(DC/DN)和PCY对细菌群落变化解释度最高.这与本节得出的关键环境因子是氮磷营养盐(NH4+-N、TP、TN、NO2--N和NO3--N), 4轴对细菌群落变化解释度很高(99.27%)的分析结果一致.
2.5 细菌菌群生态功能预测为获取渭河陕西段水体细菌的功能, 本研究采用PICRUSt软件进行了预测.当前基于高通量测序的PICRUSt功能预测分析的相关研究主要通过微生物群落的16r RNA基因序列与以生物代谢通路分析为核心的KEGG数据库进行对比, 进而推测细菌群落的代谢功能[30~32].本研究利用该软件的功能, 初步探讨了水体细菌菌群致病程度及其对生物体系统的影响, 结果如图 5所示.
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A:癌症; B:免疫系统疾病; C:传染性疾病; D:新陈代谢疾病; E:神经退行性疾病; F:心血管疾病; G:消化系统; H:内分泌系统; I:环境适应系统; J:免疫系统; K:神经系统; L:感觉系统 图 5 细菌菌群生态功能预测分布 Fig. 5 Distribution of the predicted ecological functions of the identified bacteria |
图 5对渭河流域细菌菌群致病程度进行了预测, 主要关注的细菌菌群导致的疾病包括:神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)、新陈代谢疾病(metabolic diseases)、传染性疾病(infectious diseases)、免疫系统疾病(immune system diseases)、心血管疾病(cardiovascular diseases)和癌症(cancers).在7组水样中, 致使传染病的细菌菌落平均丰度最高, 致使心血管疾病的细菌菌落平均丰度最低, 这表明渭河流域水体致使人类患传染性疾病的风险较大, 应加强传染性疾病的预防措施.
图 5为使用PICRUSt分析渭河流域细菌菌群对生物体系统的影响, 主要分析了对生物体的感觉系统(sensory system)、神经系统(nervous system)、免疫系统(immune system)、环境适应系统(environmental adaptation)、内分泌系统(endocrine system)和消化系统(digestive system)这6大系统的影响结果.从中可以看出, 7组水样中细菌菌群对生物体的内分泌系统可能存在较大影响, 对感觉系统影响最小.这表明渭河流域的水体生态治理中应注重显著影响生物体内分泌系统的细菌, 为维持生态系统平衡提供技术与理论支撑.
3 结论(1) 利用Illumina MiSeq高通量测序平台, 对渭河流域地区的7个采样点的水样进行测序, 得出水样细菌的多样性高低顺序为S5＞S2＞S7＞S1＞S6＞S3＞S4. S4水体中蓝藻门细菌群落丰度最大, 而S6水体中拟杆菌门细菌群落丰度很大.
(2) 蓝藻门与水体TP、NO2--N、NO3--N、TN、TOC等呈正相关, 放线菌门、变形菌门与NO2--N、NO3--N、TN之间也呈正相关, 这些相关性解释了渭河流域水质分布的规律.
(3) 在渭河流域水体中微生物引起患传染性疾病发生的风险较高, 且微生物可能会对生物体的内分泌系统产生较大的影响, 因此关于渭河流域的水环境生态健康应关注微生物可能存在的潜在风险, 保障渭河流域水体健康可持续发展.
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