2019, Vol. 40
2. 西安华清科教产业(集团)有限公司, 西安 710043
, GAO Miao1 , WANG Ying-ying1 , YANG Yong-zhe1,2 , GANG Jia-bin2 , FU Guo-li2 , WANG Lei1
2. Xi'an Huaqing Science and Education Industry(Group) Limited Company, Xi'an 710043, China
膜生物反应器(membrane bioreactor, MBR)结合了膜过滤处理和活性污泥法, 因其占地面积小、处理效果好、污泥浓度高、剩余污泥量少的特点受到广泛关注[1, 2], 但是高浓度的污泥同时也导致严重的膜污染问题, 影响了其进一步广泛应用[3].大量微生物及其产物EPS附着在膜上, 造成膜孔堵塞[4], 逐渐在膜表面形成泥饼层, 而后导致跨膜压力(TMP)上升, 出水通量减少, 出水水质变差, 增加了膜的清洗频率, 缩短了膜寿命[5].因此, 针对膜污染问题的多种膜清洗方式的研究受到了广泛的关注[6~9].
其中以NaClO作为清洗剂的化学清洗被认为是最经济最有效的清洗方式, NaClO能有效去除膜表面的生物膜同时不影响膜组件性能[10].如果膜污染严重, 将对膜组件进行离线化学清洗.离线清洗需要将膜组件从反应器中转移到另一个盛有一定浓度NaClO溶液反应池中.近年来, 已开发出在线化学反洗方法, 不需将膜组件取出而直接从渗透侧向膜组件中注入NaClO溶液, 能有效去除凝胶层, 并能部分消除膜孔堵塞.与离线清洗相比, 在线化学反洗操作更简单、成本更低, 并且由于在恢复膜渗透性方面表现出良好的性能[11], 已在许多MBR装置中得到应用.近年来研究者开始关注NaClO清洗对MBR系统微生物群落的影响, 但是这些研究多集中在NaClO离线清洗前后膜上微生物群落变化以及离线清洗后膜的再污染等方面[12, 13], 关于在线化学反洗过程中暴露在NaClO溶液下对反应器性能的影响仍缺乏进一步地研究.此外, NaClO作为常用的消毒剂对活性污泥有一定的抑制作用[14, 15], 在线反洗过程中NaClO溶液进入膜时, 首先通过膜孔, 与膜表面的污垢发生反应.剩余有效NaClO进入生物反应器中, 倾向于氧化MBR反应器中的可溶性有机物和微生物.清洗完成后, 膜过滤重新启动, 同时又出现污垢.这表明膜和微生物在线反洗过程中, MBR都会暴露在NaClO中, 可能影响微生物的增殖和污泥絮体的形成, 因此在线NaClO反洗对系统微生物群落的综合影响亟待进一步地研究.本研究拟考察在线NaClO反洗对倒置A2O-MBR系统处理效果的影响, 并通过高通量测序对系统NaClO反洗前后, 反应器和膜上微生物种群多样性、丰富度等进行研究, 以评价NaClO溶液在线反洗对倒置A2O-MBR系统性能及系统微生物群落的综合影响, 以期为NaClO在线反洗在实际工程中的应用提供依据及参考.
1 材料与方法 1.1 实验装置本实验采用倒置A2O-MBR装置如图 1所示, 缺氧池、厌氧池和好氧池体积分别为3、3和8.5 L, DO分别控制在(0.5±0.1)、(0.1±0.1)和(2.0±0.7)mg ·L-1. MBR采用自制中空纤维膜组件, 有效膜面积0.092 m2, 出水通量约为20 L ·(m2 ·h)-1, 抽8 min停2 min.反应器由蠕动泵进水, 经膜组件抽吸出水, 通过时间继电器控制停曝时间.反应器外设有一圈保温层, 保持系统温度为(28±2)℃.
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图 1 倒置A2O-MBR系统示意 Fig. 1 Schematic diagram of the inversion A2O-MBR system |
本实验原水为模拟生活污水, 由乙酸钠提供碳源, 氯化铵提供氮源, 磷酸二氢钾提供磷源, 碳酸钠调节碱度, 并添加硫酸镁和氯化钙等提供微生物所需的营养元素.水质特征详见表 1.
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表 1 实验原水水质 Table 1 Quality of the experimental water |
反应器内污泥取自西安市某污水处理厂二沉池的回流污泥, 反应器内初始污泥浓度MLSS约为4 000 mg ·L-1.
1.3 倒置A2O-MBR的运行A2O-MBR反应器共运行52 d, 水力停留时间约9.78 h, 污泥停留时间(SRT)为30 d, 污泥回流比为150%.
本实验分3个阶段，①稳定期：不进行反洗, 运行10 d; ②在线纯水反洗阶段：单次清洗的纯水用量为反应器有效容积的3%, 为250 mL, 反洗频率1次·d-1; ③在线化学反洗阶段：NaClO溶液浓度50 mg ·L-1, pH=10, 反洗量为250 mL, 反洗频率1次·d-1.
当实验跨膜压差达到20 kPa时, 将膜组件取出进行离线化学清洗.清洗时先将膜组件浸泡在1 000 mg ·L-1的次氯酸钠溶液中2 h; 再置于0.5%的柠檬酸溶液中浸泡1 h.
1.4 分析方法 1.4.1 水质指标的检测和方法系统运行期间, 定期检测进出水水质指标.采用文献[16]中的标准方法对COD、氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮进行监测.
1.4.2 EPS提取及分析胞外聚合物(EPS)的提取采用阳离子树脂(CER)法：①将30 mL污泥混合液, 在3000 g离心力作用下, 4℃离心10 min, 弃上清液, 用缓冲液补足, 使污泥重新悬浮; 如此重复2~3次, 最后用缓冲溶液补足至原体积, 并使污泥重新悬浮; ②将活性污泥混合液转移到锥形瓶中, 加入预先用缓冲液浸湿过的CER, 进行搅拌, 搅拌强度900 r ·min-1, 4℃下搅拌4 h; ③在12000 g的离心力作用下4℃离心15 min, 取上清液过0.45 μm醋酸纤维膜, 得到EPS提取液, 在-20℃保存.
EPS中的多糖和蛋白质测定分别采用蒽酮试剂法[17]和考马斯亮蓝法[18](提取膜组件表面滤饼层EPS时, 将滤饼层污泥悬浮在200 mL纯水中, 之后提取方法同上).
1.4.3 微生物多样性的检测和方法样品采集：为研究不同阶段微生物群落结构的差异, 分别采集在线纯水反洗结束以及在线NaClO反洗结束时的反应器活性污泥及膜组件表面滤饼层污泥, 对应编号分别为A1、A2和B1、B2.
总DNA提取及PCR扩增：采用E. Z. N. A.®土壤DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U. S.)对样品DNA进行提取. PCR扩增测序区域为515F_907R.扩增引物采用16S rRNA基因V4-V5区通用引物(515F/907R), 引物名称和引物序列分别是515F 5′(GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R 5′(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′).将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, Tris_HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测.
文库构建与测序. ① Illumina PE250文库构建：利用PCR扩增进行文库模板的富集; 氢氧化钠变性, 产生单链DNA片段. ② Illumina PE250测序：DNA片段的一端与引物碱基互补, 固定在芯片上; 另一端随机与附近的另外一个引物互补, 也被固定住, 形成“桥(bridge)”; PCR扩增, 产生DNA簇; DNA扩增子线性化成为单链.
2 结果与讨论 2.1 A2O-MBR反应器运行效果分析图 2为倒置A2O-MBR反应器在稳定期, 在线纯水清洗及在线化学清洗这3个阶段运行过程中, 进出水COD的浓度以及去除率的变化情况.由图 2(a)可看出, 虽然进水COD有波动, 但3个阶段出水的COD平均浓度分别为19.0、27.0和23.6 mg ·L-1, 均符合《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)中的Ⅳ类水标准(< 30mg ·L-1), 并且3个阶段COD的平均去除率均高于90%.表明在线纯水反洗及在线化学反洗对COD的去除影响较小.此外, 图 2(b)和2(c)反映了反应器对氨氮和TN的去除情况, 3个阶段氨氮出水浓度分别是0.25、0.21和0.28 mg ·L-1, TN出水分别为0.31、0.31和0.32 mg ·L-1.不同阶段反应器对氨氮和TN的平均去除率分别高达99%和98%. A2O-MBR反应器对污染物的去除基本未受到反冲洗的影响, 出水效果较好.这可能是因为在线反洗使用NaClO溶液浓度仅为50 mg ·L-1, 并且反洗量250 mL相对于反应器体积14.5 L来说非常小, 所以对系统内微生物活性抑制不明显, 因此出水效果并未有明显变化.
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图 2 稳定期、在线纯水反洗及在线NaClO反洗阶段反应器性能 Fig. 2 System performance during the stabilization stage, on-line pure water backwashing stage, and on-line NaClO backwashing stage |
TMP的变化一定程度上可以反映膜污染的状况.膜污染最初表现为TMP缓慢增加, 逐渐上升之后又表现为突然增加. 图 3显示了3个阶段连续运行过程中TMP的变化, 每12 h记1次数据.稳定期作为对照不对膜组件进行清洗, 仅通过曝气冲刷, 待TMP达到20 kPa后对其进行离线清洗, 作为一个运行周期.之后对反应器进行在线反洗, 第10~28 d, 每天用250 mL纯水在线反冲洗膜组件; 第29~52 d, 每天用250 mL浓度50mg ·L-1的NaClO溶液对膜组件进行在线化学反冲洗.由图 3(a)可知, 在稳定期, 反应器的运行周期约为4~5.5 d, 在线纯水反洗阶段运行周期为3.5~7 d, 而在线NaClO反洗阶段运行周期缩短至1~4 d. 图 3(b)显示了不同阶段膜污染速率的变化, 稳定期膜污染速率整体较小, 平均膜污染速率为0.16 kPa ·h-1.在线纯水反洗阶段整体的膜污染速率和稳定期相差无几, 平均膜污染速率为0.12 kPa ·h-1.在线NaClO反洗阶段膜污染速率最大, 平均膜污染速率为0.29kPa ·h-1.在线水洗阶段的对膜污染的抑制作用不明显, 但是在线NaClO反洗阶段却表现出更高的膜污染率, 几乎是不反洗和纯水反洗的2倍.这与Cai等[19]的研究结果一致, 他们发现在使用20mg ·L-1的NaClO在线反洗时膜表面的污染速度比纯水在线反洗时快近2倍, 并且在NaClO浓度增大时污染率逐渐增加. Wang等[10]的研究发现, 使用低浓度的NaClO溶液在线反洗对去除膜污染几乎没有不利影响, 以0.2mg ·L-1NaClO溶液反洗可以有效地实现对MBR膜污染的控制.所以, NaClO作为一种常用的膜在线化学清洗剂, 高浓度使用时对MBR系统微生物和膜生物污染的处理具有一定的负面影响.事实上, 用NaClO进行MBR膜污染的在线化学清洗应该被视为具有两面性, NaClO既有助于清除膜污染, 同时也可能加速膜污染率.
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图 3 稳定期、在线纯水反洗及在线NaClO反洗阶段TMP变化情况 Fig. 3 Changes in TMP during the stable stage, on-line pure water backwashing stage, and on-line NaClO backwashing stage |
EPS是导致膜污染的主要物质, 是影响膜生物反应器生物附着的重要因素[20], 其主要成分是蛋白质和多糖[21]. 图 4显示了不同反洗阶段膜组件滤饼层EPS的变化情况, EPS浓度表现出在线纯水反洗 < 稳定期 < 在线NaClO反洗的趋势.其中, 稳定期结束时滤饼层污泥中的蛋白质含量为(9.8±0.3)mg ·L-1, 经在线纯水反洗后减少了80.8%, 再经NaClO在线反洗后略有增加达到(3.6±1.1)mg ·L-1.而稳定期滤饼层污泥的多糖浓度为(5.4±0.2)mg ·L-1, 经纯水在线反洗后为(6.7±1.0)mg ·L-1, 经NaClO在线反洗后增加至(17.7±2.6)mg ·L-1.由于多糖可以促进细胞的黏附, EPS内较高的多糖浓度会增强滤饼层污泥与膜组件之间的物理连接作用和结构强度[22], 增加了EPS在膜表面的黏附性.这种黏附性最终也导致了TMP变化速率的增加, 加剧了膜污染.
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图 4 稳定期、在线纯水清洗及在线NaClO反洗后滤饼层EPS浓度 Fig. 4 EPS concentrations in the cake layer after the stable period, on-line pure water cleaning, and on-line NaClO backwashing |
利用16S rRNA基因的Illumina PE250高通量测序对稳定期、在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段的好氧池污泥以及滤饼层污泥进行微生物群落分析, 以评价NaClO反洗对反应器及滤饼层污泥微生物群落结构的影响.
微生物多样性分析可以说明NaClO对微生物群落的影响.多样性指数包括Chao指数、Simpson指数和Shannon指数. Chao指数是用Chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数, Chao数值越大, 种群丰富度越高. Simpson指数和Shannon指数可以估算微生物种群多样性, Simpson数值越大, 说明种群多样性越低, 而Shannon数值越大, 种群多样性越高, 优势微生物的占比越大[23].物种覆盖率指各文本库的覆盖率, 值越高, 样本中序列被测出的可能性越大.本次测序的4个样品物种覆盖率均在99%以上, 所以能代表样本中微生物的真实情况.
如表 2所示, 好氧池污泥的Chao指数为A1>A2, A1和A2的Shannon指数和Simpson指数几乎相同, 表明经过在线NaClO反洗后, 好氧池的微生物的种群丰度降低, 多样性略有降低但不明显, 优势种群占微生物总量的比重略微升高.在线NaClO反洗前后好氧池污泥的Chao指数、Simpson指数及Shannon指数的波动变化均很小, 说明NaClO反洗对好氧池污泥微生物种群数量及多样性的影响很小.由于好氧池容积8.5 L, 而反洗量仅为0.25 L, 所以进入到好氧池的NaClO浓度相当低.而滤饼层污泥的Chao指数表现为B1 < B2, 种群丰度略微升高, 但是Simpson指数B1 < B2, Shannon指数B1>B2, 微生物的种群多样性明显降低.并且经在线NaClO反洗后的滤饼层污泥相对于各阶段好氧池污泥, 表现出最低的种群多样性.一般来说, 在NaClO反应过程中消除膜附着的细菌细胞对细菌的数量是有负面影响的.经在线NaClO反洗后的滤饼层污泥微生物种群丰度增加的情况可能是由于NaClO洗涤不能彻底清除膜孔内的大量微生物, 并且这种清洗方法仅对某些优势及敏感的微生物种群的数量有影响, 对于非优势种群的变化影响较小. Navarro等[13]通过高分辨率的系统发育分析发现, NaClO清洗后的膜上残留许多表现出耐盐性的OTU以及一些与嗜热和耐酸菌株相关的OTU, 并且经NaClO洗涤过的回用膜的分析也表明, 在膜污染的早期阶段存在大量的耐盐的OTU.这种化学耐受性可能对NaClO清洗后存活细菌数量的增加有贡献.
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表 2 对稳定期、在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段好氧池及滤饼层污泥微生物多样性分析 Table 2 Microbial diversity of the sludge from the aerobic tank and the cake layer during stable period, on-line pure water backwashing stage, and on-line NaClO backwashing stage |
2.3.2 门水平微生物种群分析
图 5显示了在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段结束时, 好氧池污泥以及滤饼层污泥中门水平主要的微生物种群组成, 均表现出较高的多样性. 4个污泥样品的微生物种群主要以变形菌门(Proteobacteria)为主, 相对丰度分别为75.8%, 72.5%、53.4%和77.9%, 其次是拟杆菌门(Bacteroidetes), 与赵诗惠等[24]研究的结果相似.这两类细菌在MBR膜污染中的作用已有报道[25].此外还检测出了少量的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和浮霉菌门(Planctomycetes).经在线NaClO反洗后, 好氧池污泥的种群组成变化不大.变形菌门和拟杆菌门种群相对丰度变化很小, 拟杆菌门和酸杆菌门(Acidobacteria)略有增加.滤饼层污泥的种群组成变化明显, 变形菌门从53.4%增加到77.8%, 而拟杆菌门从33.4%减少至14.5%, 绿弯菌门(Chloroflexi)也从2.9%减少到0.9%, 绿菌门(Chlorobi)从2.2%减少到0.8%.这些结果表明, 变形菌门对NaClO的敏感性较低, 意味着NaClO并不能很好地去除变形菌门, 有报道通过对饮用水的消毒过程中微生物的检测, 证实变形菌门对氯消毒剂有一定抵抗性[26].并且对不同阶段TMP变化情况以及EPS的分析也发现, NaClO在线反洗阶段的膜污染速率最高, 滤饼层的EPS浓度最大, 变形菌门对NaClO的抵抗性可能是该阶段膜污染加剧的重要原因.
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图 5 稳定期、在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段的好氧池污泥以及滤饼层污泥中门水平主要的微生物种群 Fig. 5 Main microbial populations at the phylum level in aerobic tank sludge and cake layer sludge during the stabilization stage, on-line pure water backwashing stage, and on-line NaClO backwashing stage |
为进一步探究倒置A2O-MBR反应器在线NaClO反洗前后微生物种群的变化情况, 对4个样品科水平的功能微生物及优势菌群进行分析.如图 6所示, 在科分类水平上, 在线NaClO反洗前后好氧池污泥中的优势菌科完全不同.在线NaClO反洗前好氧池污泥优势菌为红藻科(Rhodocyclaceae)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)和丛枝假丝酵母菌科(Candidatus Accumulibacter), 分别达到11.55%、10.54和7.29%.而经在线NaClO反洗后好氧池污泥优势菌属为固氮螺菌属(Azospira), 占比15.17%.原先的优势菌属红藻科减少为3.22%.在线NaClO反洗前滤饼层污泥优势菌属为腐生菌科(Saprospiraceae)和噬纤维菌科(Cytophagaceae), 占比分别为8.55%、6.83%.在线NaClO反洗后滤饼层优势菌属为固氮螺菌属和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae, 属于β-变形杆菌纲), 分别占18.15%、8.54%.从图 6可以发现, 经在线NaClO反洗后, 好氧池和滤饼层在科水平微生物群落分布上十分相似, 相比反洗前, 固氮螺菌科、丛毛单胞菌科等明显增加.固氮螺菌科是革兰氏阴性菌, 无孢子形成, 直或曲杆, 具单极鞭毛, 菌株能够固定氮.而丛毛单胞菌科被证明能加剧膜污染物的产生和积累[27].
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图 6 稳定期、在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段的好氧池污泥以及在线纯水反洗和在线NaClO反洗阶段的滤饼层污泥中科水平主要的微生物种群 Fig. 6 Main microbial populations in the aerobic tank sludge and cake layer sludge during stabilization stage, on-line pure water backwashing stage, and on-line NaClO backwashing stage |
此外, 在表 3列举的在线NaClO反洗前后滤饼层污泥中丰度最大的前10种微生物中, 包括5个丰富的OTU与已知的耐盐细菌密切相关.丛毛单胞菌(Comamonadaceae_Unclassified)和发硫菌(Thiothrix_uncultured Thiothrix sp.)增长倍数高达319倍和301.3倍, 这些能够耐受NaClO处理的微生物种可能是加剧膜污染的主要原因.
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表 3 在线NaClO反洗前后滤饼层污泥微生物丰度前10的OTU Table 3 OTU of the ten most abundant microbes in cake layer sludge before and after on-line NaClO backwashing |
3 结论
(1) 稳定期、在线纯水反洗及在线NaClO反洗阶段反应器出水的COD、氨氮、TN浓度相似, 在线反洗对反应器的运行效果影响很小.
(2) 对TMP和滤饼层EPS的监测表明, 在线纯水反洗后平均膜污染速率较稳定期有所降低, TMP变化周期延长, 而在线NaClO反洗后表现出最高的膜污染速率和最高的EPS浓度, 膜表面污染层结构黏附性较大, 加剧了膜污染.
(3) Chao指数、Simpson指数和Shannon指数结果表明, 在线NaClO反洗前后好氧池污泥的微生物多样性变化很小, 而经在线NaClO反洗后, 滤饼层污泥的种群丰度略微升高, 微生物的种群多样性明显降低.
(4) 好氧池和滤饼层污泥的微生物种群主要以变形菌门(Proteobacteria)为主, 其次是拟杆菌门(Bacteroidetes).经在线NaClO反洗后, 好氧池污泥的变形菌门和拟杆菌门种群相对丰度变化很小, 而滤饼层污泥的种群组成变化明显, 尤其是对氯消毒剂有一定抵抗性的变形菌门从53.4%增加到77.8%, 而拟杆菌门从33.4%减少至14.5%.
(5) 经在线NaClO反洗后, 好氧池和滤饼层在科水平微生物群落分布上十分相似, 相比反洗前, 固氮螺菌属、丛毛单胞菌属等明显增加.那些能够耐受NaClO处理的微生物种可能是加剧膜污染的主要原因.
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