2019, Vol. 40
2. 三峡大学三峡库区生态环境教育部工程研究中心, 宜昌 443002
2. Engineering Research Center of Eco-environment in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Three Gorges University, Yichang 443002, China
水库是人类调节和利用水资源的主要工程措施, 具有防洪、发电、航运、拦沙等综合效益, 但因水库改变了河流原来的水文过程, 会对河流水体的水温、溶解氧、营养盐等诸多环境因子产生影响[1].董世魁等[2]的研究表明, 水坝建设会促进沉积物中细颗粒和有机质质量浓度明显上升, 使沉积物组分发生改变.沉积物作为微生物附着的主要介质, 是营养物质代谢的重要场所, 以往的研究主要集中在沉积物不同类型和空间位置对细菌群落差异的比较, 这种差异受气候及地理位置影响较大[3], 其中环境因子对沉积物细菌群落多样性具有显著影响, 但对土著菌群落的影响不大[4].
目前对小湾和漫湾水库的研究主要为水环境和营养盐的分布规律, 对沉积物和微生物群落以及两者之间影响关系的研究非常少.朱春灵[5]的研究发现小湾水库夏季水位20 m以上水体温度具有明显分层, 营养盐时空分布季节差异明显.李晋鹏等[6]的研究发现, 水坝运行对漫湾库区底栖动物优势组成由群落寡毛纲向昆虫纲发生了转变.本研究选取两种不同水温分层下的水库, 通过对采样点沉积物的分层监测和调查, 揭示澜沧江干流小湾和漫湾水库建库后沉积物微生物群落结构分布特征, 结合间隙水营养盐实测数据分析两者之间的内在联系, 并探讨不同分层水库沉积物生化特征及差异, 以期为日后水库监测和管理提供参考.
1 材料与方法 1.1 研究区域与样点设置于2018年1月在澜沧江流域小湾和漫湾水库进行样品采集, 采样点位置如图 1所示.小湾水库位于中国云南临沧市与大理白族自治州、保山市交界处, 水坝建于2002年, 2010年投入使用, 上游至功果桥水坝, 下游至漫湾水坝, 系澜沧江中下游河段规划8个梯级中的第二级, 是澜沧江中下游河段的“龙头水库”, 水库正常蓄水位1 240 m, 总库容1.51×1010 m3, 有效库容9.895×109 m3, 正常蓄水时水库面积189.1 km2, 为多年调节水库.漫湾水坝位于中国云南省西部云县和景东县交界处的漫湾河口下游1 km的澜沧江中游河段上, 建于1986年, 2007年投入使用, 上游至小湾水坝, 下游至大朝山水坝, 系澜沧江中下游八个梯级水电开发中的第三级, 为径流式水坝, 水库正常蓄水位994 m, 总库容9.2×109 m3, 有效库容2.57×108 m3, 水库面积23.9 km2, 为季调节水库.相比之下, 小湾水库具有面积大, 容量大等特征, 是澜沧江流域梯级水库中典型的大型水库.
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图 1 采样点示意 Fig. 1 Map of the sampling sites |
现场采用TSI-EXO多参数水质分析仪(USA)测定库区水体垂向温度(WT)和溶解氧(DO), 并采用中国水利水电科学研究院水环境研究所研发的柱状采泥器(φ60 mm×1000 mm)采集库区沉积物和上覆水样品.沉积物上方0~5 cm水体作为上覆水样品, 并使用注射器吸取装入50 mL聚乙烯瓶.剩余沉积物按照0~2、2~5、5~10和10~15 cm进行分层(图 2), 装入干净聚乙烯自封袋, 并采用中科院南京土壤研究所研发的QX-6530便携式氧化还原电位仪测得分层沉积物氧化还原电位(ORP).
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图 2 沉积物分层示意 Fig. 2 Sediment stratification diagram |
采样结束后, 于当晚对样品进行预处理.采用TDZ5-WS台式多管架自动平衡离心机, 对沉积物以3 500 r·min-1离心10 min, 分离间隙水装入50 mL聚乙烯采样瓶, 剩余沉积物保存待用; 上覆水经3 500 r·min-1离心10 min后, 取上清液装入300 mL聚乙烯瓶.所有样品使用干冰低温保存带回实验室.
上覆水和间隙水中总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、总磷(TP)和正磷酸盐(PO43--P)的质量浓度, 采用文献[7]的方法测定, 沉积物总有机碳(TOC)质量比采用燃烧氧化-非分散红外吸收法[8]测定.
1.3 DNA提取与测序使用E. Z. N. A. Soil DNA试剂盒(Omega, USA), 按照试剂盒说明书对沉积物进行总DNA提取, 1%的琼脂糖电泳检测DNA是否有降解和杂质.采用细菌引物序列CCTACGGGNGGCWGCAG和GACTACHVGGG TATCTAATC对16S rRNA基因中V3~V4区片段进行PCR扩增, 条件：95℃预变性3 min, 然后进行95℃变性30 s, 45℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共5个循环, 接着进行95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共20个循环, 最后72℃延伸5 min, 结束后以2%的琼脂糖电泳检测PCR产物.委托生工生物工程(上海)股份有限公司于Illumina MiSeq平台进行高通量测序分析, 使用Mothurd对原始序列校正以获得优化序列, 并在Qiime中运用Uclust方法对优化序列进行相似度为0.97的聚类, 以最长序列作为代表序列, 最后Qiime中运用Blast方法进行数据库比对, 获得OTU代表序列分类学信息.
1.4 数据统计与分析使用SPSS 13.0软件, 对不同库区间隙水理化指标采用t-test进行显著性差异分析; 使用R语言和Mothur软件, 对细菌群落多样性指标进行统计分析; 使用Cannoco 4.5软件, 进行细菌群落结构与环境因子的冗余分析(redundancy, RDA); 功能细菌的筛选统计, 则是基于大量文献的整理归纳与本文RDA结果分析相结合的方式获得.
2 结果与分析 2.1 沉积物间隙水营养盐垂向分布特征图 3所示, 小湾和漫湾的间隙水TN平均质量浓度分别为4.805mg·L-1和5.590mg·L-1, 表层均为最高(7.019 mg·L-1和8.609 mg·L-1), 且随深度增加具有减小趋势; NH4+-N平均质量浓度分别为2.233 mg·L-1和2.569 mg·L-1, 除漫湾表层较大以外, 其余均表现随深度增加而增大趋势, NO3--N平均质量浓度分别只有0.030 mg·L-1和0.016 mg·L-1, 深层均为最低(0.025 mg·L-1和0.010 mg·L-1).
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图 3 分层沉积物理化因子分布状况 Fig. 3 Distribution of physicochemical factors in the stratified sediments |
间隙水的TP平均质量浓度分别为0.044 mg·L-1和0.074 mg·L-1, 均随深度增加具有减小趋势, 中层以下变化逐渐趋于平缓. PO43--P受TP分布的影响具有相似的分布规律, 表层均为最大(0.034 mg·L-1和0.079 mg·L-1), 垂向变化幅度平缓并表现垂向向下减小趋势.
小湾沉积物TOC质量比范围为19.500~24.000 g·kg-1, 平均值22.600 g·kg-1, 表现垂向向下递减趋势; 漫湾为2.300~2.500 g·kg-1, 平均值2.410 g·kg-1, 垂向变化趋势不显著.
对不同水库间隙水营养盐采用t-test进行显著性差异分析(表 1), 除了库区间NO3--N存在极显著性差异外(P＜0.01), 其余均没有显著性差异.
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表 1 不同库区营养盐差异性分析 Table 1 Analysis of nutrient differences in different reservoir areas |
2.2 沉积物微生物优势群落垂向分布
沉积物细菌α多样性指数如图 4.本文主要分析Simpson、Shannon和Ace指数, 其中Simpson指数越小说明群落均匀度越高, Shannon指数越大说明群落多样性越高, Ace指数越大说明群落丰度越高.小湾和漫湾沉积物垂向上Simpson指数和Shannon指数变化趋势均相同, 说明在库区垂向上, 群落均匀度和多样性先增大后减小再增大的垂向趋势特征, 而Ace指数变化趋势相反.库区比较来看, 漫湾沉积物细菌群落多样性、群落均匀度和群落丰度整体高于小湾.
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图 4 沉积物细菌α多样性指数 Fig. 4 Bacterial α diversity index in the sediments |
小湾水库沉积物细菌群落检测出42门, 413属, 漫湾检测出43门, 435属, 且具有相同的优势菌门(至少一层相对丰度＞10%)及优势菌纲组成(图 5).其中变形菌门(Proteobacteria)主要以α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)和δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)为主; 浮霉菌门(Planctomycetes)大部分以浮霉菌纲(Planctomycetacia)为主; 疣微菌门(Verrucomicrobia)以疣微菌纲(Verrucomicrobiae)和Spartobacteria为主; 厚壁菌门(Firmicutes)以梭菌纲(Clostridia)为主; 酸杆菌门(Acidobacteria)中以Acidobacteria_Gp6和Acidobacteria_Gp16为主; 绿弯菌门(Chloroflexi)以厌氧绳菌纲(Anaerolineae)为主.进一步在属水平分析, 图 6列出了相对丰度排名前20的菌属, 小湾和漫湾沉积物优势种属(至少一层相对丰度＞2%)相同, 均为Clostridium sensu stricto、Thermogutta、Gp6、黄杆菌属(Luteolibacter)、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、孢子丝菌属(Sporacetigenium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Gp16.
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图 5 优势菌门群落结构及分布 Fig. 5 Community structure and distribution of the dominant species at the class level |
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图 6 细菌群落属水平群落结构及分布 Fig. 6 Community structure and distribution of species at the genus level |
进一步对沉积物在属级别进行功能菌属的统计分析(表 2), 发现23种具有降解有机物和脱氮除磷功能的细菌, 且大部分细菌在库区间和垂向上表现一定的相对丰度差异.
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表 2 沉积物功能菌垂向分布 Table 2 Vertical distribution of functional bacteria in sediments |
根据库区优势菌属和功能菌与环境因子RDA分析(图 7), 小湾沉积物中, 微小杆菌属(Exiguobacterium)、Defluviimonas、芽殖杆菌属(Gemmobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红细菌属(Rhodobacter)、小梨形菌属(Pirellula)、出芽菌属(Gemmata)、不动细菌属(Acinetobacter)和Candidatus Brocadia与TN、TP、PO43--P、TOC有较好的正相关性, 而与NH4+-N和NO3--N呈负相关; 漫湾中, 微小杆菌属(Exiguobacterium)、Defluviimonas、芽殖杆菌属(Gemmobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红细菌属(Rhodobacter)、小梨形菌属(Pirellula)、出芽菌属(Gemmata)、Steroidobacter、脱氮单胞菌属(Dechloromonas)和热单胞菌属(Thermomonas)与TN、NO3--N、TP、PO43--P有较好的正相关性, 而与TOC呈负相关.
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图 7 部分菌属与环境因子的RDA分析 Fig. 7 RDA analysis of environmental factors and part of bacteria |
沉积物中发挥着复杂的硝化反硝化作用, 溶解氧水平降低对异养硝化菌生长具有抑制作用, 通过这种对脱氮功能菌落数量的影响, 进而影响环境脱氮效率[34].沉积物相比水体处于厌氧环境, 固氮功能藻类等生物较少, 且底栖藻类的光合作用也只对表层1 mm沉积物营养盐产生显著影响[35].国外有关沉积物-水界面溶解氧交换模式研究发现, 这种溶解氧交换过程主要存在于沉积物厘米以下甚至更小的尺度范围内[图 8(a)], 因此沉积物中硝化和反硝化过程在时空上是紧密结合的[36].受热分层影响后的不同水体中, 其上覆水溶解氧受到影响表现不同的质量浓度, 但这种溶解氧的差异只对表面浅层沉积物有较大的影响.
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图 8 沉积物溶解氧补给模式及水库环境因子垂向分布特征 Fig. 8 Dissolved oxygen exchange model in sediments and distribution of environmental factors in sediments |
图 8(b)所示, 小湾水库最大水深193 m, 表底温差较大(3.3℃), 斜温层(43~93 m)温度变化剧烈, 最大水温垂向梯度0.2℃·m-1, 具有明显的水温分层; 漫湾水库最大水深只有40 m, 表底温差较小(0.1℃), 水温近似均匀分布, 是典型的混合水体.受水温分层影响, 小湾水库表底水体溶解氧差异较大, 底层溶解氧最低为4.3 mg·L-1, 而漫湾则差异较小, 底层质量浓度最低为7.4 mg·L-1.沉积物上覆水溶解氧数据以多参数水质分析仪测得底层水体溶解氧值为准, 从不同水库来看, 受水温分层影响下沉积物上覆水溶解氧差异较大, 漫湾明显高于小湾.
ORP用来表征介质氧化性或还原性的相对程度, 小湾沉积物ORP变化范围130~148 mV, 平均值136 mV, 其中表层ORP最大, 表层以下随深度增加逐渐减小; 漫湾变化范围99~142 mV, 平均值114 mV, 同样表层以下逐渐减小, 中层变化幅度较缓.小湾、漫湾沉积物表层ORP值差异较小, 说明其受上覆水溶解氧差异影响较小.通过以上分析可以看出, 水温分层对小湾、漫湾沉积物上覆水溶解氧影响较大, 但对沉积物并无显著影响.
3.2 水库沉积物间隙水营养盐垂向分布与微生物群落的关系通过16S rRNA基因Illumina MiSeq高通量测序结果来看, 小湾、漫湾沉积物具有相同的优势菌门和优势菌属, 其中优势菌门占据细菌群落总数77%, 优势菌属占据细菌群落总数34%, 其余为大量稀有或未识别种类, 这符合人们对微生物中少数常见菌占比高大量稀有菌占比少的分布模式认识[37].
从TN来看(图 3), 不同库区沉积物表层均最大, 这可能是受到外源氮污染物的沉积和微生物的矿化分解作用所致[38].从微生物角度来看, 厌氧氨氧化菌表层丰度较高但底层较低, 反硝化菌丰度表层较低但底层较高, 两者总量在垂向上并没有较大变化.而大分子有机物降解功能菌在表层表现较高丰度, 对其进行具体分析, 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在不同库区间丰度均最大, 为共同的优势菌属, 且垂向方向向下丰度递减, 与TN垂向质量浓度变化趋势相似, 且与ORP表征的垂向氧化性减弱趋势一致.据研究表明, 鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)生命力强耐受贫营养, 对多环芳烃等高分子有机物有良好的降解作用, 并且广泛存在于自然界[39], 推测在小湾、漫湾库区沉积物中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是主要发挥大分子有机物降解功能的细菌属(图 9), 这和RDA分析结果中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)与TN具有很好的正相关关系一致.
NH4+-N与TN垂向分布特征相反, 影响其垂向分布的微生物过程包括氨化作用、硝化作用、厌氧氨氧化作用.
其中氨化作用是指好氧条件下含氮有机物分解为氨氮的微生物过程, 如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和微小杆菌属(Exiguobacterium)都发现氨化功能存在. RDA分析中, 这些功能菌与氨氮相关性较差, 但这并不足以否定这些菌属的氨化作用, 分析可能是由于这些功能菌在沉积物中同时发挥着其他复杂的生物化学作用所致[14, 16~18, 20~22].
另外硝化作用包括氨氧化作用和亚硝酸盐氧化作用两部分组成, 氨氧化作用作为硝化反应的限速步骤, 主要由氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)驱动完成[40], 实际检测结果中, 绝大多数以AOB为主, 如亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌(Nitrosomonas).亚硝酸盐氧化功能菌, 如硝化螺旋菌属(Nitrospira)、Nitrolancea和硝化杆菌属(Nitrobacter), 这些与氨氧化菌共同参与完成整个硝化过程.其他如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)同样也是已知的硝化菌属[20~22, 41, 42].从各自丰度及RDA结果来看, 小湾库区中, 只有芽孢杆菌属(Bacillus)和不动杆菌属(Acinetobacter)在表、中层具有较高丰度, 垂向上均表现减小趋势, 且与NH4+-N有较好的负相关性.漫湾库区中只有芽孢杆菌属(Bacillus)在硝化菌中有较高丰度, 垂向上均表现减小趋势, 且与NH4+-N有较好的负相关性.推测小湾沉积物主要硝化菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)和不动杆菌属(Acinetobacter), 漫湾库区沉积物主要硝化菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)(图 9).
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曲线表示功能菌属垂向分布趋势(小湾和漫湾趋势相似, 以小湾和漫湾平均值为参考); 圆点表示优势菌属分布库区及主要垂向分布位置 图 9 沉积物功能菌垂向分布示意 Fig. 9 Vertical distribution of functional bacteria in sediments |
其次厌氧氨氧化有别于传统硝化-反硝化, 虽然对其认识较晚, 但对脱氮过程具有重要意义, 至今发现的厌氧氨氧化菌均属于浮霉状菌门(Planctomycetes)[43].本次检测结果中小梨形菌属(Pirellula)、出芽菌属(Gemmata)、Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia是常见的厌氧氨氧化菌属[13].其中小梨形菌属(Pirellula)和出芽菌属(Gemmata)在小湾、漫湾沉积物中丰度较高, 垂向上表层均具有最高丰度, 是主要厌氧氨氧化菌(图 9).
以上这些被发现的优势氨化菌、硝化菌和厌氧氨氧化菌丰度均表层较高而底层较低, 这与ORP表征的垂向还原性增强趋势一致, 表层ORP较高氧化性较强, 使得硝化作用更好进行, 促使NH4+-N降低, 表层以下ORP较低还原性较强, 且垂向上逐渐增大, 氨化作用、硝化作用受到抑制, NH4+-N发生累积效应且逐渐增加[44], 这和董慧等[45]的研究结果较为一致.
NO3--N垂向深层均表现质量浓度最低, 这和深层较强反硝化作用有关, 而反硝化作用受溶解氧、硝态氮、有机物质量浓度和pH等因素间接影响[46~48], 但最终归因于微生物群落差异.从功能群落分析来看, 反硝化功能菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、Clostridium sensu stricto、Ornatilinea、芽殖杆菌属(Gemmobacter)、长绳菌属(Longilinea)、Defluviimonas、微小杆菌属(Exiguobacterium)、Steroidobacter、陶厄氏菌属(Thauera)、热单胞菌属(Thermomonas)和硫杆菌属(Thiobacillus)[16~18, 30~32, 49, 50].对芽孢杆菌属(Bacillus)的研究发现, 它是厚壁菌门(Firmicutes)中功能较为复杂的一类菌属, 能够与大多数具有反硝化功能的厌氧绳菌纲(Anaerolineaceae)、变形菌纲(Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)和浮酶状菌纲(Planctomycetacia)等稳定共存, 同时还会促进其他反硝化菌的生长, 并且Ornatilinea、芽殖杆菌属(Gemmobacter)、长绳菌属(Longilinea)、Defluviimonas和微小杆菌属(Exiguobacterium)的协同作用会使芽孢杆菌属(Bacillus)反硝化能力有显著的提高[16, 17].值得注意的是, 假单胞菌属(Pseudomonas)、红细菌属(Rhodobacter)和脱氮单胞菌属(Dechloromonas)相比传统厌氧反硝化不同, 是一类具有好氧反硝化功能的菌属, 大多数菌种能够在溶解氧较高的环境下同时具有硝化、反硝化、降解有机物多种功能[22, 25], 在沉积物表、中层存在较高的丰度可以得到印证, 但受表、中层较强硝化作用影响, 表、中层NO3--N并未受较大影响.由RDA分析结果可知, Ornatilinea、假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)具有相对较高垂向丰度, 与NO3--N具有较好的负相关性, 推测可能是小湾沉积物主要的反硝化菌, 而漫湾中, Ornatilinea、假单胞菌属(Pseudomonas)和长绳菌属(Longilinea)可能是主要的反硝化菌(图 9).
库区比较来看, 小湾沉积物ORP整体较高, 反硝化菌总数较低, NO3--N平均质量浓度0.030 mg·L-1, 而漫湾沉积物ORP较低, 反硝化菌总数较高, NO3--N平均质量浓度仅0.016 mg·L-1, 这与显著性差异分析结果(小湾、漫湾沉积物间隙水NO3--N具有极显著性差异关系)一致, 而大部分优势反硝化菌属与TOC呈正相关性, 说明小湾、漫湾沉积物反硝化菌数量差异受沉积物TOC影响较大.
沉积物中磷主要以铁铝结合态磷(Fe/Al-P)、钙结合态磷(Ca-P)、无机磷(IP)和有机磷(OP)几种形态存在[51]. Fe/Al-P和OP是对水体富营养化具有较大影响的磷形态, 其中Fe/Al-P在相对还原条件下, Fe3+易被还原为Fe2+, 同时伴随磷酸根离子的释放, 部分OP在微生物的降解作用下易被分解利用, 且两种不同形态的有效磷来源均受人类活动影响较大, 被认为是沉积物中的可释放磷[52, 53].
不同库区沉积物TP和PO43--P均表现表层最高且垂向向下减小趋势, 中层以下质量浓度变化趋于平缓, 可能由于沉积物的累积效应造成了表层TP明显高于其他层[54], 表层以下ORP有明显的降低, 还原性相对增强, Fe/Al-P易被分解并释放磷酸根离子, 但受TP质量浓度的减小, 垂向上TP和PO43--P整体质量浓度均表现垂向向下减小趋势.微生物中微小杆菌属(Exiguobacterium)是一类革兰氏阳性、兼性厌氧菌, 分布广泛, 多数具有嗜极性, 具有较强的降解机污染物及溶磷能力[28, 29], 不同库区中均与PO43--P具有很好的正相关关系, 主要分布在小湾、漫湾沉积物表、中层(图 9).而不同库区比较下, 漫湾沉积物中磷明显高于小湾, 但溶磷菌丰度差异较小, 分析可能是由于漫湾建库时间长, 底泥沉降更久所致, 以及附近人类活动干扰等因素影响.
4 结论(1) 小湾、漫湾是两种不同水温分层的水库, 其中小湾水库表底温差3.3℃, 最大温度梯度为0.2℃·m-1, 属于分层水体, 漫湾水库表底温差0.1℃, 属于混合水体.
(2) 小湾水库沉积物间隙水NH4+-N和NO3--N平均质量浓度分别为2.233 mg·L-1和0.030 mg·L-1, 漫湾水库分别为2.569 mg·L-1和0.016 mg·L-1, NH4+-N在间隙水中均表现垂向向下增大的趋势, 而NO3--N垂向变化不明显但均在深层最底.
(3) 小湾与漫湾水库沉积物细菌群落结构具有相同的优势菌门、纲、属, 水库水体分层差异对沉积物营养盐及微生物垂向分布无显著影响.其中, 漫湾相比小湾沉积物反硝化菌更丰富, 小湾硝化菌和厌氧氨氧化菌相比漫湾更为丰富, 同一库区沉积物底层反硝化菌丰度表现较高, 有机物降解菌、硝化菌、厌氧氨氧化菌和溶磷菌丰度表现较低, 是造成沉积物营养盐库间差异和垂向差异的原因.
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