2018, Vol. 39
2. 中国科学院南京地理与湖泊研究所, 南京 210008;
3. 苏州科技大学化学生物与材料工程学院, 苏州 215009
2. Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
3. School of Chemistry, Biology and Materials Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
壬基酚(nonylphenol, NP)属于典型的酚类内分泌干扰物, 是壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)较为稳定的降解产物之一, 后者是目前全球广泛应用的一类非离子表面活性剂[1, 2].大量NPEOs通过生活与工业废水的排放、污泥处置、农田灌溉和施肥进入到环境中, 经过微生物降解, 生成了比母体毒性更大、疏水性更强、更难生物降解的NP[3, 4].
有研究表明, NP极易通过污水灌溉或污泥农用的形式进入环境, 一些发达国家污水处理厂中的活性污泥NP最高可达到1100 mg·kg-1[5].镉(Cd)作为工业生产中最为广泛使用的重金属类物质极易进入环境, 与NP形成复合污染[6, 7].Zhou等[8]在德国的5条河流中均检测到NP的存在, 同时在该区域内的饮用水中Cd的含量达到了30 μg·L-1.刘清云等[9]对珠三角地区典型城市13家污水处理厂污泥中NP的调查结果显示, NP含量范围在0.45~65.17 mg·kg-1之间.该研究还检测出该13家污水处理厂污泥样中Cd的几何平均值为2.72 mg·kg-1.植物修复通过植物提取吸收、转化分解等方式去除环境中的污染物.近些年, 已有学者开始了植物修复环境中复合污染的研究[10, 11].然而, 关于该类研究目前主要集中于多环芳烃等持久性有机污染物与重金属的复合污染控制方面[12, 13], 对NP与重金属复合污染的研究报道则较少.因此, 开展在重金属与NP复合污染胁迫下, 植物生理响应及修复方面的研究, 对阐明植物修复复合污染的机理具有较重要意义.
本文通过水培实验, 以NP和Cd为代表污染物, 探讨黑麦草在Cd和NP复合污染下的生理生化变化以及对两种污染物的吸收和去除效果, 以期探明植物抵抗NP-Cd复合污染毒性的机制, 进而为有机物-重金属复合污染环境的修复提供一定的科学依据.
1 材料与方法 1.1 实验试剂与材料 1.1.1 实验试剂NP(纯度98%)、HPLC级甲醇购于Sigma Aldrich公司; 储备液:用色谱纯甲醇溶解, 配制成1000 mg·L-1的储备液, 4℃保存待用.Cd(NO3)2购自上海化学试剂厂, 为AR级.1000 mg·L-1Cd母液由Cd(NO3)2溶于高纯水得到.
1.1.2 供试植物宽叶型四倍体一年生黑麦草(Lolium multiflorum Lam), 品种为邦德, 其种子购自江苏四季青种业有限公司.前期实验表明, 黑麦草对Cd和NP均有较好的去除能力.
1.2 实验方法 1.2.1 黑麦草的培养黑麦草种子经10% H2O2溶液消毒20 min, 用双蒸水清洗干净后浸种2 h, 再转移至恒温培养箱中28℃下避光催芽.当幼苗达到2 cm的时候, 将幼芽移栽到半强度Hoagland营养液育苗.培育1周后待黑麦草幼苗具有完善的根系时用于实验.
1.2.2 水培实验将NP和Cd储备液按比例加入去离子水中, 振荡均匀后, 定容至300 mL于500 mL烧杯中.Cd2+与NP的最终浓度如表 1所示, 分别用N0、Nl、Nh代表NP浓度, C0、Cl、Ch代表Cd2+浓度.选择生长良好且长势一致的植株, 清洗干净根系后在去离子水中浸泡10 min, 用滤纸吸干表面水分, 取定量黑麦草放入上述烧杯中, 每个烧杯投放的黑麦草鲜重保持一致, 约5.50~5.60 g, 用定植杯固定, 保持根部充分浸入水中使根系浸于溶液中, 用锡纸包裹瓶壁使溶液和根系避光.该实验在控温控光的装置下进行, 实验过程中及时补充蒸馏水, 以维持液面高度; 定期改变各个烧杯的位置, 以排除环境位置引起的误差, 培养10 d后取样分析.
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表 1 不同处理中NP和Cd2+的浓度/mg·L-1 Table 1 Concentrations of NP and Cd2+ used in different treatments/mg·L-1 |
1.2.3 植物生理指标测定
植物叶绿素含量测定采用丙酮提取、分光光度法, 植物丙二醛(MDA)含量采用双组分分光光度法, 过氧化物酶活性和多酚氧化酶活性测定均参照卢晓丹[14]的方法.
1.2.4 NP对黑麦草吸收Cd2+的影响水培体系中Cd2+的浓度为1 mg·L-1, 向其中加入一定量的NP储备液, 使体系中NP的最终浓度分别为0、0.5、5 mg·L-1, 每间隔一定时间进行取样, 分别测定水体和植物体内Cd2+的含量.
植物对Cd的去除率=(水中Cd初始含量-水中Cd剩余含量)/水中Cd初始含量×100%
1.2.5 Cd2+对黑麦草吸收NP的影响水培体系中NP的浓度为5 mg·L-1, 向其中加入一定量的Cd2+储备液, 使体系中Cd2+的最终浓度分别为0、1、10 mg·L-1, 每间隔一定时间进行取样, 分别测定水体和植物体内NP的含量.
1.2.6 Cd的测定植物样品:测定植株中的Cd采用HNO3-HClO4(体积比4:1)法消解, 原子吸收分光光度计测定.
水样:取1 mL水样用3%的稀硝酸定容后用原子吸收分光光度法测定Cd的含量.
1.2.7 NP的测定采用超声波辅助萃取法对水体和植物中的NP进行提取.
植物样:将植物冷冻干燥处理12 h, 加入20 mL乙酸乙酯, 超声萃取2次, 移出有机相, 经旋转蒸发器40℃蒸发至干.再加入10 mL色谱级乙醇, 置于漩涡振荡器上振荡60 s, 将振荡后的溶液转移至色谱进样瓶.
水样:用5 mol·L-1的HCl调节培养液pH为2.0, 加入等体积的乙酸乙酯, 超声萃取2次, 移出有机相, 过无水硫酸钠脱水, 后经旋转蒸发器40℃蒸发至干.再加入10 mL色谱级乙醇, 置于漩涡振荡器上振荡60 s, 将振荡后的溶液转移至色谱进样瓶.
样品采用GC-MS检测, 色谱和质谱条件参照Mariusz Krupinski的方法[15], 由于样品浓度较低, 进样时不进行分流处理.
1.3 数据分析用Spss 13.0软件对数据进行统计分析, 结果用平均值±标准差(Means±SD)表示.
2 结果与讨论 2.1 污染物胁迫对黑麦草生物量的影响水培10 d后, 不同处理条件下黑麦草地上部分(茎叶)、地下部分(根)和完整植株的鲜重变化情况如图 1所示.黑麦草地上部分和地下部分的鲜重变化趋势一致.单一Cd2+污染情况下, 低浓度Cd2+(1 mg·L-1)对黑麦草的生物量无显著性影响(P>0.05), 而高浓度Cd2+(10 mg·L-1)对黑麦草的生长有极显著的抑制作用(P < 0.01), 10 d后黑麦草茎叶和根的生物量分别下降19.3%和33.5%, Cd2+对黑麦草根部的影响大于茎叶.在高含量Cd2+胁迫下, 黑麦草植株叶片与对照相比均未出现萎蔫变黄迹象.秦丽等[16]研究了Cd对超累积植物续断菊生长生理的影响, 结果表明, 10 mg·L-1 Cd2+处理下, 续断菊地上部和地下部的生物量显著降低了73%和65%, 上述实验结果表明黑麦草对Cd有较好的耐受性.单一NP污染情况下, 黑麦草的生物量随着NP加入无显著性变化, 可能原因是NP具有雌激素效应, 其对动物的影响更大[17], NP在水体中的溶解度仅为5.63 mg·L-1, 不利于植物的吸收和运输, 因此对黑麦草的生物量影响不显著.当黑麦草受到复合污染胁迫时, 高浓度NP(5 mg·L-1)的加入降低了Cd2+的抑制作用, NhCh作用下, 黑麦草茎叶和根的生物量与对照组相比仅下降了9.7%和10.8%, 可能是NP的加入缓解了Cd对黑麦草的毒害作用.有机物和重金属复合污染环境中, 两者对植物可表现协同、拮抗等作用, Zhang等[18]的研究也表明添加菲、芘可缓解Cd对灯心草的毒害作用.
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数据之间的显著性差异用Dancan检验(P < 0.05), 字母不同表示处理间有显著差异, 字母相同表示处理间无显著差异, 下同 图 1 不同处理对黑麦草生长的影响 Fig. 1 Effect of different treatments on ryegrass growth |
叶绿素含量高低将直接影响光合作用的强弱及物质合成速率的高低, 污染物能通过降低叶绿素的含量、改变叶绿体的超微结构、抑制光合作用, 造成植物生长减慢, 作物产量下降[19].不同处理条件下黑麦草叶片中的叶绿素及丙二醛(MDA)含量变化如图 2所示.单一Cd污染情况下, 低浓度Cd2+(1 mg·L-1)的存在对黑麦草的叶绿素含量有较显著的抑制作用(P < 0.05), 而高浓度Cd2+(10 mg·L-1)对黑麦草的叶绿素含量有极显著的抑制作用(P < 0.01), 10 d后总叶绿素含量下降40.1%.研究表明, 重金属的积累抑制叶绿素酸酪还原酶和影响氨基-γ-戊酮酸的合成, 从而影响叶绿素的生物合成; 同时使叶绿体膜系统在结构上受到破坏, 导致叶绿素总量下降[20].单一NP污染情况下, 黑麦草的叶绿素含量随着NP加入无显著性变化(P>0.05).当黑麦草受到复合污染胁迫时, 其叶绿素变化趋势与差异基本与单一Cd污染情况相同, 这一结果进一步说明NP的加入对植物叶绿素的影响不大.
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图 2 不同处理对黑麦草叶绿素和丙二醛含量的影响 Fig. 2 Effect of different treatments on chlorophyll and MDA in ryegrass |
MDA是植物抵抗逆境条件下的产物, 其含量往往能反映植物细胞膜过氧化程度以及植物对逆境条件反应的强弱.如图 2所示, 在单一Cd胁迫和复合污染条件下, 高浓度Cd2+(10 mg·L-1)的加入均使黑麦草MDA含量显著增加, 与N0C0相比, MDA分别增加了80.1%(N0Ch)、69.9%(NlCh)和46.8%(NhCh).相关研究表明, 重金属胁迫可诱导活性氧产生, 并使植株出现氧化损伤症状, 增加MDA含量[21].与叶绿素含量变化趋势相同, 单一NP的加入对黑麦草MDA无显著性影响, 然而复合污染条件下, 10 mg·L-1NP的加入使黑麦草MDA从0.079下降到0.065, 这一结果表明NP的加入缓解了Cd的毒性, 膜酯过氧化水平有所恢复, 膜系统的稳定性下降减缓, 植物组织和细胞所受到的伤害减弱.
2.2.2 黑麦草体内抗氧化酶活性大量研究表明, 植物体在污染物胁迫下可产生大量活性氧自由基[22, 23].植物过氧化物酶(POD)可将植物体内过氧化氢催化为氧气和水, 从而降低过氧化氢的含量, 酶的活性与植物体内过氧化氢浓度有关[24].
由图 3可知, 单一Cd污染条件下, 随着水体中Cd含量增大, 黑麦草植株中POD活性与空白(N0C0)相比均显著增大(P1 < 0.05, P2 < 0.01), 分别增大了15.1%、72.4%.结果表明, 随着Cd2+含量增大, 促使植株产生了大量的POD以抵抗Cd的胁迫作用.单一NP污染条件下, 低浓度NP的存在(0.5 mg·L-1)对植株中的POD无显著性影响(P>0.05).当NP浓度达到5 mg·L-1时, 植株中POD活性与空白相比显著增大(P < 0.01), 增幅为27.8%, 表明NP进入植物体内后, 植株产生了大量的POD.复合污染条件下, NhCh与N0C0相比, 植株POD活性显著增大(P < 0.01).相关研究表明, POD对植物的保护作用存在阈值, 当污染物超过一定浓度时, 植株的抗氧化酶系统会受到破坏, POD值会随之下降[25]. POD保护作用的阈值与污染物种类、浓度以及植物自身性质有关.本研究使用植物黑麦草在Cd 10 mg·L-1、NP 5 mg·L-1存在下未达到其POD保护阈值, 这一结果说明在该浓度下黑麦草能够通过自身调节正常生长.
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图 3 不同处理对黑麦草叶绿素和丙二醛含量的影响 Fig. 3 Effect of different treatments on POD and PPO activities in ryegrass |
多酚氧化酶(PPO)与植物的生长、抗病性、光合作用有关.图 3反映了不同污染物胁迫下黑麦草PPO的活性变化.单Cd污染条件下, PPO的变化趋势与POD相似, 随着Cd2+含量增大, 植株产生了大量的PPO.一般情况下, 植物可通过清除体内氧自由基使细胞免受伤害, 但当植物体内氧自由基过量时便引起伤害[26].单NP污染条件下, 处理10 d后, 黑麦草PPO含量无显著性变化(P>0.05).复合污染条件下, Cd2+含量为10 mg·L-1、NP含量分别为0.5 mg·L-1、5 mg·L-1时, 植株PPO活性与空白相比均显著增大(P < 0.01).随着NP含量增大, 植株中PPO活性有所下降.这一结果说明NP的加入抑制了Cd对植株的毒性, 从而减少了用以抵抗外援胁迫的PPO含量.虽然植株的过氧化物酶保护机制受到一定程度的抑制, 但其酶活性仍高于空白对照.
两种酶活性变化表明, 由于不同污染物的致毒途径不同, 导致不同的抗氧化酶对污染物胁迫的响应不同.
2.3 黑麦草对水体中污染物的去除作用 2.3.1 NP对黑麦草吸收Cd2+的影响黑麦草对Cd2+吸收量的时间变化动态如图 4(a)所示.在水溶液中Cd2+浓度为1 mg·L-1条件下, 黑麦草对Cd2+有较好的去除效果, 12 h的去除率达到了55.3%.黑麦草对Cd2+的吸收量随时间的延长而增加, 然而增加幅度却随吸收时间的延长而减弱.植物对重金属的吸收过程可以分为2个阶段:①快速吸收阶段, 此过程发生在污染物处理的初期; ②慢速吸收阶段, 此过程发生在快速吸收阶段后.黑麦草对Cd2+快速吸收阶段历时为12 h.吸收初期, NP的加入对黑麦草吸收Cd2+无显著性影响, 当吸收时间超过12 h, 根据方差分析可知, 高浓度NP对黑麦草吸收Cd有较为显著的促进作用(P < 0.05).
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图 4 NP对黑麦草吸收Cd2+的影响 Fig. 4 Removal rate of Cd2+ under different concentrations of NP by ryegrass |
如图 4(b)所示, NP浓度对黑麦草地下部分有极显著影响(P < 0.01), 但对植株地上部分仅有显著影响(P < 0.05).采用转移系数(植物地上部分污染物含量/植物地下部分污染物含量)表示植物对重金属的转运能力, 转移系数随着水体中NP浓度的增大而呈现上升趋势.复合污染情况下, 随着NP浓度增大, 植株地上部分Cd2+含量随之增多, 而地下部分Cd2+含量有所降低.上述结果说明NP的存在在一定程度上可促进黑麦草对Cd2+的蓄积和转运.一些研究也表明重金属和有机污染物的交互作用能影响植物对重金属的吸收和积累, 如芘和Zn复合污染就能促进印度芥菜对Zn的吸收[27].
2.3.2 Cd2+对黑麦草去除NP的影响植物对环境中有机物的去除分为植物吸收和降解两个过程, 黑麦草对NP去除率的时间变化动态如图 5所示.其中:
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图 5 96 h内Cd2+对黑麦草吸收和降解NP的影响 Fig. 5 Adsorption and degradation of NP under different concentrations of Cd2+ by ryegrass at 96 h |
植物对NP的吸收量=植物体内NP含量
植物对NP的降解量=水中NP初始含量-植物体内NP量-水中NP剩余含量
水环境中NP浓度为5 mg·L-1时, 黑麦草对NP的吸收效果较好, 24 h的吸收率为44.6%, 但其对NP的降解效果较差, 72 h的降解率仅为20.6%.与黑麦草吸收Cd2+的实验结论相似, NP的吸收量随时间的延长而增加, 而增加幅度随处理时间的延长而减弱.但是黑麦草对NP的快速吸收阶段历时较长, 为24 h.低浓度Cd2+的加入对黑麦草去除NP无显著性影响, 而高浓度Cd2+的加入对黑麦草去除NP有极为显著的抑制作用(P < 0.01).24 h、10 mg·L-1Cd2+存在下, NP的吸收率降低了14.1%.72 h, 黑麦草对NP的降解率下降了6.1%, 仅为14.7%.这可能是因为植物体内的一些氧化酶受到Cd的胁迫, 降低酶促生理活动影响植物新陈代谢过程, 从而抑制了植物对NP的吸收和转运.
3 结论(1) 黑麦草地上部分和地下部分的鲜重变化趋势一致.单一Cd污染情况下, 高浓度Cd2+对黑麦草的生长有显著的抑制作用.单一NP污染情况下, 黑麦草的生物量无显著性变化.当黑麦草受到复合污染胁迫时, 高浓度NP的加入降低了Cd2+的抑制作用.
(2) 单一Cd污染情况下, Cd2+对黑麦草叶绿素含量有显著的抑制作用.单一NP污染情况下, 黑麦草的叶绿素含量无显著性差异.当黑麦草受到复合污染胁迫时, 其叶绿素变化趋势与差异基本与单一Cd污染情况相同.与叶绿素含量变化不同, 高浓度Cd2+的加入使MDA含量显著增加.NP的加入缓解了Cd的毒性, 使黑麦草的MDA含量有所回落.
(3) 单一Cd污染条件下, 黑麦草中POD和PPO活性与空白相比均显著增大.单一NP污染条件下, 低浓度NP对植株的POD和PPO活性均无显著性影响.当NP浓度达到5 mg·L-1时, 植株POD活性显著升高, 而PPO活性无明显变化.复合污染条件下, 当Cd2+为10 mg·L-1, 随着NP含量增大, 植株中PPO活性有所下降.
(4) 黑麦草对1 mg·L-1Cd2+有较好的去除效果, 12 h的去除率为55.3%.Cd2+的吸收量随时间的延长而增加, 然而增加幅度随吸收时间的延长而减弱.当吸收时间超过12 h, 高浓度NP对黑麦草吸收Cd2+有较为显著的促进作用.NP对植株地下部分吸收Cd2+有极显著影响, 转移系数随着NP浓度的增大而呈现上升趋势.黑麦草对5 mg·L-1NP的吸收效果较好, 24 h的吸收率为44.6%.高浓度Cd2+对黑麦草吸收和降解NP均有极为显著的抑制作用.
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